PSJT 94-41 PSJT 94-41 ii PA 175 c PA 175
71
Gambar 24 .
Penampilan tunas tebu transgenik putatif : i Inisiasi kalus transgenik putatif dimana tunas yang hijau hanya sedikit dibanding tunas yang
albino; ii tunas transgenik putatif tebu dengan daun berwarna kuning; iii tunas transgenik putatif tebu dengan daun berwarna hijau
belang putih; iv tunas transgenik putatif tebu dengan daun berwarna hijau; v tunas transgenik putatif tebu dengan daun berwarna hijau
muda dan albino.
Menurut Skinner et al. 2004, kultur jaringan dapat menyebabkan variasi somaklonal juga sekaligus terjadi perubahan karena integrasi gen asing akibat
i. PSJT 94-41 i. PSJT 94-41 iii. PA 175
ii. cv. Triton i. cv. PSJT 94-41
v. cv. PA 175
iv. cv. PA 175 v. cv. PSJT 94-41
iii. cv. PSJT 94-41
72 transformasi. Plantlet-plantlet tebu tersebut telah berhasil disisipi transgen fitase
bakteri melalui kegiatan transformasi yang dibuktikan dengan lolos tumbuh dalam media seleksi kanamisin. Jadi disini, diduga putatif bahwa tanaman yang
hidup sesudah seleksi dengan kanamisin adalah hasil transformasi. Guna membuktikan hal tersebut, harus diuji lanjut dengan analisis gen fitase.
C Analisis integrasi gen fitase hasil transformasi dengan teknik PCR
Plantlet yang bertahan hidup dan memiliki pertumbuhan yang baik dilakukan analisis PCR untuk mengetahui keberadaan gen yang diintroduksikan
dalam tanaman tebu. Hasil PCR dengan primer spesifik menunjukkan bahwa pada genom tebu tersebut telah berhasil disisipkan gen fitase yang ditunjukkan
dengan pita ± 900 bp Gambar 25. Tetapi tidak semua dari sampel tanaman tebu transforman dapat dideteksi adanya pita. Salah satu kelemahan dari
ketidaksempurnaan dalam pengerjaan analisa PCR adalah timbulnya negatif semu karena kurang sempurnanya isolasi DNA; atau positif semu karena kontaminasi
DNA. PCR adalah metode cepat dan sederhana untuk mengkonfirmasi apakah
tanaman transgenik putatif yang bertahan hidup dalam media seleksi merupakan trangenik atau tidak. Penelitian ini menggunakan 2 primer spesifik EC1 sebagai
forward dan EC1 sebagai reverse yang ditambahkan dalam reaksi PCR ekstrak
DNA sampel yang diuji. DNA polimerase yang bersifat thermostable akan mengamplifikasi region antara 2 primer selama siklus PCR berlangsung.
Amplifikasi tersebut akan menghasilkan fragment yang dapat memprediksi ukuran yang setara dengan jumlah pasangan basa antara 2 primer dalam transgen.
Ukuran dari fragment tersebut dapat diamati pada agarose yang telah diberi ethidium bromida. Transgen fitase bakteri yang berhasil masuk dalam genom
tanaman tebu akan dapat dideteksi pita ukuran ± 900 bp. Data mengenai aktivitas fitase dan PCR plantlet non transgenik dan
transgenik putatif dapat dilihat pada Tabel 14. Hasil PCR memperlihatkan adanya pita pukuran 900 bp pada plantlet tebu dengan aktivitas fitase tinggi seperti pada
klon tebu hasil transformasi V1T klon no. 9; klon no. 12, V2T klon no. 5; klon
73
Gambar 25 Hasil elektroforesis PCR tebu dengan primer spesifik EC1 dan EC3
Keterangan:
1 = cv. Triton ; V1
5
2 = cv. PSJT 94-41; V2
15
3 = cv. PA 175; V3
12
4 = Kontrol + Agrobacterium tumefaciens GV 2260 5 = Ladder 1 kb
6 = Kontrol negatif air 7 = cv. Triton transgenik putatif ; V1T
9
8 = cv. PSJT 94-41 transgenik putatif ; V2T
5
9 = cv. PA 175 transgenik putatif ; V3T
3
10 = cv. Triton transgenik putatif ; V1T
12
11 = cv. PSJT 94-41 transgenik putatif ; V2T
10
12 = cv. PA 175 transgenik putatif ;V3T
8
13 = cv. Triton transgenik putatif ; V1T
29
14 = cv. PSJT 94-41 transgenik putatif ; V2T
11
Keterangan: a = Ladder 1 kb
b = Kontrol – c = cv. Triton transgenik putatif; V1T
4
d = cv. PSJT 94-41 transgenik putatif; V2T
13
e = cv. PA 175 transgenik putatif; V3T
10
1000 bp 850 bp
1000 bp 850 bp
74 Tabel 14 Aktivitas fitase dan PCR plantlet
non transgenik
dan transgenik putatif
Kode Sampel
Aktivitas fitase U.ml
-1
PCR Kode
Sampel Aktivitas fitase
U.ml
-1
PCR V1
