EKSPRESI GEN FITASE PADA BEBERAPA KULTIVAR TEBU HASIL TRANSFORMASI

BAB VI EKSPRESI GEN FITASE PADA BEBERAPA KULTIVAR TEBU HASIL TRANSFORMASI

ABSTRAK Penyisipan gen fitase ke dalam tebu Saccharum officinarum L. telah dilakukan dengan menggunakan Agrobacterium tumefaciens GV 2260 pBinPI- IIEC. Selama ini belum ada informasi secara lengkap mengenai ekspresi gen fitase berupa aktivitas fitase dan pengaruhnya terhadap kadar P dan klorofil tebu. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengevaluasi ekspresi dari gen fitase pada tebu transgenik. Penelitian dilakukan secara faktorial dengan Rancangan Acak Lengkap, dengan 5 ulangan. Faktor pertama adalah 6 klon tebu yaitu: cv.Triton V1, cv. PSJT 94-41 V2, cv. PA 175 V3; cv. Triton hasil transformasi V1T, cv. PSJT 94-41 hasil transformasi V2T, dan cv. PA 175 hasil transformasi V3T. Faktor kedua adalah media dengan 5 konsentrasi fitat 0 g l -1 F 1 ,1 g l -1 F 2 , 2 g l -1 F 3 , 3 g l -1 F 4 , dan 4 g l -1 fitat F 5 . Media yang digunakan merupakan modifikasi tanpa P anorganik , tetapi diberi fitat. Data dianalisa dengan Duncan’s Multiple Range Test DMRT pada taraf 5 . Hasil penelitian menunujukkan peningkatan konsentrasi fitat dalam media akan meningkatkan P total dalam plantlet. Ekspresi berupa aktivitas fitase tebu secara signifikan meningkatkan absorbsi fosfor dan kadar klorofil tanaman. Aktivitas fitase tanaman tebu hasil transformasi meningkat 67.04-75.40 . Data juga menunjukkan beberapa kultivar yang ditransformasi memiliki peningkatan kadar P tanaman 2-29 dan total klorofil. Kata kunci: Tebu, ekspresi, gen fitase. 92 EXPRESSION OF PHYTASE GENE ON SEVERAL SUGARCANE TRANSFORMED LINES ABSTRACT Phytase gene insertion to sugarcane Saccharum officinarum L. has been done using Agrobacterium tumefaciens GV 2260 harbouring pBinPI-IIEC. However, there is no data informing the expression of phytase gene in form of phytase activity and it’s effect to phosphate and chloprophyll content in sugarcane. The aim was to evaluate phytase gene expression in putative transgenic lines of sugarcane. The study was conducted using Factorial Randomized Complete Design with 5 replicates. The first factor was six lines of sugarcane [i.e.: cv.Triton V1, cv. PSJT 94-41 V2, cv. PA 175 V3; transformed line of cv. Triton V1T, transformed line of cv. PSJT 94-41 V2T, and transformed line of cv. PA 175 V3T]. The second factor was media with 5 level of phytate concentration 0 g l -1 F 1 ,1 g l -1 F 2 , 2 g l -1 F 3 , 3 g l -1 F 4 , and 4 g l -1 phytate F 5 . The media was made without in organic-P. Data were analyzed by Duncan’s Multiple Range Test DMRT 5 . The result showed that an increase of concentration of phytate on media increased phytase activity and P total in plantlet. Expression of phytase activity in sugarcane, leading to significant improvement in phosphorus absorption and chlorophyll content. Phytase activities in plant of the transgenic sugarcane were increased 67.04-75.40 . Data showed that several transgenic varieties can increase P content in plant 2-29 and total of chlorophyll. Key words: Sugarcane, expression, phytase gene. 93 PENDAHULUAN Ada dugaan bahwa jika aktivitas fitase