Tabel 23. Perbandingan aktivitas hipoglisemik berdasarkan uji Anava Duncan Menit setelah perlakuan
Aktivitas hipoglisemik Keterangan
30 menit setelah perlakuan 50 mgkg BB Glibenklamid
tn 60 menit setelah perlakuan
50 75 mgkg BB tn
90 menit setelah perlakuan 50 mgkg BB Glibenklamid
tn 120 menit setelah perlakuan
50 mgkg BB Glibenklamid tn
150 menit setelah perlakuan 50 mgkg BB Glibenklamid
tn 180 menit setelah perlakuan
50 75 mgkg BB Glibenklamid tn
tn = tidak beda nyata
Tabel 23 menunjukkan bahwa dosis 50 mgkg BB mempunyai kekuatan aktivitas hampir sama dengan glibenklamid obat antidiabetes daripada dosis 75 mgkg
BB selama perlakuan dari 30 menit sampai 180 menit perlakuan. Semakin besar dosis akan semakin mahal dan senyawa lain yang terdapat dalam ekstrak MeOH akar S.
album semakin besar kuantitasnya dimana senyawa ini mungkin mempunyai aktivitas yang berlawanan atau bersifat toksik, namun begitu dosis 75 mgkg BB tidak diperiksa
dalam penelitian ini.
4.4 Tahap Fraksinasi
Ekstrak metanol pekat sebanyak 40 g disuspensi dengan akuades dan dipartisi dengan kloroform CHCl
3
:H
2
O; 1:1 Metode Banthorpe. Perlakuan ini bertujuan untuk mengekstraksi senyawa steroid bebas non-glikosida dalam ekstrak metanol agar
terlarut dalam pelarut kloroform. Masing-masing ekstrak kemudian dipekatkan dan diuji steroid . Hasil uji fitokimia ditunjukkan pada Tabel 24.
Tabel 24. Hasil uji fitokimia dan perolehan berat ekstrak dari fraksi kloroform dan air. Fraksi
Uji Steroid Pereaksi Liebermann-Burchard
Berat g Rendemen
dari 40 g Kloroform
Air Warna hijau
- 4,2309
- 10,577
- Tabel 24 menunjukkan bahwa fraksi kloroform dan air mengandung steroid.
Fraksi kloroform lebih mudah diuapkan daripada fraksi air karena titik didih kloroform lebih rendah daripada air 100
°C. Senyawa-senyawa bahan alam dapat mengalami degradasi karena pemanasan. Fraksi kloroform mengandung steroid non-glikosida non
polar sedangkan fraksi air mengandung steroid glikosida polar. Pemisahan steroid
74
Chairul Saleh: Isolasi dan Penentuan Struktur Senyawa Steroid Dari Akar Tumbuhan Cendana Santalum album Linn. USU e-Repository © 2008.
dalam fraksi kloroform dapat dilakukan dengan fase normal fase diam silika gel untuk senyawa-senyawa non polar sedangkan pemisahan steroid dalam fraksi air dilakukan
dengan fase terbalik fase diam C-18 atau shepadex untuk senyawa-senyawa polar. Harga silika gel lebih murah daripada C-18 atau shepadex. Alasan inilah maka dipilih
fraksi kloroform untuk dilakukan pemisahan lebih lanjut,
4.5 Tahap Pemisahan dan Pemurnian
Sebanyak 2,0 g fraksi kloroform dilakukan proses pemisahan dengan menggunakan kromatografi kolom dengan silika gel 60 70 – 230 mesh; 66,67 g
panjang 40 cm, diameter 2,5 cm menggunakan fase gerak n-heksana–etil asetat 82:18. Fraksi-fraksi ditampung setiap 5 ml dan diperoleh sebanyak 170 fraksi. Tiap-tiap fraksi
dianalisis secara kromatografi lapis tipis dengan fase gerak kloroform-etil asetat 9:1. Fraksi-fraksi dengan pola R
f
yang sama digabungkan menjadi satu kemudian pelarut diuapkan. Dari 170 fraksi diperoleh 6 fraksi gabungan. Kromatogram lapis tipis fraksi-
fraksi yang dikelompokkan dapat dilihat pada Gambar 55.
Gambar 55. Kromatografi lapis tipis silika gel GF
254
tebal 0,2 mm, ukuran plat 10 x 9 cm, jarak elusi 8 cm, fase gerak kloroform-etil asetat 9:1, penampak noda asam sulfat
10 dalam etanol dari 6 fraksi gabungan hasil kromatografi kolom.
75
Chairul Saleh: Isolasi dan Penentuan Struktur Senyawa Steroid Dari Akar Tumbuhan Cendana Santalum album Linn. USU e-Repository © 2008.
