28 A260A280 pada UV-1700 spektrofotometer di dalam sampel pangan keju mozarela yang kaya
akan lemak dan kalsium sebagai inhibitor dimana inhibitor tersebut juga terkandung pada susu UHT sebagai sampel pangan yang diuji pada penelitian ini. Penelitian Amagliani et al. 2006
tersebut menunjukkan bahwa metode pendidihan menghasilkan kemurnian isolat DNA yang kurang baik dimana nilai rasio A260A280 lebih rendah dari 1,8.
Hal tersebut terbukti pada pengujian kuantifikasi Salmonella Typhimurium dengan real-time PCR yang akan dibahas pada sub bab selanjutnya. Walaupun terdapat inhibitor di dalam isolat
DNA yang diisolasidiekstraksi dengan metode pendidihan, tetapi isolat tersebut masih dapat teramplifikasi contohnya pada pengujian penentuan spesifisitas primer InvA yang digunakan dan
juga pada pengujian penentuan konsentrasi primer yang tepat dimana akan dibahas pada sub bab selanjutnya.
2. IsolasiEkstraksi DNA dengan Kit Komersial
Keberadaan inhibitor baik dalam media kultur murni maupun dalam sampel pangan dapat menghambat proses amplifikasi dengan real-time PCR. Untuk mengatasinya, Chen et al. 1997
diacu dalam Lee et al. 2006 menggunakan metode kit komersial dalam proses isolasiekstraksi DNA Salmonella dari sampel susu nonpasteurisasi raw milk, selain itu juga menggunakan
proses pengayaan dan sentrifugasi untuk tahapan memanenmengambil patogen. Begitu juga Omiccioli et al. 2009 dimana melakukan hal yang sama, namun menggunakan merk kit
komersial yang berbeda. Isolattemplate DNA yang dihasilkan diuji tingkat kemurniannya dengan menggunakan spektrofotometer dimana prinsipnya sama dengan pengukuran isolat DNA metode
pendidihan. Hasil pengujiannya dapat dilihat pada Tabel 3. di bawah ini. Tabel 3. Kemurnian isolat DNA Salmonella Typhimurium dan Shigella sonnei
dengan metode kit komersial
Sampel A1
260 A2
280 Rasio
A1A2 [DNA]
ngµl [Protein]
ngµl
KM ST 0,047
0,029 2,0
1,610 -0,034
KM SS 0,003
0,001 2,0
0,180 0,075
Spike ST
0,036 0,021
2,1 1,305
-0,162
Ket: KM ST Kultur Murni Salmonella Typhimurium; KM SS Kultur Murni Shigella sonnei; Spike ST Sampel susu UHT spike Salmonella Typhimurium
Hasil pengukuran tersebut menunjukkan bahwa isolat DNA ketiga sampel yaitu kultur murni Salmonella
Typhimurium, kultur murni Shigella sonnei, dan sampel susu UHT spike Salmonella Typhimurium memiliki nilai rasio yang diharapkan yaitu berada pada selang 1,8-2,0. Hal tersebut
menunjukkan bahwa kemurnian ketiga isolat DNA sangat baik, namun pada sampel susu UHT spike Salmonella Typhimurium, nilai rasio yang dihasilkan sedikit melebihi 2,0. Jika nilai rasio
yang dihasilkan melebihi 2,0 maka, hal tersebut mengindikasikan bahwa isolat DNA tidak mengandungterkontaminasi protein tetapi masih mengandung RNA di dalamnya Anonoim
2007. Sedangkan kultur murni Salmonella Typhimurium dan kultur murni Shigella sonnei menghasilkan nilai rasio tepat 2,0 dan konsentrasi protein yang dihasilkan pun sangat rendah jika
dibandingkan dengan isolat kultur murni Shigella sonnei yang diisolasidiekstraksi dengan metode pendidihan. Hal ini menunjukkan bahwa metode isolasi dengan menggunakan kit
komersial menghasilkan isolat DNA yang jauh lebih murni dibandingkan dengan metode
29 pendidihan yang dilakukan. Hal tersebut dikarenakan metode kit komersial memiliki prinsip
metode dengan perlakuan proteinase K yang diikuti dengan pengikatan DNA pada membran gel silikafilter sehingga kontaminan akan turunterpisah ke dalam spin columncollection tube
Dauphin et al. 2009. Hasil isolasiekstraksi DNA pada penelitian ini sesuai dengan penelitian yang dilakukan oleh
Amagliani et al. 2006 yang membandingkan metode isolasiekstraksi DNA dengan cara pendidihan dan dengan kit komersial DNeasy Tissue Kit Qiagen. Penelitian Amagliani et al.
2006 tersebut menunjukkan bahwa nilai rasio pada isolat DNA yang dihasilkan dengan DNeasy Tissue Kit Qiagen dimana memiliki tingkat kemurnian yang kurang baik bahkan lebih jelek
dibanding dengan metode pendidihan, namun tidak pada penelitian yang dilakukan dimana isolattemplate DNA yang dihasilkan dengan kit komersial QIAamp
®
DNA Blood Mini Kit Qiagen menghasilkan isolattemplate DNA yang lebih murni dibanding dengan metode
pendidihan. Hal tersebut dapat dikarenakan pengaruh modifikasi metode kit komersial yang dilakukan pada penelitian ini dari metode sesungguhnya yang berdasarkan petunjuk produser kit
terkait. Penelitian Amagliani et al. 2006 juga menunjukkan konsentrasiyield DNA yang dihasilkan
dengan metode pendidihan lebih besar dibandingkan dengan metode kit komersial. Hal tersebut juga sesuai dengan penelitian ini dimana konsentrasi DNA kultur murni Salmonella Typhimurium
dan kultur murni Shigella sonnei yang diperoleh dengan metode pendidihan lebih besar dibandingkan dengan metode kit komersial, namun tidak terjadi pada sampel susu UHT spike
dimana konsentrasiyield DNA yang dihasilkan lebih besar dengan metode kit komersial dibandingkan dengan metode pendidihan. Hal tersebut dapat menunjukkan bahwa DNA
Salmonella Typhimurium lebih mudah diisolasidiekstraksi dari sampel susu UHT dengan
menggunakan metode kit komersial yang dimodifikasi. Hal yang sama juga ditunjukkan pada penelitian Dauphin et al. 2009 dimana
membandingkan kemurnian isolattemplate DNA yang dihasilkan dengan berbagai macam kit salah satunya adalah QIAamp
®
DNA Blood Mini Kit Qiagen dimana kit tersebut juga digunakan pada penelitian ini. Penelitian yang dilakukan oleh Dauphin et al. 2009 menunjukkan
bahwa isolattemplate DNA yang dihasilkan dengan kit QIAamp
®
DNA Blood Mini Kit Qiagen memiliki kemurnian yang kurang baik dimana nilai rasio A260A280 lebih kecil dari 1,8 sehingga
menandakan bahwa isolat DNA tersebut masih mengandung inhibitorpengotor. Hal tersebut tidak sesuai dengan kemurnian yang dihasilkan dari penelitian ini dimana menghasilkan
isolattemplate DNA dengan kemurnian yang baik. Hal tersebut menunjukkan bahwa modifikasi dengan penambahan CTAB terhadap metode yang berasal dari produsen berkait memperbaiki
hasil kemurnian isolat DNA menjadi lebih baik.
D. Hasil Penentuan Konsentrasi Primer