tanaman tebu dapat ditingkatkan, maka produktivitas tebu dapat ditingkatkan. Upaya peningkatan fitase dapat dilakukan dengan pemuliaan dengan metode teknik rekayasa genetika. Rekayasa genetika melalui penyisipan gen yang dikehendaki gen fitase ke dalam tebu, mempunyai prospek yang menjanjikan, karena gen fitase yang disisipkan ini diharapkan mampu menghasilkan enzim yang dapat mengubah P yang terikat pada asam fitat menjadi P yang dapat digunakan oleh tumbuhan. Dalam penelitian ini akan dilihat apakah fitat yang diberikan dalam media akan berpengaruh terhadap aktivitas fitase tanaman tebu. Penyisipan gen fitase telah berhasil dilakukan pada tanaman tebu dengan menggunakan Agrobacterium tumefaciens GV2260 Ananda 2004; Santosa et al. 2004 dan 2005; Wulandari 2005, Nurhasanah 2007. Namun belum ada informasi mengenai ekspresi gen fitase berupa aktivitas fitase dan pengaruhnya terhadap P dan kadar klorofil dalam tanaman tebu. Aktivitas fitase dipicu oleh kondisi kekurangan P dalam jaringan tanaman dan ketersediaan fitat dalam jaringan maupun di zona perakaran. Oleh karena itu, dalam penelitian ini dilakukan pemberian fitat yang merupakan bentuk P terikat ke media kultur tanpa P anorganik , serta melihat perbedaan ekspresi antara tebu transforman dan non transgenik. Diharapkan dengan adanya informasi tersebut, maka dapat terbuka peluang untuk mengidentifikasi klon tebu unggul dengan aktivitas fitase yang tinggi. Berdasarkan permasalahan yang dikemukakan di atas, maka penelitian ini bertujuan untuk mengkaji aktivitas fitase plantlet tebu hasil transformasi serta pengaruhnya terhadap P total jaringan dan kadar klorofil. 94 BAHAN DAN METODE Tebu transgenik yang digunakan sebagai bahan penelitian merupakan hasil sub kultur dari T0 yang sama [klon no. 17 untuk cv. Triton V1T 17 dengan plantlet berwarna kuning; klon no. 13 untuk cv. PSJT 9441 V2T 13 dengan warna plantlet hijau normal; serta klon no. 24 untuk cv. PA 175V3T 24 dengan warna plantlet hijau normal]. Hasil sub kultur T0 disebut dengan T1 Transgenik putatif sub kultur ke-1, dimana masing-masing mampu menghasilkan 20-40 plantlet per botol. Plantlet tebu yang diteliti pada penelitian ini dipilih dari klon-klon tebu transgenik yang secara penampilan terlihat vigor. Plantlet tersebut kemudian dipisahkan dan ditanam dalam media sesuai dengan perlakuan. Ruang kultur diatur dengan cahaya 2000 lux dan suhu 20 o C. Rancangan lingkungan yang digunakan Rancangan Acak Lengkap RAL dan rancangan perlakuan disusun secara faktorial. Faktor pertama adalah kultivar tebu: cv. Triton V1, cv. PSJT 94-41 V2, dan cv. PA 175 V3; Triton pBinPI- IIEC transgenik V1T; PSJT 9441 pBinPI-IIEC transgenik V2T; dan PA 175 pBinPI-IIEC transgenik V3T. Faktor ke-2 adalah modifikasi media inisiasi tunas MS cair tanpa pemberian fosfor + 1 mg l -1 BAP + 0.1 mg l -1 kinetin tetapi di beri penambahan fitat phytic acid dodecasodium salt [C 6 H 6 O 24 P 6 Na 12 ] dengan variasi fitat: 0.0 F1; 0.5 gl -1 F 2 ; 1.0 gl -1 F 3 1.5 gl -1 F 4 ; dan 2.0 gl -1 F 5 yang setara dengan pemberian 0, 0.10 , 0.20 , 0.30 dan 0.4 P dengan kondisi terikat. Perlakuan diulang sebanyak 3 kali. Data dianalisis dengan sidik ragam dan bila berbeda nyata dilanjutkan dengan DNMRT pada taraf 5 . Data lainnya dianalisis dengan melakukan banding sederhana serta perhitungan secara persentase. Peubah yang diamati adalah: jumlah aktivitas fitase, P total dalam jaringan plantlet tebu, klorofil a, klorofil b, nisbah klorofil ab, dan total klorofil pada plantlet tebu yang diberi perlakuan selama 1 minggu. 