35
selama satu menit pada kecepatan 20 Hz dalam 500 ml larutan penyangga yang tersusun atas 50 mM Tris pH 7,0, 10 mM EDTA, 25 mM benzamidin, 10 mM
fenilmetilsulfonil, 1 mM ditiotreitol, 1 Triton X-100 dan 0,1 M NaCl. Jaringan yang telah dihancurkan tersebut, kemudian dihomogenisasi selama satu menit pada
kecepatan 10 Hz menggunakan Polytron dengan probe berukuran 1,2 cm. Homogenat dipusing sentrifugasi pada 40.000 x g selama 30 menit pada 4
o
C. 2. Penentuan Kadar Protein
Kandungan protein total dari ekstrak kotor crude extract protein diukur menggunakan metode Bradford 1976 dengan BSA sebagai acuan. Beberapa
larutan ekstrak protein mulai dari volume 10 l sampai 30 l dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Kemudian ditambahkan air suling sebagai pengencer hingga
volume akhir mencapai 100 l. Kemudian ditambahkan 100 L NaOH 1M dan tiga mililiter peraksi Bradford. Campuran dikocok dan didiamkan selama 45
menit. Setelah dibuat deret contoh, maka dibuatkan juga deret larutan baku BSA dengan berbagai kadar bertingkat. Setelah semua deret contoh dan larutan baku
siap, diukur absorbansinya menggunakan spektrofotomer pada = 595 nm. Kadar protein diukur dengan cara mengekstrapolasikan ke dalam kurva baku dari larutan
baku BSA Bradford 1976.
3. Pembuatan Matriks AFB
1
Isolasi PAB
1
dilakukan dengan menggunakan teknik khromatografi afinitas Wibawan et al. 1992.
Terlebih dahulu dibuat matriks aktif dengan mengaktifkan nitroselulosa 5x5 cm
2
yang direndam dalam bromsian CNBr dengan kadar 2 larutan garam penyangga fosfat PBS selama 60 menit. Pada
tahap perendaman ini, pH dijaga dalam kisaran 11-15. Membran nitroselulosa dicuci dengan air suling sebanyak 8-10 kali pencucian Estuningsih, 2001.
Membran nitroselulosa diinkubasi dengan AFB
1
murni 20 ppb dalam DMSO, SIGMA selama 24 jam pada suhu empat derajat Celcius di dalam gelas
ukur. Setelah masa inkubasi dicapai, matriks dibasuh dengan larutan bufer
36
tetraborat 0,05 M. Setelah pencucian ini, berarti matriks telah siap digunakan untuk menangkap protein sel hati.
4. Pemurnian PAB
1
Ekstrak organ hati yang telah diukur kandungan proteinnya diinkubasikan dengan matriks nitroselulose aktif selama 45-60 menit pada suhu empat derajat
Celcius. Kemudian matriks dibasuh dengan PBS untuk menghilangkan bahan- bahan yang tidak melekat pada matriks. Ikatan spesifik antara PAB
1
, AFB
1
dan matriks dielusi menggunakan 2,0 ml larutan glisin-HCl 0,1 M pH 2,5. Nilai pH
bilasan dinetralkan menggunakan larutan NaOH 1 N hingga mencapai pH + 7,0.
Protein selanjutnya diberi kode PAB
1
hasil elusi diukur kembali menggunakan metode Bradford 1976 dengan BSA sebagai acuan.
5. Karakterisasi PAB
1
Sebelum dilakukan karakterisasi dengan elektroforesis, PAB
1
terlebih dahulu dipekatkan dan didialisis. PAB
1
dipekatkan dengan cara pengendapan menggunakan amonium sulfat. PAB
1
yang dimiliki dimasukkan ke dalam wadah gelas yang disekeliling luar wadah diberi batu es. Amonium sulfat ditambahkan
sedikit demi sedikit sambil diaduk menggunakan batang magnet. Jumlah paling banyak amonium sulfat yang ditambahkan adalah 516 g1000 ml dikalikan volume
ekstrak protein. Setelah semua amonium sulfat ditambahkan, ekstrak protein disimpan pada suhu empat derajat Celcius selama 24 jam. Setelah waktu
penyimpanan tercapai, dilakukan pemusingan pada kecepatan 10.000 rpm pada 4
o
C. Setelah pemusingan selesai dan diperoleh endapan, kemudian ditambahkan penyangga fosfat 50 mM pH 6,5 kira-kira sebanyak 1,0 ml tidak boleh terlalu
banyak. Ekstrak protein ini selanjutnya akan didialisis. Dialisis dilakukan dengan cara memasukkan seluruh larutan ekstrak protein
yang telah dipekatkan ke kantong dialisa. Kemudian kantong dialisa tersebut direndam dalam larutan penyangga fosfat 50 mM pH 6,5 pada suhu 4
o
C selama 48 jam. Penggantian larutan penyangga dilakukan minimal satu kali dalam sehari.
37
Karakterisasi PAB
1
dengan elektroforesis dilakukan menggunakan teknik SDS-PAGE Wibawan et al. 1992.
Penanda baku yang digunakan untuk elektroforesis mengandung karbonil anhidrase 29 kDa, albumin telur 45 kDa,
albumin sapi 66 kDa, fosforilasi 97,4 kDa, -galaktosidase 116 kDa dan
miosin 205 kDa. Sebanyak 25,0 L bilasan protein dan 5,0 L penanda
molekular baku Biorad, Ltd. dicampurkan dengan 5,0 L penyangga contoh Tris-HCl 1 molL pH 6,8, SDS 2, gliserol 10, 2-merkaptoethanol 0,05,
bromfenolbiru 0,002. Campuran dimasukkan ke sumur penampung pada jel poliakrilamida dalam rendaman running buffer dan dilewatkan pada tegangan 80
volt dan kuat arus 0,065 A selama 40-50 menit. Setelah contoh mencapai batas bawah jel, jel dilepaskan dari cetakannya untuk diwarnai.
Jel difiksasi menggunakan larutan ethanol-asam asetat 10,0 ml ethanol, 10,0 ml asam asetat
dan 80,0 ml air suling. Pewarnaan dilakukan dengan menggunakan Coomassie Blue 0,25 selama 18 jam pada suhu 25
o
C. Setelah masa pewarnaan dicapai, dilakukan perendaman dalam larutan pemucat 10,0 ml metanol, 10,0 ml asam
asetat dan 80,0 ml air suling. Bila pita terlihat kontras dengan jel, maka jel diangkat dan direndam dalam air suling, disimpan pada suhu empat derajat Celcius
untuk menentukan pita protein yang dibentuk.
6. Produksi Anti-Protein APAB
