Alat-alat Bahan-bahan Bagan Skrining Fitokimia

BAB 3 METODE PENELITIAN

3.1 Alat-alat

1. Spektrofotometer 1 H-NMR JeolDelta2NMR 500MHz 2. Spektrofotometer FT-IR Shimadzu 3. Spektrofotometer UV-Vis 4. Kolom Kromatografi 5. Rotarievapotaror Bűchi -114 6. Labu rotarievaporator 1000 mL Schoot Duran 7. Lampu UV 254nm356nm UVGL 58 8. Neraca Analitis Mettler AE 200 9. Chamber 10. Ekstraktor 5000 mL SchootDuran 11. Alat destilasi 12. Labu takar 250 mL Pyrex 13. Corong Pisah 1000 mL Pyrex 14. Gelas Beaker 500mL1000mL Pyrex 15. Gelas Erlenmeyer 250 mL Pyrex 16. Penangas air 17. Corong Kaca 18. Gelas Ukur 100 mL 10 mL Pyrex 19. Spatula 20. Pipa Kapiler 21. Statif dan Klem 22. Tabung Reaksi Pyrex 23. Pipet Tetes 24. Botol Vial 12 mL 25. Batang Pengaduk Universitas Sumatera Utara

3.2 Bahan-bahan

1. Daun Jambu Biji Australia 2. Metanol Destilasi 3. Etil asetat Teknis 4. Aquadest 5. n-Heksana Teknis 6. Silika gel 40 70-230 mesh ASTM E.Merck. KgA 7. FeCl 3 5 8. NaOH 10 9. Serbuk Mg 10. HCl p 11. H 2 SO 4p 12. Pereaksi Benedict 13. HCl 6 14. Kapas 15. Kloroform Teknis 16. Plat KLT silika gel 60 F 254 E.Merck.Art 554 17. Plat KLT Preparatif 60 F 254 18. Benzena p.a. E. Merck 19. Aseton p.a. E. Merck

3.3 Prosedur Penelitian

3.3.1 Penyediaan Sampel

Sampel yang diteliti adalah daun tumbuhan jambu biji Australia Psidium guajava L yang diperoleh dari Jln.Bunga Terompet Koserna Medan Selayang. Daun tumbuhan jambu biji Australia dikeringkan di udara terbuka, lalu dihaluskan sampai diperoleh serbuk daun jambu biji Australia sebanyak 1050 g. Universitas Sumatera Utara

3.3.2 Uji Pendahuluan Terhadap Ekstrak Daun Jambu Biji Australia

Serbuk daun jambu biji Australia diidentifikasi dengan menggunakan cara skrining fitokimia. Untuk membuktikan adanya senyawa flavonoida yang terdapat dalam daun jambu biji Australia maka dilakukan uji pendahuluan secara kualitatif dengan reaksi warna sebagai berikut: 1. Dimasukkan 10 gram serbuk daun jambu biji Australia yang telah dikeringkan ke dalam dua gelas Erlenmeyer 2. Ditambahkan 100 mL metanol ke dalam gelas Erlenmeyer I, dan 100 mL etil asetat ke dalam gelas Erlenmeyer II 3. Didiamkan selama 24 jam 4. Didekantasi 5. Dibagi masing-masing ekstrak sampel ke dalam 3 tabung reaksi 6. Ditambahkan masing-masing pereaksi - Untuk ekstrak metanol sampel a. Tabung I : dengan FeCl 3 5 menghasilkan larutan berwarna hitam b. Tabung II : dengan serbuk Mg, dan HCl p menghasilkan larutan merah muda c. Tabung III : dengan H 2 SO 4p menghasilkan larutan orange kekuningan - Untuk ekstrak etil asetat sampel a. Tabung I : dengan FeCl 3 5 menghasilkan larutan berwarna hitam b. Tabung II : dengan serbuk Mg, dan HCl p menghasilkan larutan merah muda c. Tabung III : dengan H 2 SO 4p menghasilkan larutan orange kekuningan