95 Aktivitas enzim fitase pada plantlet tebu diukur berdasarkan prosedur Greiner et al. 1997. Adapun prosedurnya sebagai berikut: 1 Jaringan tebu yang akan dianalisis ditimbang 0.1 g dan dihaluskan dengan mortar, kemudian ditambahkan 0.1 M Na acetat pH 5 350 ml dan diinkubasikan selama 3 jam pada suhu 4 o C sambil dikocok. Selanjutnya hasil inkubasi disentrifus 1200 g selama 15 menit dan diambil supernatan sumber enzim kasar sebanyak 50 μl sebagai sumber enzim fitase. 2 Sebanyak 50 μl sumber enzim fitase ditambahkan 0,1 M Na acetate pH 4.5 yang mengandung 1,5 mM phytate dan diinkubasi selama 30 menit pada suhu 37 o C selama 30 menit. Guna menghentikan reaksi, maka dalam larutan hasil inkubasi tersebut ditambahkan 1500 μl larutan AAM aseton : 5 N asam sulfur : 10 mM amonium molibdat dengan perbandingan 1;1:2. Selanjutnya dalam larutan tersebut ditambahkan 100 μl 1 M asam sitrat sebagai larutan penstabil reaksi enzim fitase. Kemudian campuran larutan tersebut diukur dengan spektrofotometer dengan λ 355 nm dan volume 2000 μl. Secara visual aktivitas enzim fitase akan membentuk warna kekuningan yang menunjukkan suasana agak asam pada larutan sampel bila dibandingkan dengan larutan blanko. Hal ini disebabkan adanya aktivitas enzim fitase yang menguraikan sumber fitat dalam larutan sampel. Setelah diukur kepekatan warna kuningnya OD menggunakan spektrofotometer dengan λ 355 nm, maka dapat diketahui besarnya aktivitas enzim fitase dengan rumus: U ml -1 = Δ E Σ.t x volume totalvolume enzim Keterangan: E blanko = larutan tanpa enzim Σ = 8,7 cm 2 μmol -1 Volume enzim = 50 μl t = 30 menit Volume total = 2000 μl Δ E = E sampel – E blanko Satu unit aktivitas fitase didefinisikan sebagai ukuran fosfat anorganik yang dapat dibebaskan oleh setiap 1 ml larutan enzim kasar dalam waktu 30 menit pada kondisi suhu 37 o C. 96 Analisis kandungan klorofil dilakukan berdasarkan metode Wintermans, and De Mots 1965. Hasil spektrofotometri pada λ 665 dan 649 nm yang didapat dikonversikan dengan rumus: Klorofil a = 13,7 x λ665 – 5,76 x λ649 = µg klorofil ml -1 Klorofil b = 25,8 x λ649 – 7,60 x λ665 = µg klorofil ml -1 Total klorofil = klorofil a + klorofil b. Uji P total pada plantlet dilakukan dengan menggunakan metode pengabuan kering IITA 1983. 97 HASIL DAN PEMBAHASAN Data aktivitas fitase, P total, dan P yang diserap oleh plantlet tebu yang dikulturkan dalam media fitat dapat dilihat pada Tabel 18. Tidak ada pengaruh kultivar dan interaksi antara pemberian beberapa konsentrasi fitat dengan kultivar terhadap aktivitas fitase, namun secara tunggal konsentrasi fitat berpengaruh nyata terhadap peubah tersebut. Ada hubungan secara linear antara konsentrasi fitat dengan aktivitas fitase. Semakin tinggi fitat yang diberikan akan semakin meningkatkan aktivitas fitase tebu Gambar 