1
0.033 R
- V1T
2
0.040 R -
V1
2
0.063 R
- V1T
3
0.106 Tg -
V1
3
0.058 R -
V1T
5
0.078 S -
V1
4
0.060 R
- V1T
6
0.076 S -
V1
5
0.071 S
V1T
7
0.177 Tg -
V1
8
0.023 R V1T
8
0.067 R -
V1
10
0.058 R V1T
9
0.106 Tg Pita 900 bp
V1
12
0.069 R V1T
11
0.108 Tg -
V1
14
0.015 R V1T
12
0.127 Tg Pita 900 bp
V1
15
0.060 R V1T
29
0.053 R Pita 900 bp
V2
1
0.058 R
- V1T
13
0.078 S -
V1T
15
0.104 Tg smear
V2
2
0.050 R
- V2T
1
0.174 Tg -
V2
3
0.054 R
- V2T
2
0.107 Tg -
V2
4
0.066 R
- V2T
3
0.089 S -
V2
5
0.014 R V2T
5
0.123 Tg Pita 900 bp
V2
6
0.038 R V2T
6
0.061 R -
V2
10
0.069 R V2T
7
0.093 S -
V2
11
0.041 R V2T
10
0.060 R Pita 900 bp
V2
12
0.061 R V2T
11
0.132 Tg Pita 900 bp
V2
14
0.029 R V2T
12
0.081 S -
V2
15
0.059 R
- V2T
14
0.087 S -
V3
1
0.056 R
- V3T
1
0.108 Tg -
V3
2
0.051 R
- V3T
2
0.104 Tg -
V3
3
0.057 R
- V3T
3
0.110 Tg Pita 900 bp
V3
4
0.064 R
- V3T
4
0.080 S V3
5
0.044 R V3T
5
0.096 S -
V3
10
0.049 R V3T
6
0.090 S -
V3
11
0.068 R V3T
7
0.048 R -
V3
12
0.055 R
- V3T
8
0.068 R Pita 900 bp
V3
13
0.069 R V3T
9
0.094 S -
V3
15
0.015R V3T
10
0.057 R -
V1T
1
0.098 S
- V3T
13
0.167 Tg Pita 900 bp
Keterangan: = Data yang disajikan pada Tabel 7 hanya cuplikan dari sebagian
data
V1 = cv. Triton non transgenik V2 = cv. PSJT 9441 non transgenik
V3 = cv. PA 175 non transgenik V1T = cv. Triton transgenik putatif
V2T = cv. PSJT 94-41 transgenik putatif V3T = cv. PA 175 transgenik putatif
R = aktivitas fitase rendah
S = aktivitas fitase sedang Tg = aktivitas fitase tinggi
75 no. 13; klon no. 11, dan V3T klon no. 3. Pita ukuran 9000 bp tidak terdapat
pada klon-klon tebu non transgenik seperti pada V
1
klon no. 5
;
V
2
klon no. 15
;
V
3
klon no. 12. Klon-klon tebu hasil transformasi tetapi memiliki aktivitas fitase yang rendah ternyata setelah di PCR ada yang menunjukkan pita ukuran 900 bp,
dan ini mengindikasikan gen fitase telah berhasil disisipkan, namun gen tersebut tidak terekspresi, seperti pada V1T
klon no. 4
;
klon no. 29
;
V2T klon no. 10
;
V3T klon no. 8; klon no. 10.
Data dari Tabel 14, menunjukkan tanaman transgenik dengan aktivitas tinggi dari total sampel yang diamati terdapat 46 , 40 , 45 secara berturut-
turut untuk cv. Triton; cv. PSJT 94-41; dan cv. PA 175; aktivitas fitase sedang yaitu 31, 40, 27 , dan aktivitas fitase rendah 23 , 20 , 27 . Sedangkan
tanaman non transgenik secara berturut-turut dengan aktivitas fitase rendah sebanyak 90 , 100 , 100 untuk cv. Triton; cv. PSJT 94-41; dan cv. PA
175 dari total sampel yang diamati; aktivitas fitase sedang: 10, 0, 0 , dan tidak ada yang memiliki aktivitas fitase tinggi.
76
SIMPULAN
1 Lethal dosis kanamisin yang dapat digunakan sebagai seleksi untuk ke-3
kultivar Triton, PSJT-94-41 dan PA 175 secara berurut-turut adalah adalah 150 mg l
-1
; 100 mg l
-1
; dan 100 mg l
-1
kanamisin; 2
Efisiensi transformasi kalus tebu dengan gen fitase adalah 22 cv. Triton, 15 cv. PSJT 94-41; dan 24 cv. PA 175;
3 Tanaman transgenik cv. Triton; cv. PSJT 94-41; dan cv. PA 175 hasil sub
kultur ke-0 secara berturut-berurut adalah 24, 18, 30; sedangkan tanaman transgenik cv. Triton; cv. PSJT 94-41; dan cv. PA 175 hasil sub kultur ke-1
secara berturut-berurut adalah 392, 360, dan 380 tanaman. 4
Berdasarkan analisa PCR, ditemukan pita ukuran 900 bp pada tebu hasil transformasi cv. Triton; cv. PSJT 94-41; dan cv. PA 175, sedangkan pada
tebu non transgenik tidak ditemukan pita ukuran 900 bp; 5
Tanaman transgenik cv. Triton; cv. PSJT 94-41; dan cv. PA 175 dengan aktivitas tinggi secara berturut sebanyak 46 , 40 , 45 ; aktivitas fitase
sedang yaitu 31, 40, 27 , dan aktivitas fitase rendah 23 , 20 , 27 dari total sampel yang diamati. Sedangkan tanaman non transgenik cv. Triton; cv.
PSJT 94-41; dan cv. PA 175 secara berturut-turut dengan aktivitas fitase rendah sebanyak 90 , 100 , 100 dari total sampel yang diamati;
aktivitas fitase sedang: 10, 0, 0 , dan tidak ada yang memiliki aktivitas fitase tinggi.