PSJT 94-41 PSJT 94-41 ii PA 175 c PA 175

71 Gambar 24 . Penampilan tunas tebu transgenik putatif : i Inisiasi kalus transgenik putatif dimana tunas yang hijau hanya sedikit dibanding tunas yang albino; ii tunas transgenik putatif tebu dengan daun berwarna kuning; iii tunas transgenik putatif tebu dengan daun berwarna hijau belang putih; iv tunas transgenik putatif tebu dengan daun berwarna hijau; v tunas transgenik putatif tebu dengan daun berwarna hijau muda dan albino. Menurut Skinner et al. 2004, kultur jaringan dapat menyebabkan variasi somaklonal juga sekaligus terjadi perubahan karena integrasi gen asing akibat i. PSJT 94-41 i. PSJT 94-41 iii. PA 175 ii. cv. Triton i. cv. PSJT 94-41 v. cv. PA 175 iv. cv. PA 175 v. cv. PSJT 94-41 iii. cv. PSJT 94-41 72 transformasi. Plantlet-plantlet tebu tersebut telah berhasil disisipi transgen fitase bakteri melalui kegiatan transformasi yang dibuktikan dengan lolos tumbuh dalam media seleksi kanamisin. Jadi disini, diduga putatif bahwa tanaman yang hidup sesudah seleksi dengan kanamisin adalah hasil transformasi. Guna membuktikan hal tersebut, harus diuji lanjut dengan analisis gen fitase. C Analisis integrasi gen fitase hasil transformasi dengan teknik PCR Plantlet yang bertahan hidup dan memiliki pertumbuhan yang baik dilakukan analisis PCR untuk mengetahui keberadaan gen yang diintroduksikan dalam tanaman tebu. Hasil PCR dengan primer spesifik menunjukkan bahwa pada genom tebu tersebut telah berhasil disisipkan gen fitase yang ditunjukkan dengan pita ± 900 bp Gambar 25. Tetapi tidak semua dari sampel tanaman tebu transforman dapat dideteksi adanya pita. Salah satu kelemahan dari ketidaksempurnaan dalam pengerjaan analisa PCR adalah timbulnya negatif semu karena kurang sempurnanya isolasi DNA; atau positif semu karena kontaminasi DNA. PCR adalah metode cepat dan sederhana untuk mengkonfirmasi apakah tanaman transgenik putatif yang bertahan hidup dalam media seleksi merupakan trangenik atau tidak. Penelitian ini menggunakan 2 primer spesifik EC1 sebagai forward dan EC1 sebagai reverse yang ditambahkan dalam reaksi PCR ekstrak DNA sampel yang diuji. DNA polimerase yang bersifat thermostable akan mengamplifikasi region antara 2 primer selama siklus PCR berlangsung. Amplifikasi tersebut akan menghasilkan fragment yang dapat memprediksi ukuran yang setara dengan jumlah pasangan basa antara 2 primer dalam transgen. Ukuran dari fragment tersebut dapat diamati pada agarose yang telah diberi ethidium bromida. Transgen fitase bakteri yang berhasil masuk dalam genom tanaman tebu akan dapat dideteksi pita ukuran ± 900 bp. Data mengenai aktivitas fitase dan PCR plantlet non transgenik dan transgenik putatif dapat dilihat pada Tabel 14. Hasil PCR memperlihatkan adanya pita pukuran 900 bp pada plantlet tebu dengan aktivitas fitase tinggi seperti pada klon tebu hasil transformasi V1T klon no. 9; klon no. 12, V2T klon no. 5; klon 73 Gambar 25 Hasil elektroforesis PCR tebu dengan primer spesifik EC1 dan EC3 Keterangan: 1 = cv. Triton ; V1 5 2 = cv. PSJT 94-41; V2 15 3 = cv. PA 175; V3 12 4 = Kontrol + Agrobacterium tumefaciens GV 2260 5 = Ladder 1 kb 6 = Kontrol negatif air 7 = cv. Triton transgenik putatif ; V1T 9 8 = cv. PSJT 94-41 transgenik putatif ; V2T 5 9 = cv. PA 175 transgenik putatif ; V3T 3 10 = cv. Triton transgenik putatif ; V1T 12 11 = cv. PSJT 94-41 transgenik putatif ; V2T 10 12 = cv. PA 175 transgenik putatif ;V3T 8 13 = cv. Triton transgenik putatif ; V1T 29 14 = cv. PSJT 94-41 transgenik putatif ; V2T 11 Keterangan: a = Ladder 1 kb b = Kontrol – c = cv. Triton transgenik putatif; V1T 4 d = cv. PSJT 94-41 transgenik putatif; V2T 13 e = cv. PA 175 transgenik putatif; V3T 10 1000 bp 850 bp 1000 bp 850 bp 74 Tabel 14 Aktivitas fitase dan PCR plantlet non transgenik dan transgenik putatif Kode Sampel Aktivitas fitase U.ml -1 PCR Kode Sampel Aktivitas fitase U.ml -1 PCR V1 1 0.033 R - V1T 2 0.040 R - V1 2 0.063 R - V1T 3 0.106 Tg - V1 3 0.058 R - V1T 5 0.078 S - V1 4 0.060 R - V1T 6 0.076 S - V1 5 0.071 S V1T 7 0.177 Tg - V1 8 0.023 R V1T 8 0.067 R - V1 10 0.058 R V1T 9 0.106 Tg Pita 900 bp V1 12 0.069 R V1T 11 0.108 Tg - V1 14 0.015 R V1T 12 0.127 Tg Pita 900 bp V1 15 0.060 R V1T 29 0.053 R Pita 900 bp V2 1 0.058 R - V1T 13 0.078 S - V1T 15 0.104 Tg smear V2 2 0.050 R - V2T 1 0.174 Tg - V2 3 0.054 R - V2T 2 0.107 Tg - V2 4 0.066 R - V2T 3 0.089 S - V2 5 0.014 R V2T 5 0.123 Tg Pita 900 bp V2 6 0.038 R V2T 6 0.061 R - V2 10 0.069 R V2T 7 0.093 S - V2 11 0.041 R V2T 10 0.060 R Pita 900 bp V2 12 0.061 R V2T 11 0.132 Tg Pita 900 bp V2 14 0.029 R V2T 12 0.081 S - V2 15 0.059 R - V2T 14 0.087 S - V3 1 0.056 R - V3T 1 0.108 Tg - V3 2 0.051 R - V3T 2 0.104 Tg - V3 3 0.057 R - V3T 3 0.110 Tg Pita 900 bp V3 4 0.064 R - V3T 4 0.080 S V3 5 0.044 R V3T 5 0.096 S - V3 10 0.049 R V3T 6 0.090 S - V3 11 0.068 R V3T 7 0.048 R - V3 12 0.055 R - V3T 8 0.068 R Pita 900 bp V3 13 0.069 R V3T 9 0.094 S - V3 15 0.015R V3T 10 0.057 R - V1T 1 0.098 S - V3T 13 0.167 Tg Pita 900 bp Keterangan: = Data yang disajikan pada Tabel 7 hanya cuplikan dari sebagian data V1 = cv. Triton non transgenik V2 = cv. PSJT 9441 non transgenik V3 = cv. PA 175 non transgenik V1T = cv. Triton transgenik putatif V2T = cv. PSJT 94-41 transgenik putatif V3T = cv. PA 175 transgenik putatif R = aktivitas fitase rendah S = aktivitas fitase sedang Tg = aktivitas fitase tinggi 75 no. 13; klon no. 11, dan V3T klon no. 3. Pita ukuran 9000 bp tidak terdapat pada klon-klon tebu non transgenik seperti pada V 1 klon no. 5 ; V 2 klon no. 15 ; V 3 klon no. 12. Klon-klon tebu hasil transformasi tetapi memiliki aktivitas fitase yang rendah ternyata setelah di PCR ada yang menunjukkan pita ukuran 900 bp, dan ini mengindikasikan gen fitase telah berhasil disisipkan, namun gen tersebut tidak terekspresi, seperti pada V1T klon no. 4 ; klon no. 29 ; V2T klon no. 10 ; V3T klon no. 8; klon no. 10. Data dari Tabel 14, menunjukkan tanaman transgenik dengan aktivitas tinggi dari total sampel yang diamati terdapat 46 , 40 , 45 secara berturut- turut untuk cv. Triton; cv. PSJT 94-41; dan cv. PA 175; aktivitas fitase sedang yaitu 31, 40, 27 , dan aktivitas fitase rendah 23 , 20 , 27 . Sedangkan tanaman non transgenik secara berturut-turut dengan aktivitas fitase rendah sebanyak 90 , 100 , 100 untuk cv. Triton; cv. PSJT 94-41; dan cv. PA 175 dari total sampel yang diamati; aktivitas fitase sedang: 10, 0, 0 , dan tidak ada yang memiliki aktivitas fitase tinggi. 76 SIMPULAN 1 Lethal dosis kanamisin yang dapat digunakan sebagai seleksi untuk ke-3 kultivar Triton, PSJT-94-41 dan PA 175 secara berurut-turut adalah adalah 150 mg l -1 ; 100 mg l -1 ; dan 100 mg l -1 kanamisin; 2 Efisiensi transformasi kalus tebu dengan gen fitase adalah 22 cv. Triton, 15 cv. PSJT 94-41; dan 24 cv. PA 175; 3 Tanaman transgenik cv. Triton; cv. PSJT 94-41; dan cv. PA 175 hasil sub kultur ke-0 secara berturut-berurut adalah 24, 18, 30; sedangkan tanaman transgenik cv. Triton; cv. PSJT 94-41; dan cv. PA 175 hasil sub kultur ke-1 secara berturut-berurut adalah 392, 360, dan 380 tanaman. 4 Berdasarkan analisa PCR, ditemukan pita ukuran 900 bp pada tebu hasil transformasi cv. Triton; cv. PSJT 94-41; dan cv. PA 175, sedangkan pada tebu non transgenik tidak ditemukan pita ukuran 900 bp; 5 Tanaman transgenik cv. Triton; cv. PSJT 94-41; dan cv. PA 175 dengan aktivitas tinggi secara berturut sebanyak 46 , 40 , 45 ; aktivitas fitase sedang yaitu 31, 40, 27 , dan aktivitas fitase rendah 23 , 20 , 27 dari total sampel yang diamati. Sedangkan tanaman non transgenik cv. Triton; cv. PSJT 94-41; dan cv. PA 175 secara berturut-turut dengan aktivitas fitase rendah sebanyak 90 , 100 , 100 dari total sampel yang diamati; aktivitas fitase sedang: 10, 0, 0 , dan tidak ada yang memiliki aktivitas fitase tinggi.

BAB V PENINGKATAN KLOROFIL PLANTLET TEBU HASIL TRANSFORMASI DENGAN MENGGUNAKAN PUTRESINA