Fraksi-fraksi yang menampakkan pola noda yang sama pada kromatogram lapis tipis digabungkan dan diuapkan pelarutnya sehingga diperoleh fraksi A 8-15 seberat
278,1 mg, fraksi B 19-26 seberat 99,7 mg, fraksi C 36-40 seberat 81,9 mg, fraksi D 52-59 seberat 51,9 mg, fraksi E 79-104 seberat 24,5 mg, dan fraksi F 128-170
seberat 50,0 mg. Keenam fraksi dilakukan uji steroid. Hasil uji steroid dengan menggunakan pereaksi Liebermann-Burchard dan perolehan berat ekstraksi dari setiap
fraksi ditunjukkan pada Tabel 25.
Tabel 25. Hasil uji steroid dan perolehan berat ekstrak dari fraksi A, B, C, D, E, dan F Fraksi
Uji Steroid Pereaksi Liebermann-Burchard
Berat mg Rendemen
dari 2 g A 8-15
B 19-26 C 36-40
D 52-59 E 79-.104
F 128-170 -
- -
Warna hijau -
- 278,1
99,7 81,9
51,9 24,5
50,0 13,905
4,985 4,095
2,595 1,225
2,500 Pada Tabel 25 terlihat bahwa fraksi D positif terhadap pereaksi steroid sehingga
fraksi D dilakukan pemisahan lebih lanjut. Fraksi D sebanyak 50 mg dipisahkan kembali dengan menggunakan kromatografi kolom dengan silika gel 60 200 mesh;
9,11 g panjang 30 cm, diameter 1 cm menggunakan fase gerak petroleum eter–eter 40:60. Selanjutnya masing-masing fraksi ditampung sebanyak 1 ml dan diperoleh 43
fraksi. Setelah dilakukan kromatografi lapis tipis dengan fase gerak petroleum eter–eter 1:1, eluat ini menghasilkan empat fraksi yang menunjukkan pemisahan yang berbeda.
Noda dengan R
f
yang sama dari fraksi D setelah digabungkan ditunjukkan pada Gambar 56.
76
Chairul Saleh: Isolasi dan Penentuan Struktur Senyawa Steroid Dari Akar Tumbuhan Cendana Santalum album Linn. USU e-Repository © 2008.
R
f
= 0 .9 4 R
f
= 0 .7 9
R
f
= 0.3 6 R
f
= 0.15 R
f
= 0.21
D
2
D
1
D
3
D
4
Gambar 56. Kromatografi lapis tipis silika gel GF
254
tebal 0,2 mm, ukuran plat 10 x 6 cm, jarak elusi 8 cm, fase gerak petroleum eter-eter 1:1, penampak noda asam sulfat
10 dalam etanol dari 4 fraksi gabungan hasil kromatografi kolom
Fraksi-fraksi yang menunjukkan noda dengan R
f
yang sama pada kromatografi lapis tipis digabungkan dan diuapkan pelarutnya sehingga diperoleh fraksi D
1
12-15 seberat 13,2 mg, fraksi D
2
22-24 seberat 9,4 mg, fraksi D
3
33-34 seberat 11,4 mg, dan fraksi D
4
39-43 seberat 14,3 mg. Terhadap keempat fraksi dilakukan uji steroid. Hasil uji steroid dan perolehan berat ekstrak setiap fraksi dipaparkan pada Tabel 26.
Tabel 26. Hasil uji steroid dan perolehan berat ekstrak dari fraksi D
1
, D
2
, D
3
, dan D
4
Fraksi Uji Steroid
Pereaksi Liebermann-Burchard Berat mg
Rendemen dari 50 mg
D
1
12-15 D
2
22-24 D
3
33-34 D
4
39-43 Warna hijau
Warna hijau Warna hijau
Warna hijau 13,2
9,4 11,4
14,3 26,4
18,8 22,8
28,6
77
Chairul Saleh: Isolasi dan Penentuan Struktur Senyawa Steroid Dari Akar Tumbuhan Cendana Santalum album Linn. USU e-Repository © 2008.
Pada Tabel 26 terlihat bahwa fraksi D
1
-D
4
positif terhadap pereaksi Liebermann- Burchard, fraksi D
1
12-15 berupa wax, fraksi D
2
22-24 dan fraksi D
3
33-34 berupa fase padatan. Fraksi D
2
dan D
3
menunjukkan satu noda dan berbentuk kristal berwarna putih. Kemudian terhadap fraksi-fraksi tersebut dilakukan uji kemurnian dengan
menggunakan kromatografi lapis tipis.
4.6 Uji Kemurnian