30. Tabel 18 Data pengaruh pemberian fitat terhadap aktivitas fitase plantlet tebu. Fitat g l -1 Kultivar tebu Rataan fitat V1 V2 V3 V1T V2T V3T Fitase U ml -1 0.0 0.023 0.023 0.024 0.050 0.057 0.063 0.039 0.5 0.028 0.037 0.047 0.075 0.074 0.088 0.058 1.0 0.044 0.036 0.050 0.103 0.090 0.102 0.071 1.5 0.060 0.054 0.052 0.119 0.110 0.112 0.084 2.0 0.067 0.062 0.059 0.140 0.143 0.136 0.101 Rataan kultivar 0.044 b 0.042 b 0.046 b 0.096 a 0.095a 0.100 a l tn tn tn tn tn tn q tn tn tn tn tn tn tn Keterangan: Angka-angka diikuti dengan huruf kecil yang sama, masing-masing tidak berbeda nyata menurut DMRT pada taraf nyata 5 . V1 = cv. Triton non transgenik V2 = cv.PSJT 9441 non transgenik V3 = cv. PA 175 non transgenik V1T = cv.Triton transgenik V1T 17 V2T = cv. PSJT 9441 transgenik V2T 13 V3T = cv. PA 175 transgenik V3T 24 98 Gambar 30 Grafik pengaruh pemberian fitat terhadap aktivitas fitase . plantlet tebu. Data pengaruh pemberian fitat terhadap P total plantlet tebu yang dikulturkan dalam media fitat dapat dilihat pada Tabel 19. Terdapat pengaruh kultivar dan interaksi antara pemberian beberapa konsentrasi fitat dengan kultivar terhadap P total plantlet tebu secara kuadratik pada semua kultvar kecuali cv. Triton non transgenik yang bersifat linear. Gambar 31 mempertlihatkan bahwa titik maksimum untuk P total jaringan terdapat pada pemberian fitat 1,6 g l -1 V2T; 1,7 g l -1 V1T dan 1,8 g l -1 V2, V3, V3T, sedangkan V1 bersifat linear. . Aktivitas fit as e U ml -1 Fitat g l -1 99 Tabel 19 Pengaruh pemberian fitat terhadap rata-rata P total plantlet tebu transgenik dan non transgenik. Fitat gl -1 Kultivar tebu Rataan fitat V1 V2 V3 V1T V2T V3T P total 0.0 0.120 1 0.110 1 0.120 1 0.123 1 0.117 1 0.130 1 0.120 1 0.5 0.177 2 0.182 3 0.180 2 0.220 4 0.210 4 0.220 4 0.201 3 1.0 0.250 4 0.277 4 0.280 4 0.320 4 0.310 4 0.320 4 0.293 4 1.5 0.297 4 0.297 4 0.300 4 0.380 4 0.360 4 0.357 4 0.332 4 2.0 0.302 4 0.307 4 0.300 4 0.367 4 0.377 4 0.387 4 0.343 4 Rataan kultivar 0.229 b 0.238 b 0.236 b 0.288 a 0.295 a 0.289 a L Q tn Keterangan: Angka-angka diikuti dengan huruf kecil yang sama, masing-masing tidak berbeda nyata menurut DMRT pada taraf nyata 5 . 1 = Jenjang ketersediaan hara P rendah 2 = Jenjang ketersediaan hara P sedang 3 = Jenjang ketersediaan hara P normal 4 = Jenjang ketersediaan hara P tinggi V1 = cv. Triton non transgenik V2 = cv.PSJT 9441 non transgenik V3 = cv. PA 175 non transgenik V1T = cv.Triton transgenik V1T 17 V2T = cv. PSJT 9441 transgenik V2T 13 V3T = cv. PA 175 transgenik V3T 24 100 Gambar 31 Grafik hubungan antara pengaruh pemberian fitat terhadap P total plantlet .. tebu transgenik dan non transgenik. Keterangan: V1 = cv. Triton non transgenik V2 = cv.PSJT 9441 non transgenik V3 = cv. PA 175 non transgenik V1T = cv.Triton transgenik V1T 17 V2T = cv. PSJT 9441 transgenik V2T 13 V3T = cv. PA 175 transgenik V3T 24 0 0.5 1.0 1.5 2.0 Fitat g l -1 0.45 0.40 0.35 0.30 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 P total j arin g an 101 Gambar 32 Pengaruh fitat yang diberikan dalam media terhadap pertumbuhan plantlet tebu. Keterangan: V1 = cv. Triton non transgenik F 1 = 0.0 gl -1 fitat V2 = cv.PSJT 9441 non