3.3.3 Ekstraksi Daun Jambu Biji Australia

Serbuk daun jambu biji Australia ditimbang sebanyak 1050 g, kemudian dimaserasi dengan metanol sebanyak 5 L sampai sampel terendam seluruhnya dan dibiarkan selama ± 24 jam. Maserat ditampung dan dipekatkan sehingga diperoleh ekstrak pekat metanol. Lalu dilakukan pemisahan tanin dengan cara melarutkan Universitas Sumatera Utara fraksi pekat metanol dengan etil asetat, dan disaring. Filtrat kemudian diuapkan hingga semua pelarut etil asetat menguap. Lalu fraksi pekat etil asetat dilarutkan dengan metanol kemudian diekstraksi partisi dengan n-heksana sampai lapisan n-heksana bening. Lapisan metanol dipisahkan dari lapisan n-heksana, lalu dipekatkan sehingga diperoleh ektrak pekat lapisan metanol. Fraksi metanol di uji kandungan gula dengan pereaksi Benedict, lalu dihidrolisis dengan menggunakan HCl 2 N sambil dipanaskan diatas penangas air selama ± 1 jam. Kemudian disaring dan filtrat yang diperoleh diektraksi partisi dengan kloroform sebanyak 3 kali. Ekstrak kloroform dipekatkan sehingga diperoleh ekstrak pekat kloroform sebanyak 1 g.

3.3.4 Analisis Kromatografi Lapis Tipis

Analisis Kromatografi Lapis Tipis dilakukan terhadap ekstrak pekat kloroform dengan menggunakan fasa diam silika gel 60 F 254 Merck. Analisis ini dimaksudkan untuk mencari pelarut yang sesuai didalam analisis kromatografi kolom. Fasa gerak yang digunakan adalah campuran n-heksan:etil asetat dengan perbandingan 90:10 ⁄ , 80:20 ⁄ , 70:30 ⁄ , 60:40 ⁄ dan 50:50 ⁄ . Dimasukkan 10 ml larutan fasa gerak n-heksana : etil asetat 90:10 ⁄ kedalam bejana kromatografi, kemudian dijenuhkan. Ditotolkan ekstrak pekat kloroform pada plat KLT yang telah diaktifkan. Dimasukkan plat kedalam bejana yang telah berisi pelarut yang telah dijenuhkan, lalu ditutup dan dielusi hingga pelarut mencapai batas yang telah ditentukan. Plat yang telah dielusi dikeluarkan dari bejana, lalu dikeringkan dan difiksasi dengan pereaksi FeCl 3 5. Diamati warna bercak yang timbul dan dihitung harga Rf yang diperoleh. Perlakuan yang sama dilakukan untuk perbandingan pelarut n-heksana:etil asetat dengan perbandingan 80:20 ⁄ , 70:30 ⁄ , 60:40 ⁄ dan 50:50 ⁄ . Universitas Sumatera Utara

3.3.5 Isolasi Senyawa Flavonoida dengan Kromatografi Kolom

Isolasi senyawa flavonoida secara kromatografi kolom dilakukan terhadap ekstrak pekat kloroform yang telah diperoleh. Fasa diam yang digunakan adalah silika gel 60 G0.063-0.200 mm dan fasa gerak yaitu n-heksana 100, campuran pelarut n- heksana:etil asetat dengan perbandingan 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50 vv. Terlebih dahulu dirangkai alat kromatografi kolom. Kemudian dibuburkan silika gel 60 G 0.063-0.200 mm sebanyak 40 g dengan menggunakan n-heksana, diaduk-aduk hingga homogen lalu dimasukkan ke dalam kolom kromatografi secara perlahan-lahan. Kemudian dielusi dengan menggunakan n-heksana 100 hingga silika gel padat dan homogen. Dibuburkan 1 g ekstrak pekat kloroform daun jambu biji Australia yang telah diperoleh dengan silika gel, kemudian dimasukkan ke dalam kolom kromatografi yang telah berisi bubur silika gel, lalu ditambahkan fasa gerak n-heksana:etil asetat 90:10 vv secara perlahan-lahan dan diatur agar aliran fasa yang keluar dari kolom sama banyaknya dengan penambahan fasa gerak dari atas. Ditingkatkan kepolaran dengan menambahkan fasa gerak n-heksana:etil asetat dengan perbandingan 80:20 vv, 70:30 vv, dan 60:40 vv 50:50 vv. Hasil yang diperoleh ditampung dalam botol vial sebanyak 10 mL, lalu di KLT dan digabung fraksi dengan harga Rf yang sama lalu diuji dengan FeCl 3 5. Kemudian diuapkan sampai terbentuk pasta.

