11 menggandakan DNA pada daerah tertentu sepanjang maksimum 10000 bp, dan dengan teknik
tertentu bisa sampai 40000 bp. Primer dirancang untuk memiliki sekuen yang komplemen dengan
template DNA, sehingga dirancang agar menempel mengapit daerah tertentu yang diinginkan. Langkah pertama dalam perancangan primer adalah mencarimembuat urutan DNAgen yang
diinginkan, umumnya dapat menggunakan basis data umum seperti NCBI. Setelah urutan DNAgen yang diinginkan diperoleh, kemudian software untuk merancang primer digunakan
untuk mempermudah dan memaksimalkan keberhasilan dalam merancang primer. Langkah berikutnya adalah mempertimbangkan dengan hati-hati daerah gen yang akan digunakan sebagai
template DNA. Gen yang memiliki struktur sekunder atau urutan nukleotida yang panjang harus dihindari dalam perancangan primer Pestana et al. 2010.
Besarnya konsentrasi dari primer yang digunakan merupakan hal yang menentukan keberhasilan pengujian. Jika konsentrasi primer pada pengujian dengan real-time PCR yang
digunakan terlalu tinggi, maka akan meningkatkan kesempatan untuk terjadinya mispriming yang artinya akan menghasilkan produk PCR yang tidak spesifik karena primer berikatan tidak hanya
dengan gen target, tetapi dengan gen-gen lainnya pada template DNA yang ditambahkan Pestana et al.
2010, namun jika konsentrasi primer yang digunakan terlalu rendah, maka akan dihasilkan suatu metode pengujian yang tidak sensitif yang menyebabkan terjadinya false-negative dimana
sampel yang positif mengandung gen target akan terdeteksi negatif Lee et al. 2006. Oleh karena itu penentuan konsentrasi primer sangat dibutuhkan dalam pengujian dengan real-time
PCR.
2. dNTP deoxynucleoside triphosphate
dNTP atau building blocks sebagai ‘batu bata’ penyusun DNA yang baru. dNTP terdiri atas empat macam sesuai dengan basa penyusun DNA, yaitu dATP, dCTP, dGTP dan dTTP.
3. Buffer PCR
Buffer yang biasanya terdiri atas bahan-bahan kimia untuk mengkondisikan reaksi agar berjalan optimum dan menstabilkan enzim DNA polimerase.
4. Kofaktor
Kofaktor berfungsi untuk meningkatkan jumlah akhir dari reaksi. Kofaktor tersebut berupa Ion logam bivalen, umumnya magnesium klorida Mg
2+
, sebagai kofaktor bagi enzim DNA polimerase. Tanpa ion ini enzim DNA polimerase tidak dapat bekerja Pestana et al. 2010.
Prinsip amplifikasi real-time PCR sama dengan PCR standar, hanya saja pada real-time PCR ditambahkan label berfluoresensi fluoresence dye sehingga penggunaan teknik real-time PCR lebih
efisien dan efektif dibandingkan PCR standar Edward et al. 2004. Terdapat dua jenis komponen label berfluoresensi yang umum digunakan dalam proses real-time PCR, diantaranya adalah label
yang berikatan dengan DNA DNA binding dyes dan komponen kimia yang berbasiskan probe Probe-based chemistries.
Salah satu contoh label yang berikatan dengan DNA adalah SYBR
®
green I dimana label tersebut merupakan label yang tidak spesifik dan akan berikatan dengan semua jenis DNA utas ganda.
Sedangkan contoh komponen kimia yang berbasiskan probe adalah TaqMan, Molecular Beacon, dan Scorpion yang merupakan susunansekuen probe yang spesifik. Prinsip dari probe tersebut adalah
dengan menggunakan keberadaan dari transfer energi resonansi fluoresensiFluorescence Resonance Energy Transfer
FRET probe sebagai sistem pelaporanpengukuran, dan aktivitas 5 exonuclease
12 dari DNA polimerase untuk mendeteksi proses amplifikasi yang terjadi di dalam real-time PCR
Pestana et al. 2010.
1. DNA Binding Dyes, SYBR
®
green I
Keuntungan dari SYBR
®
green I adalah mengukur intensitas fluoresen secara proporsional sesuai dengan produk PCR yang dihasilkan. Sedangkan kekurangannya adalah SYBR
®
green I yang merupakan label fluoresen yang tidak spesifik sehingga dapat menghasilkan sinyal
pengujian false-positive karena terjadinya primer-dimer atau terbentuknya produk yang tidak spesifik oleh karena itu setiap pengujian, penting dilakukannya penganalisisan formasi dari kurva
pelelehan melting curve Pestana et al. 2010. SYBR
®
green I merupakan label fluoresen yang efektif dari segi biaya jika dibandingkan dengan komponen label kimia lainnya dan juga mudah digunakan. Penentuan konsentrasi primer
yang tepatoptimum dapat dengan mudah dicapai dengan menggunakan SYBR
®
green I sebagai bahan fluoresen dibandingkan dengan menggunakan bahan yang lainnya seperti TaqMan dan
Molecular Beacon. Ketika SYBR
®
green I berada dalam kondisi bebas dalam larutan, maka akan menunjukkan level fluoresen yang relatif rendah, tetapi ketika dsDNA ditambahkan, fluoresen
yang berpendar akan meningkat lebih dari 1000 kali lipat. Akumulasi dari amplikonproduk amplifikasi PCR meningkat seiring dengan meningkatnya siklus reaksi, maka intensitas fluoresen
juga akan meningkat karena molekul SYBR
®
green I berikatan dengan DNA, dan kemudian akumulasi dari produk yang dihasilkan dapat diukur dalam real-time PCR. SYBR
®
green I dapat berikatan dengan DNA utas ganda pada suhu 55
o
C, namun pada suhu suhu 95
o
C SYBR
®
green I akan terdisosiasiterlepas dari DNA utas ganda. Hal tersebut dapat dilihat pada Gambar 4. berikut
ini.
Gambar 4. DNA binding dyes dalam real-time PCR. Fluoresen secara dramatis meningkat ketika molekul dye berikatan dengan DNA Pestana et al. 2010
Sensitifitas deteksi dengan menggunakan SYBR
®
green I dipengaruhi oleh pembentukan primer-dimer, spesifisitas primer yang rendah, konsentrasi primer dapat membatasi, dan
terbentuknya struktur sekunder pada produk PCR. Semua faktor tersebut dapat mengarahkan pada terbentuknya produk DNA utas ganda yang tidak diharapkan yang dapat berikatan dengan
SYBR
®
green I dan menghasilkan sinyal fluoresen. Telah dijelaskan sebelumnya bahwa SYBR
®
green I tidak dapat membedakan satu DNA dengan DNA yang lainnya, oleh karena itu penting untuk menganalisis kurva pelelehan pada akhir pengujian dengan real-time PCR Pestana et al.
2010.
13
2. Probe-Based Chemistry