transgenik F 2 = 0.5 gl -1 fitat V3 = cv. PA 175 non transgenik F 3 = 1.0 gl -1 fitat V1T = cv.Triton transgenikV1T 17 F 4 = 1.5 gl -1 fitat V2T = cv. PSJT 9441 transgenik V2T 13 F 5 = 2.0 gl -1 fitat V3T = cv. PA 175 transgenik V3T 24 V1F 3 V2F 3 V3F 3 V1TF 3 V2TF 3 V3TF 3 V1F 4 V2F 4 V3F 4 V1TF 4 V2TF 4 V3TF 4 V1F 5 V2F 5 V3F 5 V1TF 5 V2TF 5 V3TF 5 V1F 2 V2F 2 V3F 2 V1TF 2 V2TF 2 V3TF 2 V1F 1 V2F 1 V3F 1 V1TF 1 V2TF 1 V3TF 1 102 Hasil penelitian memperlihatkan bahwa aktivitas fitase pada tanaman tebu transforman lebih baik dibanding non transgenik. Aktivitas fitase yang paling baik diperlihatkan oleh tebu transgenik cv. PSJT 94-41 yang dikulturkan pada media fitat 2 gl -1 ; dan yang paling rendah aktivitas fitasenya terdapat pada tebu cv. PSJT 94-41 non transgenik dan cv. Triton non transgenik yang dikulturkan pada media tanpa fitat. Adapun pengaruh fitat yang diberikan dalam media terhadap pertumbuhan plantlet tebu dapat dilihat pada Gambar 32. Plantlet tebu yang dikulturkan pada media tanpa P anorganik tampak rapuh dan mudah rontok serta mengering pada ujung daunnya. Tanaman tebu yang merupakan jenis rumput-rumputan, bila kekurangan P akan menunjukkan pertumbuhan anakan yang terhambat, daun pendek dan kecil. Selain itu, bila kekurangan P, maka terjadi klorosis pada tulang daun, serta daun tua akan berwarna coklat pada bagian bawah atau ujung daun Leiwakbessy dan Sutandi 1999. Terdapat korelasi positif antara aktivitas fitase dengan fitat yang diberikan dalam media Gambar 33-35. Plantlet trangenik putatif dari ke-3 kultivar yang diuji mempunyai aktivitas fitase yang lebih baik bila dibandingkan dengan non transgenik. 103 Gambar 33 Korelasi antara pengaruh fitat yang diberikan dalam media terhadap .. aktivitas fitase plantlet tebu cv. Triton non transgenik dan . transgenik. Gambar 34 Korelasi antara pengaruh fitat yang diberikan dalam media terhadap aktivitas fitase plantlet tebu cv. PSJT 94-41 non transgenik dan transgenik. Fitat g l -1 Fitat g l -1 0.14 0.12 0.10 0.08 0.06 0.04 0.02 Aktivitas fit ase U ml -1 0.20 0.18 0.16 0.14 0.12 0.10 0.08 0.06 0.04 0.02 Akt iv it as fi tase U ml -1 0.5 1.0 1.5 2.0 0.5 1.0 1.5 2.0 104 Gambar 35 Korelasi antara pengaruh fitat yang diberikan dalam media terhadap . aktivitas fitase plantlet tebu cv. PA 175 non transgenik dan . transgenik. Laju peningkatan aktivitas fitase pada tebu hasil transformasi lebih baik bila di banding non transgenik. Peningkatan aktivitas fitase ini secara langsung berpengaruh positif terhadap ketersediaan P dalam jaringan tanaman tebu. Gambaran di atas sesuai dengan pendapat Santosa et al. 2004 yang menyatakan bila gen fitase dapat ditransformasikan dan terekspresi dalam tanaman tebu, maka gen ini akan menghasilkan enzim yang dapat mengubah senyawa fitat yang akan dihidrolisis menjadi ester yang berfosfat rendah dan selanjutnya akan melepaskan P inorganik. Marshcner 1995, mengatakan bahwa kebutuhan P untuk pertumbuhan optimum selama fase vegetatif adalah 0.30 - 0.50 dari bobot keringnya. Plantlet tebu non transgenik yang dikulturkan pada media MS memiliki P total dalam jaringan sebesar 0.10 - 0.35 , sedangkan pada tebu transgenik memiliki kadar P yang