3.3.6 Pemurnian

Senyawa yang diperoleh dari hasil isolasi dimurnikan dengan melarutkan kembali pasta yang diperoleh dengan pelarut etil asetat, diaduk hingga semua pasta larut sempurna. Kemudian ditambahkan n-heksana secara perlahan-lahan melalui dinding beaker glass hingga terjadi pengendapan zat-zat pengotor di dasar wadah. Kemudian didekantasi larutan pada lapisan atas n-heksana, lalu diuapkan sisa pelarut dari pasta hingga diperoleh pasta yang bebas dari pelarut. Universitas Sumatera Utara

3.3.7 Uji Kemurnian Hasil Isolasi dengan Kromatografi Lapis Tipis KLT

Uji kemurnian pasta dilakukan dengan kromatografi lapis tipis dengan menggunakan fasa diam silika gel 60 F 254 dengan fasa gerak n-heksana : etil asetat 60:40 vv, benzena : aseton 70:30vv. Dimasukkan larutan fasa gerak ke dalam bejana kromatografi, lalu dijenuhkan. Ditotolkan pasta yang sebelumnya telah dilarutkan dengan etil asetat pada plat KLT. Dimasukkan plat KLT tersebut kedalam bejana kromatografi yang telah jenuh. Setelah pelarut fasa gerak merembes sampai batas atas, plat KLT dikeluarkan dari bejana, dikeringkan dan difiksasi dengan menggunakan pereaksi FeCl 3 5 dalam metanol akan menghasilkan bercak berwarna hitam yang menunjukkan adanya senyawa flavonoida dan dihitung harga Rf yang diperoleh. 3.3.8 Identifikasi Senyawa Hasil Isolasi 3.3.8.1 Identifikasi dengan Spektrofotometer UV-Visible Analisis dengan alat Spektrofotometer Ultraviolet-Visible UV-Vis diperoleh dari Laboratorium Kimia Bahan Alam FMIPA ITB dengan menggunakan metanol sebagai pelarut.

3.3.8.2 Identifikasi dengan Spektrofotometer Infra Merah FT-IR

Analisis dengan alat Spektrofotometer Infra Merah FT-IR diperoleh dari Laboratorium Kimia Bahan Alam FMIPA ITB menggunakan KBr sebagai pelarut.

3.3.8.3 Identifikasi dengan Spektrometer Resonansi Magnetik Inti Proton

1 H-NMR Analisis dengan alat Spektrometer 1 H-NMR diperoleh dari Laboratorium Kimia Bahan Alam FMIPA ITB dengan menggunakan Aseton sebagai pelarut. Universitas Sumatera Utara

3.4 Bagan Skrining Fitokimia

10 gram serbuk daun jambu biji australia Psidium guajava L. Diekstraksi maserasi dengan metanol Disaring Dipekatkan Dibagi kedalam 3 tabung reaksi Ditambahkan pereaksi FeCl 3 5 Diamati perubahan warna Ditambahkan pereaksi Mg-HCl Diamati perubahan warna Larutan merah muda Ditambahkan pereaksi H 2 SO 4p Diamati perubahan warna Larutan orange kekuningan Larutan Hitam Tabung III Larutan Coklat Kemerahan Tabung I Larutan Coklat Kemerahan Tabung II Larutan Coklat Kemerahan Positif Fenolik Positif Fenolik Positif Fenolik Universitas Sumatera Utara 10 gram serbuk daun jambu biji australia Psidium guajava L. Diekstraksi maserasi dengan etil asetat Disaring Dipekatkan Dibagi kedalam 3 tabung reaksi Ditambahkan pereaksi FeCl 3 5 Diamati perubahan warna Ditambahkan pereaksi Mg-HCl Diamati perubahan warna Larutan merah muda Ditambahkan pereaksi H 2 SO 4p Diamati perubahan warna Larutan orange kekuningan Larutan Hitam Tabung III Larutan Coklat Kemerahan Tabung I Larutan Coklat Kemerahan Tabung II Larutan Coklat Kemerahan Positif Flavonoid Positif Flavonoid Positif Flavonoid Universitas Sumatera Utara

3.5 Bagan Penelitian