REGENERASI TEBU SECARA IN VITRO ABSTRAK

BAB III REGENERASI TEBU SECARA IN VITRO ABSTRAK

Tebu Saccharum officinarum L. merupakan tanaman penting di Indonesia. Peningkatan produksi tebu tergantung dari kualitas kultivar. Salah satu metode yang banyak digunakan untuk perbanyakan klonal tebu adalah melalui kultur jaringan. Langkah pertama dalam kultur jaringan adalah menginduksi pembentukan kalus dari eksplan, sebelum diregenerasikan menjadi plantlet. Tujuan dari penelitian ini adalah 1 untuk mendapatkan media pembentukan kalus yang terbaik dengan menggunakan beberapa konsentrasi 2.4 D [kinetin 0.1 mg l -1 + 2.4 D 1; 2; 3 dan 4 mg l -1 ]; 2 mendapatkan media pembentukan tunas yang terbaik menggunakan beberapa variasi konsentrasi BAP [kinetein 0.1 mg l -1 + BAP 0; 1; 1.5; dan 2 mg l -1 ]; dan 3 mendapatkan konsentrasi terbaik untuk pembentukan akar dengan menggunakan beberapa variasi IBA [kinetin 0.1 mg l -1 + IBA 0; 1; 1.5; dan 2 mg l -1 ]. Rancangan lingkungan yang digunakan dalam penelitian ini adalah Rancangan Acak Lengkap RAL dan rancangan perlakuan faktorial dengan 10 ulangan. Faktor pertama adalah beberapa kultivar tebu cv.Triton, cv. PSJT 94-41. cv. PA 175. Faktor kedua adalah: media kultur dengan ZPT yang berbeda. Data dianalisa dengan Duncan’s Multiple Range Test DMRT pada taraf 5 . Pembentukan kalus yang baik terdapat pada media yang mengandung 3 mg l -1 2.4 D. Konsentrasi 2.4 D yang optimum yang baik untuk pembentukan kalus masing-masing kultivar Triton, PSJT 94-41 dan PA 175 berturut-turut adalah 3.38; 3.79 dan 2.85 mg l -1 2.4 D. Pembentukan tunas tebu dengan menggunakan media MS + kinetin 0.1 mg l -1 + BAP 0.5; 1.0 ; 1.5; 2.0 mg l -1 . Tunas mulai terbentuk dengan munculnya noktah hijau pada kalus setelah seminggu dalam media regenerasi. Media pertunasan yang terbaik untuk 3 kultivar tebu terdapat pada media MS + kinetin 0.1 mg l -1 + BAP 0.5 mg l -1 . Media perakaran yang terbaik untuk 3 kultivar tebu adalah MS + kinetin 0.1 mg l -1 + IBA 1.5 mg l -1 Kata kunci: Tebu, regenerasi, in vitro IN VITRO REGENERATION OF SUGARCANE ABSTRACT Sugarcane Saccharum officinarum L. is one of the most important crop in Indonesia. Improvement of sugarcane productivity mainly depend on quality of cultivar. The alternative method such as in vitro culture technique is needed to be uses to multiply clones of sugarcane. As the first step in many tissue culture experiment, it is necesssary to induce callus formation from the primary explant before regeneration to be plantlets. The objectives of the study were 1 to find the best callusing medium using several concentration of 2.4 D [kinetein 0.1 mg l -1 + 2.4 D 1; 2; 3 dan 4 mg l -1 ]; 2 to find the best perfom of shootlet using several BAP concentration [kinetin 0.1 mg l -1 + BAP 0; 1; 1.5; dan 2 mg l -1 ]; 3 to find the best perform of rootlet using several concentration of IBA [kinetin 0.1 mg l -1 + IBA 0; 1; 1.5; dan 2 mg l -1 ]. The study was conducted using factorial design with Randomized Completely Design, with10 replicates. The first