39
presipitasi yang terbentuk di tengah-tengah agar di antara lubang PAB
1
dan serum. Tidak terbentuknya garis presipitasi menandakan di dalam serum tidak
terdapat APAB
1
.
8. Pemeriksaan Histologik Ikatan PAB
1
dan APAB
1
di Organ Hati
Organ hati ayam dan bebek yang sehat digunakan pada tahap pengamatan gambaran histologik ikatan PAB
1
dan APAB
1
di organ hati. Preparat histologik jaringan hati yang akan digunakan dalam pewarnaan imunohistokimiawi terlebih
dahulu diwarnai dengan pewarnaan hematoksilin dan eosin HE dan dilakukan pengamatan mikroskopik. Hanya preparat yang memperlihatkan jaringan yang
sehatlah yang seterusnya diwarnai dengan pewarnaan imunohistokimiawi. Pewarnaan imunisitokimiawi dilakukan dengan menggunakan alat bantu dari
Animal Research Kit
TM
ARK
TM
, DAKO, Denmark Noorden 1986; Estuningsih 2001.
Jaringan hati dicelup dalam larutan penyangga normal formalin 10. Jaringan dipotong tipis dan dikemas dalam kaset dan dilakukan proses dehidrasi
menggunakan alkohol 80, 90 dan 95. Proses penjernihan clearing dilakukan sebanyak dua kali menggunakan larutan silol silol.
Proses embedding menggunakan paraffin cair dilakukan dalam tissue processor dengan waktu proses
selama 18 jam. Jaringan dimasukkan ke wadah khusus, ditimbuni paraffin dan dibiarkan dingin. Jaringan yang terkemas dilepaskan dari wadah dan dipotong
tipis dengan ukuran kira-kira 5 µm. Potongan ini diapungkan di atas air untuk mempermudah meletakkannya di atas gelas obyek. Proses perlekatan di atas gelas
obyek dilakukan dengan menyimpannya selama 24 jam atau dengan memanaskannya di dalam oven bersuhu 60
o
C.
8.1 Pewarnaan Hematoksilin-Eosin
Pewarnaan hematoksilin-eosin dilakukan dengan mengikuti urutan kerja sebagai berikut. Gelas obyek tempat jaringan yang telah direkatkan
diberi pewarna hematoksilin selama 10 menit. Setelah waktu tercapai, dicuci
40
menggunakan air keran mengalir hingga semua zat pewarna hilang. Gelas obyek dicelupkan ke larutan lithium karbonat hingga memberi tampak biru
dengan waktu kira-kira satu menit, lalu dicuci dengan air suling. Gelas obyek diwarnai dengan pewarna eosin selama 10 menit. Setelah waktu tercapai,
dicuci dengan air keran mengalir hingga semua zat pewarna hilang. Gelas obyek dicuci kembali dengan air suling. Pengeringan gelas obyek dilakukan
dengan merendamnya berturut-turut ke dalam larutan alkohol 80, 90, dan 95. Pengeringan terakhir menggunakan larutan alkohol pekat p.a.
Penjernihan dilakukan dengan pencelupan gelas obyek ke dalam larutan silol sebanyak dua kali. Jaringan ditutup dengan gelas penutup yang telah diberi
mounting medium Paramount.
8.2 Pewarnaan Imunohistokimiawi
Pewarnaan imunohistokimiawi dilakukan dengan mengikuti urutan kerja sebagai berikut. Gelas obyek tempat jaringan yang telah direkatkan
diberikan perlakuan deparafinisasi dengan cara merendamnya ke dalam tiga larutan silol yang berbeda. Perendaman pada masing-masing larutan
membutuhkan waktu tiga menit. Perlakuan ini diberikan dengan tujuan untuk menghilangkan parafin yang tersisa karena akan menghalangi masuknya zat
warna yang akan diberikan. Selanjutnya preparat diberikan perlakuan rehidrasi dengan cara merendam ke dalam larutan alkohol absolut, 100, 95,
90, 80 dan 70. Perendaman pada masing-masing larutan dilakukan selama tiga menit. Preparat direndam kembali dalam air tanpa ion deionized water
selama lima menit dan waktu perendaman ditambah kembali selama lima menit. Tahap selanjutnya adalah menghilangkan enzim-enzim peroksidase
endogen. Kalau enzim ini tidak dihilangkan, maka seluruh sel akan memberikan hasil positif. Pada tahap ini, preparat direndam dalam larutan
campuran 50 ml metanol dan 0,5 ml H
2
O
2
kedua larutan ini dicampurkan sesaat sebelum perendaman selama lima menit. Preparat dicuci dengan air
tanpa ion sebanyak dua kali dengan waktu pencucian masing-masing 5-10
41
menit. Kemudian dicuci kembali dengan air tanpa ion sebanyak dua kali dengan waktu pencucian masing-masing 5-10 menit. Untuk menutupi
antigen-antigen yang non-spesifik, di atas preparat perlu diberi serum normal. Serum normal dipilih salah satu dari BSA, serum normal kambing atau susu
skim. BSA digunakan di dalam penelitian ini dan diteteskan ke atas preparat. Preparat yang ditetesi serum normal diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 30-60 menit. Setelah masa inkubasi dicapai, preparat dicuci dengan PBS sebanyak
tiga kali dengan waktu pencucian masing-masing selama lima menit. Serum yang mengandung APAB
1
dari hati ayam diencerkan sebanyak 1:30 dan dari hati ayam diencerkan sebanyak 1:20. Sebanyak 100 L APAB
1
dari masing- masing diteteskan dengan merata ke seluruh permukaan preparat. Preparat
yang sudah ditetesi diinkubasi pada suhu empat derajat Celcius selama 24 jam. Setelah masa inkubasi dicapai, preparat dicuci dengan PBS sebanyak
tiga kali dengan waktu pencucian masing-masing selama 10 menit. Pig IgG antiPABbit DAKO digunakan sebagai antibodi sekunder. Sebanyak 100 L
pig IgG antiPABbit diteteskan dengan merata ke seluruh permukaan preparat. Preparat yang sudah ditetesi diinkubasi pada 37
o
C selama 30-60 menit. Setelah masa inkubasi dicapai, preparat dicuci dengan PBS sebanyak tiga kali
dengan waktu pencucian masing-masing selama lima menit. Untuk
memperlihatkan ikatan antara PAB
1
, APAB
1
dan antibodi sekunder diperlukan diaminobenzidin DAB, DAKO.
Sebanyak 10,00 mg diaminobenzidin dilarutkan ke dalam campuran 50 ml larutan penyangga tris
dan 50 L H
2
O
2
. Setelah tercampur merata, larutan ini segera diteteskan ke atas preparat. Diamkan preparat yang sudah ditetesi selama 25 menit.
Seluruh kegiatan pada tahap ini dilakukan pada kondisi ruang dengan penerangan minimal. Setelah masa tercapai, preparat dicuci dengan air tanpa
ion. Preparat diberi perlakuan dehidrasi, penjernihan dan mounting untuk keperluan pengamatan. Pengamatan mikroskopik dipusatkan pada noktah-
noktah warna coklat-hitam yang menandakan telah terjadi ikatan antara PAB
1
, APAB
1
dan antibodi sekunder.
42
9. Evaluasi dan Analisis Statistika
