34
2. Organ Hati
Sebanyak 100 g organ hati bebek dan ayam yang tidak mengalami perubahan patologik digunakan dalam penelitian ini. Sejumlah organ hati ayam
diperoleh dari rumah potong unggas yang ada di Bogor dan dari ayam yang dipelihara. Sedangkan organ hati bebek diperoleh dengan cara memotong
beberapa ekor bebek yang diperoleh dari pasar.
3. Bahan Kimia
Bahan kimia yang digunakan dalam penelitian ini adalah Aflatoksin B1 Sigma, dimetilsulfoksida DMSO, Sigma, 50 mM Tris pH 7,0, 10 mM EDTA,
25 mM benzamidin, 10 mM fenilmetilsulfonil, 1 mM ditiotreitol, 1 Triton X-100 dan 0,1 M NaCl, bovine standar albumin Sigma, kertas nitroselulosa, bromsian
Br-CN, larutan garam penyangga fosfat phosphate buffer saline, PBS, larutan bufer tetPABorat 0,05 M, larutan glisin-HCl 0,1 M pH 2,5, larutan NaOH 1 N,
sodium dodesil sulfat SDS 2, gliserol 10, 2-merkaptoetanol 0,05, bromfenolbiru 0,002, etanol, asam asetat Coomassie Blue 0,25, metanol,
Agaros Heidelberg, polietilenglikol PEG 6000, BDH Limited dan sodium azida NaN
3
, Merck.
Metode Penelitian
Tahapan-tahapan yang dilakukan dalam penelitian ini adalah i mengektraksi, ii pembuatan matriks AFB
1
, iii pemurnian dan mengkarakterisasi PAB, iv membuat antibodi poliklonal terhadap PAB
1
APAB
1
, dan v pemeriksaan histologik ikatan PAB
1
dan APAB
1
di jaringan hati.
1. Ekstraksi Sel Hati
Tatakerja yang diterapkan untuk mengekstraksi sel hati mengikuti metode yang digunakan oleh Hao et al. 1999. Pekerjaan untuk mengekstrak sel hati
dilakukan di dalam air berisi es batu untuk mencegah kenaikan suhu. Hati ayam dan bebek masing-masing sebanyak 100 g dihancurkan menggunakan blender
35
selama satu menit pada kecepatan 20 Hz dalam 500 ml larutan penyangga yang tersusun atas 50 mM Tris pH 7,0, 10 mM EDTA, 25 mM benzamidin, 10 mM
fenilmetilsulfonil, 1 mM ditiotreitol, 1 Triton X-100 dan 0,1 M NaCl. Jaringan yang telah dihancurkan tersebut, kemudian dihomogenisasi selama satu menit pada
kecepatan 10 Hz menggunakan Polytron dengan probe berukuran 1,2 cm. Homogenat dipusing sentrifugasi pada 40.000 x g selama 30 menit pada 4
o
C. 2. Penentuan Kadar Protein
Kandungan protein total dari ekstrak kotor crude extract protein diukur menggunakan metode Bradford 1976 dengan BSA sebagai acuan. Beberapa
larutan ekstrak protein mulai dari volume 10 l sampai 30 l dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Kemudian ditambahkan air suling sebagai pengencer hingga
volume akhir mencapai 100 l. Kemudian ditambahkan 100 L NaOH 1M dan tiga mililiter peraksi Bradford. Campuran dikocok dan didiamkan selama 45
menit. Setelah dibuat deret contoh, maka dibuatkan juga deret larutan baku BSA dengan berbagai kadar bertingkat. Setelah semua deret contoh dan larutan baku
siap, diukur absorbansinya menggunakan spektrofotomer pada = 595 nm. Kadar protein diukur dengan cara mengekstrapolasikan ke dalam kurva baku dari larutan
baku BSA Bradford 1976.
3. Pembuatan Matriks AFB
1
Isolasi PAB
1
dilakukan dengan menggunakan teknik khromatografi afinitas Wibawan et al. 1992.
Terlebih dahulu dibuat matriks aktif dengan mengaktifkan nitroselulosa 5x5 cm
2
yang direndam dalam bromsian CNBr dengan kadar 2 larutan garam penyangga fosfat PBS selama 60 menit. Pada
tahap perendaman ini, pH dijaga dalam kisaran 11-15. Membran nitroselulosa dicuci dengan air suling sebanyak 8-10 kali pencucian Estuningsih, 2001.
Membran nitroselulosa diinkubasi dengan AFB
1
murni 20 ppb dalam DMSO, SIGMA selama 24 jam pada suhu empat derajat Celcius di dalam gelas
ukur. Setelah masa inkubasi dicapai, matriks dibasuh dengan larutan bufer
36
tetraborat 0,05 M. Setelah pencucian ini, berarti matriks telah siap digunakan untuk menangkap protein sel hati.
4. Pemurnian PAB
Kategori