lebih lebar variasinya yaitu 0.10 – 0.40 . Xiao et al. 2006 meneliti ekspresi ’novel phytase gene’ dari Medicago truncatula pada tanaman Arabidopsis. Hasil penelitian tersebut memberi informasi pada apoplast akar tanaman Arabidopsis transgenik, terjadi peningkatan aktivitas fitase 12.3- 16.2 kali dibanding tanaman kontrol. Fitat g l -1 0.18 0.16 0.14 0.12 0.10 0.08 0.06 0.04 0.02 A kt ivi tas fitase U m l -1 0.5 1.0 1.5 2.0 105 Gambar 36 Korelasi antara aktivitas fitase terhadap P total dalam jaringan . plantlet tebu cv. Triton non transgenik dan . transgenik. Gambar 37 Korelasi antara aktivitas fitase terhadap P total dalam jaringan . plantlet tebu cv . PSJT 94-41 non transgenik dan . transgenik. Aktivitas fitase U ml -1 P total P total Aktivitas fitase U ml -1 106 Gambar 38 Korelasi antara aktivitas fitase terhadap P total dalam jaringan . plantlet tebu cv. PA 175 non transgenik dan . transgenik. Aktivitas fitase U ml -1 P tot al 107 Gambar 39 P yang diserap oleh plantlet tebu transgenik putatif dan non trangenik usia 1 minggu setelah tanaman pada media fitat. Penelitian ini menggunakan jenjang ketersediaan hara P dari katagori sangat rendah hingga tinggi. P yang diserap oleh plantlet tebu transgenik putatif dan non trangenik usia 1 minggu setelah tanaman pada media fitat dapat dilihat pada Gambar 39 dan Tabel 20. Berdasarkan hasil analisa terhadap serapan P, dapat diketahui bahwa pemberian fitat dalam media kultur dapat meningkatkan jumlah serapan P. Tanpa pemberian fitat dalam media yang tidak mengandung P, ketersediaan P totalnya sangat rendah karena tidak ada P yang dapat diserap dari media sehingga P yang terdeteksi sewaktu analisa di laboratorium merupakan P yang telah ada dalam tanaman sebelum perlakuan. Kekurangan P tersebut sangat Fitat g l -1 P y an g di sera p 108 mengganggu pertumbuhan plantlet tebu. Plantlet tebu yang tidak diberi fitat menunjukkan gejala kekurangan P, tumbuh kerdil, daun berwarna hijau gelap kemudian berubah menjadi kekuningan, selanjutnya menjadi coklat, dan akhirnya mati. Tabel 20 Peningkatan P total dan aktivitas fitase tebu transgenik dibanding non transgenik yang dikulturkan selama 1 minggu pada media yang diberi fitat. Fitat gl- P total Aktivitas fitase Non Transgenik Transgenik Kenaikan Non Transgenik Transgenik Kenaikan V1T V1 V1T 0.0 gl -1 fitat V1 0.123 2.50 0.023 0.050 117.39 0.5 gl -1 fitat 0.120 0.220 24.29 0.028 0.075 167.86 1.0 gl -1 fitat 0.177 0.320 28.00 0.044 0.103 134.09 1.5 gl -1 fitat 0.250 0.380 27.95 0.060 0.119 98.33 2.0 gl -1 fitat 0.297 0.367 21.52 0.067 0.140 108.96 0.302 V2T V2 V2T 0.0 gl -1 fitat V2 0.117 6.36 0.023 0.057 147.83 0.5 gl -1 fitat 0.110 0.210 15.38 0.037 0.074 100.00 1.0 gl -1 fitat 0.182 0.310 11.91 0.036 0.090 150.00 1.5 gl -1 fitat 0.277 0.360 21.21 0.054 0.110 103.70 2.0 gl -1 fitat 0.297 0.377 22.80 0.062 0.143 130.65 0.307 V3T V3 V3T 0.0 gl -1 fitat V3 0.130 8.33 0.024 0.063 162.50 0.5 gl -1 fitat 0.120 0.220 22.22 0.047 0.088 87.23 1.0 gl -1 fitat 0.180 0.320 14.29 0.050 0.102 104.00 1.5 gl -1 fitat 0.280 0.357 19.00 0.052 0.112 115.38 2.0 gl -1 fitat 0.300 0.387 29.00 0.059 0.136 130.51 Keterangan: V1 = cv. Triton non transgenik