22 dihomogenkan dengan vortex kemudian diinkubasi selama 20 menit pada suhu 65
o
C. Setelah itu, ditambahkan buffer AL sebanyak 300 µl dan dihomogenkan dengan vortex.
Suspensi diinkubasi selama 10 menit di dalam water bath pada suhu 65
o
C. Setelah itu, ditambahkan 500 µl etanol 96-100, dihomogenkan dengan vortex dan disentrifus
selama 2 menit dengan kecepatan 10000 rpm. Supernatan yang dihasilkan dipipet dan dimasukkan ke dalam kolom mini yang sudah dipasang pada collection tube, kemudian
disentrifus 8000 rpm selama 1 menit. Sebanyak 500 µl buffer AW1 ditambahkan ke dalam kolom mini yang masih terpasang pada collection tube dan disentrifus 8000 rpm
selama 1 menit. Tahap selanjutnya adalah kolom mini dipindahkan ke dalam collection tube yang
baru dan ditambahkan dengan 500 µl buffer AW2 ke dalam kolom mini, kemudian disentrifus 13000 rpm selama 3 menit. Kolom mini dipindahkan kembali ke dalam
collection tube dan disentrifus kembali selama 1 menit 13000 rpm. Kolom mini
dipindahkan ke dalam tabung mikrosentrifus steril dan ditambahkan ke dalamnya sebanyak 80 µl buffer AE yang kemudian disentrifus 8000 rpm selama 1 menit.
Supernatan yang diperoleh pada tabung mikrosentrifus merupakan isolat DNA yang akan digunakan pada tahap selanjutnya dan isolat tersebut disimpan pada freezer dengan
sehu 20
o
C. Diagram alir proses ini dapat dilihat pada Lampiran 4. Kemudian kemurnian isolat DNA yang dihasilkan dapat diketahui dengan mengukurnya pada
spektrofotometer. Gambar penggunaan kolom mini dan collection tube dapat dilihat pada gambar berikut ini Gambar 10..
a b
Gambar 10. Proses isolasiekstraksi DNA dengan menggunakan metode kit
komersial, a penambahan buffer AW1 ke dalam kolom mini, b hasil sentrifugasi setelah penambahan AW1 dan supernatan yang
terdapat di bawah dibuang untuk selanjutnya filter dicuci kembali dengan buffer AW2.
4. Pengujian Salmonella Typhimurium dengan Real-Time PCR
Penggunaan real-time PCR dilakukan dengan membuat master mix terlebih dahulu kemudian diamplifikasi dengan memasukkan master mix tersebut ke dalam alat real-time
PCR.
a Pembuatan Master Mix
Master mix untuk pengujian dengan real-time PCR terdiri dari 7 µl buffer TE, 10 µl SsoFast
TM
EvaGreen
®
Supermix terdiri dari 2x reaction buffer dengan dNTPs, Sso7d- fusion polymerase, MgCl
2
, EvaGreen dye, dan penstabil, dan masing-masing 0,5 µl filter pada
kolom mini
23 reverse
dan forward primer InvA pada konsentrasi tertentu. Volume master mix keseluruhan untuk pengujian satu jenis template DNA adalah 18 µl. Bahan-bahan untuk
membuat master mix tersebut dicampur dalam satu tabung mikrosentrifus 2 ml dan dihomogenkan dengan vortex. Untuk melakukan pengujian beberapa jenis template
DNA, maka volume masing-masing bahan dikali dengan banyaknya jenis template DNA yang akan diuji pada real-time PCR dan dicampur di dalam tabung mikrosentrifus.
Kemudian masing-masing 18 µl campuran master mix yang telah dibuat pada tabung mikrosentrifus tersebut diambil dan dimasukkan kedalam setiap well yang kemudian
ditambahkan dengan 2 µl template DNA yang selanjutnya dihomogenkan pada MixMate PCR 96 dan dimasukkan pada alat real-time PCR.
b Amplifikasi dengan real-time PCR
Masing-masing sebanyak 18 µl master mix dan 2 µl templateisolat DNA yang telah dibuat dimasukkan ke dalam setiap well pada plate 96 Well Reaction. Kemudian well
ditutup dengan PCR Sealer
TM
Microseal
®
‘B’ Film dan dihomogenkan dengan
menggunakan MixMate PCR 96. Well dimasukkan ke dalam real-time PCR yang telah diatur dengan protokol PCR tertentu. Protokol PCR yang digunakan adalah pre-
denaturasi pada suhu 95
o
C selama 1 menit, diikuti dengan 35 siklus denaturasi pada suhu 95
o
C selama 30 detik dan annealing pada suhu 58.1
o
C selama 1 menit. Primer elongasi dilakukan pada suhu 72
o
C selama 1 menit 30 detik dan final elongasi selama 10 menit pada suhu 72
o
C. Analisis melting curve dari produk akhir PCR dilakukan sebanyak 81 siklus pada suhu 55
o
C selama 10 detik. Kemudian dilakukan running dengan real-time PCR.
5. Penentuan Konsentrasi Primer
