Isolasi dan Penentuan Struktur Senyawa Steroid dari Akar Tumbuhan Cendana (Santalum album Linn)

ISOLASI DAN PENENTUAN STRUKTUR SENYAWA STEROID

DARI AKAR TUMBUHAN CENDANA (Santalum album Linn)

DISERTASI

OLEH

CHAIRUL SALEH

NIM : 038103006

PROGRAM DOKTOR ILMU KIMIA

SEKOLAH PASCASARJANA

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

MEDAN

2007

ISOLASI DAN PENENTUAN STRUKTUR SENYAWA STEROID

DARI AKAR TUMBUHAN CENDANA (Santalum album Linn)

DISERTASI

Untuk memperoleh gelar Doktor dalam Ilmu Kimia pada

Universitas Sumatera Utara dibawah pimpinan Rektor Universitas Sumatera Utara

Prof. Chairuddin P. Lubis, DTM&H,Sp.A(K)

untuk dipertahankan dihadapan Sidang Terbuka Promosi Doktor di

Universitas Sumatera Utara Medan

OLEH

CHAIRUL SALEH

NIM : 038103006

PROGRAM DOKTOR ILMU KIMIA

SEKOLAH PASCASARJANA

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

MEDAN

2007

PROMOTOR

Prof. Dr. Tonel Barus

Guru Besar Kimia Bidang Kimia Organik Bahan Alam

Fakultas MIPA USU

CO-PROMOTOR

Prof. Dr. Yunazar Manjang

Guru Besar Kimia Bidang Kimia Organik Bahan Alam

Fakultas MIPA UNAND

Dr. M. Pandapotan Nasution, MPS

Lektor Kepala Bidang Farmasi

Fakultas Farmasi USU

Telah diuji dan dinyatakan lulus pada Tanggal : 3 September 2007

Panitia Penguji :

Ketua Komisi Penguji :

Prof. Dr. Tonel Barus

Guru Besar Kimia Bidang Kimia Organik Bahan Alam

Fakultas MIPA Universitas Sumatera Utara

Anggota Komisi Penguji :

1.

Prof. Dr. Yunazar Manjang

Guru Besar Kimia Bidang Kimia Organik Bahan Alam

Fakultas MIPA Universitas Andalas

2.

Dr. M. Pandapotan Nasution, MPS

Lektor Kepala Bidang Farmasi

Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara

3.

Prof. Dr. Seri Bima Sembiring, M.Sc

Guru Besar Kimia Bidang Kimia Anorganik

Fakultas MIPA Universitas Sumatera Utara

4.

Prof. Dr. Ponten M. Naibaho

Guru Besar Bidang Pertanian

Judul Disertasi

: Isolasi dan Penentuan Struktur Senyawa Steroid dari

akar Tumbuhan Cendana (Santalum album Linn)

Nama :

Chairul

Saleh

NIM :

038103006

Program Studi

: S3 Ilmu Kimia

Menyetujui

Komisi Pembimbing

Prof. Dr. Tonel Barus

Promotor

Prof. Dr. Yunazar Manjang

Co-Promotor

Dr. M. Pandapotan Nasution, MPS

Co-Promotor

Mengetahui

Ketua Program Studi S3 Ilmu Kimia

Prof. Dr. Hemat R. Brahmana, M.Sc

Direktur Sekolah Pascasarjana USU

ABSTRACT

Santalum album Linn. is one of the species belonging to the Santalaceae family. It

is used as a traditional medicine for diabetes mellitus and is known to contain sesquiterpene compounds. This study was aimed to isolate steroidal compound from the root of S. album and to determine its chemical structure.

Isolation was accomplished by maceration and was followed by fractionation using column chromatography with silica gel as the stationary phase. The isolation work resulted

in a pure isolate in the form of white needle crystals, m.p. 135-137°C (uncorrected). The

pure isolate was identified by spectral analyses with infrared, 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT

and 2D-NMR (COSY, HMQC and HMBC) spectroscopy. The result indicated that the compound was found to be steroid and based on the comparison of its spectrum with those of the database of the compound was concluded to be clionasterol.