factor were: several culture media, and the second factor were sugarcane varieties cv. Triton, cv. PSJT 94-41, and cv. PA 175. Data were analyzed by Duncan’s Multiple Range Test DMRT 5 . Best callus induction from 3 clones of sugarcane was observed on medium containing 3 mg l -1 2.4 D. The optimum callusing medium for Triton cv, PSJT 94- 41 cv. and PA 175 cv. respectively: 3,38; 3,79 and 2.85 mg l -1 mg l -1 2.4 D. Shoot performing of sugarcane using modified MS medium + kinetin 0.1 mg l -1 + BAP 0.5; 1.0 ; 1.5; 2.0 mg l -1 . Shoot started with the appeareance of green dot on callus within a week on regeneration medium. The best shootlet medium of three clones of sugarcane was MS + kinetin 0.1 mg l -1 + BAP 0.5 mg l -1 . The best rootlet medium of three clones of sugarcane was MS + kinetin 0.1 mg l -1 + IBA 1.5 mg l -1 . Key words: Sugarcane, regeneration, in vitro PENDAHULUAN Teknik in vitro merupakan salah satu alternatif untuk perbanyakan mikro yang dapat mengembalikan sel menjadi tanaman lengkap perlu lingkungan yang tepat Gunawan 1987; Triatminingsih et al. 2001 melalui pengontrolan kondisi lingkungan tempat tumbuh individu mini sesuai dengan keperluan Haris dan Mathius 1995. Sejalan dengan perkembangan bioteknologi, memungkinkan untuk memasukkan gen-gen asing ke dalam suatu sel atau organ tanaman. Kultur jaringan merupakan bagian dari bioteknologi yang kerap digunakan dalam proses transformasi genetik. Sel-sel atau organ tanaman transgenik hasil rekayasa genetika tersebut dapat diregenerasikan menjadi tanaman utuh melalui teknik kultur jaringan. Morfogenesis dan regenerasi eksplan sebagai sumber bahan tanam dalam kultur jaringan tergantung dari Zat Pengatur Tumbuh ZPT yang diberikan dalam media. ZPT memegang peranan penting, dimana keseimbangan antara auksin dan sitokinin pada media akan menentukan jenis organ yang terbentuk. Bila nisbah auksin dan sitokinin tinggi, maka organ akar yang terbentuk; sedangkan bila sebaliknya maka tunas yang akan terbentuk. Peranan penting auksin dan sitokinin adalah untuk memprogram kembali sel somatik yang akan menentukan tahap dediferensiasi, diferensiasi dan organogenesis selanjutnya Gaba 2005. Jalur morfogenesis dan regenerasi eksplan pada tebu umumnya melalui organogenesis bukan embriogenesis. Proses organogenesis tersebut melalui tahapan pembentukan kalus, induksi tunas dan induksi akar dari tunas menjadi plantlet yang sempurna. Induksi kalus tanaman tebu dapat dilakukan dengan menambahkan 3 mg l -1 2.4 D ke dalam media MS, dan kalus yang dihasilkan secara morfologi menghasilkan 2 tipe kalus tipe A dan B. Tipe A memiliki ciri warna putih kekuningan, kompak, kering dan nodular; dan tipe B memiliki penampakan ‘globular’ agak putih, tidak kompak dan basah Khatri et al. 2002. Sumber eksplan untuk menghasilkan kalus bisa berasal dari pucuk, jaringan daun dan bunga tebu yang dikulturkan dalam media setidaknya selama 1 bulan Alexander 1973. Berdasarkan hasil penelitian Khatri et al. 2002 untuk menginduksi tunas tebu dapat dilakukan dengan