V2 = cv.PSJT 9441 non transgenik V3 = cv. PA 175 non transgenik V1T = cv.Triton transgenikV1T 17 V2T = cv. PSJT 9441 transgenik V2T 1 V3T = cv. PA 175 transgenik V3T 2 Tanaman tebu secara alami telah memiliki enzim fitase yaitu rata-rata secara berturut turut adalah 0.0231 U ml -1 cv. Triton; 0.238 U ml -1 cv. PSJT 94- 4 dan 0.236 U ml -1 cv. PA 175. Selain itu, data aktivitas fitase plantlet tebu yang didapat dari penelitian ini lebih tinggi bila dibandingkan dengan kalus tebu hasil penelitian Wulandari 2005 yang hanya 0.01 - 0.02 U ml -1 . Ada dugaan 109 bahwa plantlet tebu memiliki fitat yang tinggi bila dibandingkan dengan kalus tebu. Aktivitas enzim fitase akan dipicu oleh ketersediaan P dalam tanaman yang kurang, sehingga tanaman akan mengaktifkan aktivitas enzim fitase untuk melepaskan P yang terikat dalam media tumbuh atau dalam jaringan. Dugaan ini sesuai dengan pendapat Konietzny dan Greiner 2002, bahwa Fitase Myo- inositol hexakisphosphate phosphohydrolase merupakan enzim yang berfungsi menghidrolisis asam fitat myo-inositol hexakisphosphateInsP 6 menghasilkan ortofosfat dan myo-inositol pentakisphosphate, bahkan pada kondisi-kondisi tertentu menjadi P dan myo-inositol bebas dan dapat menghilangkan sifat pengkhelat dari asam fitat. Pada media yang tidak tersedia fosfat tetapi diberikan fitat, maka akan terjadi peningkatan aktivitas fitase sejalan dengan peningkatan fitat yang diberikan. Peningkatan aktivitas fitase pada tebu transgenik akan berpengaruh terhadap klorofil tebu Tabel 21 dan Gambar 40-42. Aktivitas fitase cenderung makin meningkatkan klorofil tebu, terutama ke- 3 kultivar tebu hasil transformasi, Idriss et al., 2002 melaporkan bahwa pada tanaman jagung yang tidak disisipi gen fitase dari Bacillus amylliquefaciens FZB45, bila dikulturkan dalam media tanpa fitat dan kondisi fosfat yang terbatas, maka pertumbuhannya akan terhambat dan terjadi penurunan kadar klorofil. Klorofil a pada tanaman tebu transgenik lebih tinggi daripada non transgenik, sedangkan untuk klorofil b terjadi hal yang sebaliknya dimana klorofil b pada tanaman tebu transgenik lebih rendah daripada non transgenik Tabel 21. Klorofil a cenderung lebih banyak terdapat pada tanaman yang sedang tidak dalam kondisi cekaman. Jika tanaman berada pada kondisi cekaman, maka kadar klorofil b meningkat. 110 Tabel 21 , Data pengaruh pemberian fitat terhadap kadar klorofil plantlet tebu yang dikulturkan dalam media fitat Fitat gl - Kultivar tebu Rata- rata V1 V2 V3 V1T V2T V3T Klorofil a µg ml -1 0.0 0.048 gh 0.047 gh 0.032 h 0.02 h 0.107 efgh 0.008 h 0.044 0.5 0.033 gh 0.034 gh 0.053 fgh 0.027 h 0.160 defgh 0.038 gh 0.057 1.0 0.040 gh 0.049 gh 0.128 efgh 0.056 fgh 0.277 bcde 0.055 fgh 0.101 1.5 0.114 efgh 0.048 gh 0.212 defgh 0.128 efgh 0.372 abc 0.411 ab 0.214 2.0 0.118 efgh 0.054 fgh 0.475 a 0.23 cdef 0.362 abc 0.338 abcd 0.263 Rata- rata 0.070 0.046 0.180 0.092 0.256 0.170 Klorofil b µg ml -1 0.0 0.147 bcdef 0.170 bcdef 0.239 bcdef 0.12 def 0.205 bcdef 0.056 f 0.157 0.5 0.216 bcdef 0.219 bcdef 0.235 bcdef 0.242 bcdef 0.259 bcdef 0.100 ef 0.212 1.0 0.257 bcdef 0.343 abc 0.277 abcde 0.294 abcde 0.292 abcde 0.317 abcd 0.297 1.5 0.232 bcdef 