pemberian 2 mg l -1 IBA + 2 mg l -1 IAA dan 2 mg l -1 kinetin pada media MS. Regenerasi dimulai dengan tampaknya titik hijau dari kalus setelah seminggu dalam media regenerasi, dan umumnya menghasilkan batang dan daun yang normal. Gallo-Meagher 2000 menginduksi pembentukan akar tebu dengan menambahkan 19.7 μM indole-3-butyric acid IBA ke dalam media. Sementara, Khatri et al. 2002 melakukan penelitian dengan menggunakan media MS yang ditambahkan IBA 1 mg l -1 dan sukrosa 6 untuk menginduksi perakaran pada tebu. Baksha et al. 2002 menginduksi pembentukan akar pada tanaman tebu dengan menggunakan ½ MS yang ditambahkan 5.0 mg l -1 NAA, IBA and IAA. Paparan di atas menunjukkan ZPT yang diberikan akan memberikan pengaruh yang berbeda terhadap pertumbuhan dan perkembangan eksplan tebu. Mengingat hal tersebut, sangatlah penting untuk dipelajari konsentrasi ZPT yang tepat dan interaksi antara kultivar tebu yang digunakan guna mendapatkan pembentukan dan pertumbuhan kalus, tunas dan akar yang baik. Tujuan penelitian ini adalah: 1 mengkaji konsentrasi 2.4 D yang terbaik untuk pembentukan kalus pada cv. Triton, cv. PSJT 94-41. dan cv. PA 175; 2 mengkaji konsentrasi BAP yang terbaik untuk pembentukan tunas pada cv. Triton, cv. PSJT 94-41 dan cv. PA 175; dan 3 mengkaji konsentrasi IBA yang terbaik untuk pembentukan akar pada tebu cv. Triton, cv. PSJT 94-41dan cv. PA 175. BAHAN DAN METODE Penelitian ini menggunakan pucuk tebu sebagai sumber eksplan dari 3 kultivar tebu yaitu: cv. Triton V 1 , cv. PSJT 94-41 V 2 , dan cv. PA 175 V 3 . Adapun cara pembuatan media dan komposisi bahan kimia media yang digunakan dalam penelitian ini dapat dilihat pada Lampiran 1 dan 2. Penelitian regenerasi tebu secara in vitro ini terdiri dari 3 tahap yaitu: inisiasi kalus, inisiasi tunas, dan inisiasi akar. Data yang diperoleh dianalisis dengan sidik ragam dan dilanjutkan dengan DMRT Duncan’s Multiple Range Test pada taraf 5 , sejauh yang dapat dilakukan analisis statistika. Data lainnya dianalisis dengan melakukan banding sederhana serta perhitungan secara persentase. A Inisiasi kalus Tebu cv. Triton, cv. PA 175, dan cv. PSJT 94-41 diambil pucuknya yang masih menggulung. Pucuk tersebut dipotong 20 cm tepat di atas jaringan meristem. Sterilisasi dilakukan dengan pencelupan dalam alkohol 70 dan dibakar di atas nyala api spiritus. Sterilisasi ini diulang sampai 3 kali dengan membuka dan membuang lapis pucuk daun hingga diperoleh daun muda yang masih menggulung. Eksplan dipotong dengan ukuran 2–3 mm, dan ditanam pada media MS dengan variasi pemberian ZPT sesuai dengan perlakuan. Setiap botol kultur berisi 5 potong eksplan yang kemudian diinkubasikan dalam ruang kultur dengan cahaya 2000 lux dan suhu 20 o C selama 4-6 minggu. Rancangan yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap RAL secara faktorial dengan 2 faktor. Faktor pertama adalah kultivar tebu V: cv. Triton V 1 , cv. PSJT 94-41 V 2 , dan cv. PA 175 V 3 . Faktor ke-2 adalah modifikasi media padat MS dengan variasi penambahan 2.4-D Z: 0.1 mg l -1 kinetin + 1 mg l -1 2.4 D Z 1 ; 0.1 mg l -1 kinetin + 2 mg l -1 2.4 D Z 2 ; 0.1 mg l -1 kinetin + 3 mg l -1 2.4 D Z 3 ; 0.1 mg l -1 kinetin + 4 mg l -1 2.4 D Z 4 . Perlakuan diulang 10 kali. Keseluruhannya berjumlah 120 satuan percobaan. Setiap satuan percobaan terdiri dari 4 botol eksplan yang langsung menjadi satuan pengamatan, jadi keseluruhannya adalah 480 botol kultur. Peubah yang diamati pada minggu ke-6 adalah: persentase eksplan yang menghasilkan kalus per botol, struktur dan warna kalus, dan diameter kalus. B Inisiasi tunas Sumber eksplan berasal berasal dari kalus tipe A hasil sub kultur ke-1 hingga ke-2. Kalus diambil dengan ukuran yang seragam dan dikulturkan ke media yang sesuai dengan perlakuan. Setiap botol kultur berisi 4 kalus per botol dengan diameter ± 0.5 cm yang kemudian diinkubasikan dalam ruang kultur dengan cahaya 2000 lux dan suhu 20 o C selama 4 minggu. Rancangan percobaan adalah Rancangan Acak Lengkap RAL yang disusun secara faktorial dengan 2 faktor. Faktor pertama adalah kultivar tebu V yaitu cv. Triton V 1 , cv. PSJT 94-41 V 2 , dan cv. PA 175 V 3 . Faktor ke-2 adalah variasi pemberian BAP pada media padat MS U yaitu: 0.1 mg l -1 kinetin + 0.5 mg l -1 BAP U 1 ; 0.1 mg l -1 kinetin + 1.0 mg l -1 BAP U 2 ; 0.1 mg l -1 kinetin + 1.5 mg l -1 BAP U 3 ; dan 0.1 mg l -1 kinetin + 2.0 mg l -1 BAP U 4 . Perlakuan diulang 10 kali. Keseluruhannya berjumlah 120 satuan percobaan. Setiap satuan percobaan terdiri 4 botol eksplan yang langsung menjadi satuan pengamatan, jadi keseluruhannya adalah 480 botol kultur. Peubah yang diamati adalah: persentase eksplan yang menghasilkan tunas, tinggi tunas dan jumlah tunas yang diukur pada minggu ke-6 minggu setelah kultur. C Inisiasi akar Eksplan yang digunakan berasal dari tunas in vitro yang sudah dipisahkan dari rumpunnya dengan ukuran yang seragam, dan berasal dari perlakuan 0.1 mg l -1 kinetin + 1.0-1.5 mg l -1 BA. Eksplan tersebut kemudian dikulturkan 1 tunas per botol. Rancangan yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap RAL yang disusun secara faktorial dengan 2 faktor. Faktor pertama adalah kultivar tebu V yaitu cv. Triton V 1 , cv. PSJT 94-41 V 2 , dan cv. PA 175 V 3 . Faktor ke-2 adalah modifikasi komposisi media padat MS dengan variasi penambahan IBA Q1 yaitu: dan 0.1 mg l -1 kinetin + IBA 0.5 mg l -1 Q 1 ; 0.1 mg l -1 kinetin + IBA 1.0 mg l -1 Q 2 ; 0.1 mg l -1 kinetin + IBA 1.5 mg l -1 Q 3 ; dan 0.1 mg l -1 kinetin + IBA 2.0 mg l -1 Q 4 Perlakuan diulang 10 kali. Keseluruhannya berjumlah 120 satuan percobaan. Setiap satuan percobaan terdiri 4 botol eksplan yang langsung menjadi satuan pengamatan, jadi keseluruhannya adalah 480 botol kultur. Tiap botol berisi satu eksplan yang diinduksikan perakarannya. Peubah yang diamati adalah: persentase eksplan yang membentuk akar, jumlah akar per tunas, panjang akar terpanjang per tunas yang diamati pada rusia 4 minggu. Ruang kultur diatur dengan cahaya 2000 lux dan suhu 20 o C.

BAB IV PENYISIPAN GEN FITASE PADA TANAMAN TEBU MELALUI Agrobacterium tumefaciens GV 2260