0.238 bcdef 0.351 abc 0.277 abcde 0.224 bcdef 0.210 bcdef 0.255 2.0 0.320 abcd 0.136 cdef 0.227 bcdef 0.49 a 0.358 ab 0.303 abcde 0.306 Rata- rata 0.234 0.221 0.266 0.286 0.268 0.197 Total klorofil µg ml -1 0.0 0.195 hij 0.217 0.271 fghi 0.15 ij 0.312 fghi 0.064 j 0.201 0.5 0.249 ghij 0.253 fghij 0.288 fghi 0.269 fghi 0.418 cdef 0.138 ij 0.269 1.0 0.297 fghi 0.392 defg 0.404 defg 0.350 fgh 0.569 abcd 0.372 efgh 0.397 1.5 0.345 fgh 0.286 fghi 0.562 abcde 0.404 cdefg 0.596 abc 0.621 ab 0.469 2.0 0.438 bcdef 0.190 hij 0.703 a 0.72 a 0.720 a 0.642 a 0.569 Rata- rata 0.234 0.221 0.266 0.286 0.268 0.197 Keterangan: V1 = cv. Triton non transgenik V2 = cv.PSJT 9441 non transgenik V3 = cv. PA 175 non transgenik V1T = cv.Triton transgenikV1T 17 V2T = cv. PSJT 9441 transgenik V2T 1 V3T = cv. PA 175 transgenik V3T 2 111 Gambar 40 Korelasi antara aktivitas fitase terhadap total klorofil dalam jaringan plantlet tebu cv. Triton non transgenik dan transgenik yang ditanam pada media fitat. Gambar 41 Korelasi antara aktivitas fitase terhadap total klorofil dalam jaringan plantlet tebu cv. PSJT 94-41 non transgenik dan transgenik putatif yang ditanam pada media fitat. Total ko lorofil µ g ml -1 0.05 0.1 0.15 0.2 Fitase U ml –1 0 0.05 0.1 0.15 0.2 Fitase U ml –1 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 T o ta l k o lo ro fil µ g ml -1 112 Gambar 42 Korelasi antara aktivitas fitase terhadap total klorofil dalam jaringan plantlet tebu cv. PA 175 non transgenik dan transgenik yang ditanam pada media fitat. Gen fitase secara langsung memberikan andil dalam ketersedian P inorganik dalam tanaman. Fosfat inorganik yang dilepaskan fitase akan memberikan pengaruh yang positif dalam proses pembentukan klorofil sehingga meningkatkan fotosintesis dan metabolisme tanaman tebu Alexander 1972. P memegang peranan penting dalam proses biosintesis klorofil. Tanaman mengubah P menjadi sulfolipid dan galaktolipid untuk pembentukan membran kloroplas, Tiap gram dari material daun terdapat 1 m 2 membran kloroplas. Kurang lebih 15 dari lipid bilayer dalam membran kloroplas merupakan phospholipid. Selain itu, P secara tidak langsung akan berdampak terhadap pembentukan porphyrin hasil dari siklus asam trikarboksilat Buchanan et al. 2006. Total ko lorofil µ g ml -1 0.05 0.1 0.15 0.2 Fitase U ml –1 113 SIMPULAN 1. Plantet tebu transgenik 3 kultivar tebu cv. Triton, cv. PSJT 9441; dan cv. PA 175 yang disisipi gen fitase menunjukkan ekspresi berupa korelasi yang positif antara aktivitas fitase dan P total dalam jaringan plantlet tebu. Aktivitas fitase dan P total tertinggi didapat pada perlakuan pemberian fitat 2 g l -1 . Semakin tinggi fitat yang diberikan, maka akan makin meningkatkan aktivitas fitase dan P total tanaman. Ekspresi aktivitas fitase pada transgenik tebu terjadi peningkatan 65.04 – 75.40 dibandingkan non transgenik, sedangkan untuk P total tanaman mengalami peningkatan 2.5 - 29 . 2. Peningkatan aktivitas fitase pada tebu transgenik juga berpengaruh positif terhadap total klorofil, klorofil a, sedangkan klorofil b mengalami penurunan dibandingkan dengan tebu non transgenik.

BAB VII AKLIMATISASI PLANTLET TEBU HASIL TRANSFORMASI ABSTRAK