Key words: S. album Linn., Steroid, Clionasterol, Anti diabetic mellitus, Isolation, Determination of molecular structure

ABSTRAK

Santalum album Linn. merupakan salah satu spesies dari suku Santalaceae yang

digunakan sebagai obat tradisional seperti diabetes melitus dan diketahui mengandung senyawa-senyawa seskuiterpena. Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi dan menentukan struktur molekul steroid dari akar S. album.

Isolasi dilakukan dengan cara maserasi diikuti oleh fraksinasi dengan kromatografi kolom dengan fase diam silika gel. Dari hasil isolasi diperoleh isolat murni berupa kristal

putih berbentuk jarum dengan titik leleh 135-137°C (tidak terkoreksi). Isolat murni

diidentifikasi dengan menganalisis spektrum inframerah, NMR-1H, NMR-13C, DEPT, dan

NMR-2D (COSY, HMQC dan HMBC). Dari hasil analisa dinyatakan bahwa senyawa tersebut adalah senyawa golongan steroid dan berdasarkan hasil konfirmasi dengan membandingkan pada database senyawa tersebut adalah clionasterol.

Kata kunci: S. album Linn., Steroid, Clionasterol, Antidiabetes mellitus, Isolasi, Penentuan struktur molekul

UCAPAN TERIMA KASIH

Assalamu’alaikum Warahmatullahi Wabarakatuh,

Alhamdulillah, saya ucapkan rasa syukur ke hadirat Allah SWT atas limpahan rahmat dan hidayahNya sehingga saya dapat menyelesaikan disertasi ini.

Dengan selesainya disertasi ini, perkenankanlah saya dengan hati yang tulus menyampaikan rasa hormat dan terima kasih serta penghargaan yang setinggi-tingginya kepada yang terhormat:

1. Rektor Universitas Sumatera Utara, Prof. Dr. Chairuddin P. Lubis, DTM&H, Sp.A(K),

yang telah memberi kesempatan kepada saya untuk mengikuti Program S3 Ilmu Kimia pada Sekolah Pascasarjana USU Medan.

2. Direktris Sekolah Pascasarjana, Prof. Dr. Ir. T. Chairun Nisa B., M.Sc., yang telah

memberikan kesempatan dan kepercayaan kepada saya untuk menjadi peserta Program S3 Ilmu Kimia USU Angkatan 2003.

3. Ketua Program S3 Ilmu Kimia, Prof. Dr. Hemat R. Brahmana, M.Sc., yang telah

memberikan dorongan kepada saya untuk dapat segera menyelesaikan Program S3 Ilmu Kimia.

4. Dengan Tulus Ikhlas penulis mengucapkan terima kasih kepada Promotor saya Prof.

Dr. Tonel Barus, dan Co-Promotor Prof. Dr. Yunazar Manjang dan Co-Promotor Dr. M. Pandapotan Nasution, MPS., yang dengan segala kesabaran dan tanpa bosan-bosannya telah banyak memberikan bimbingan dalam menyelesaikan disertasi ini.

5. Tim Penguji saya Prof. Dr. Seri Bima Sembiring, M.Sc. dan Prof. Dr. Ponten Naibaho

saya ucapkan terima kasih yang tak terhingga atas kesediaan beliau untuk memberikan penilaian maupun saran-saran untuk perbaikan dan penyempurnaan disertasi saya.

6. Rektor Universitas Mulawarman, Prof. Dr. Ir. H. Achmad Ariffien Bratawinata, M.Agr selaku Rektor Universitas Mulawarman yang telah memberikan kesempatan kepada saya mengikuti Program S3 Ilmu Kimia serta bantuan biaya perkuliahan.

7. Dekan Fakultas MIPA Universitas Mulawarman, Drs. Sudrajat, SU., atas segala

bantuan, ijin, dan semangat yang diberikan kepada saya untuk dapat segera menyelesaikan Program S3 Ilmu Kimia.

8. Pemerintahan Daerah Kalimantan Timur yang telah memberikan bantuan dana

pendidikan kepada saya sehingga dapat mengikuti Program S3 Ilmua Kimia pada Sekolah Pascasarjan USU.

9. Yayasan Habibie Center yang telah memberikan beasiswa kepada saya sehingga saya

dapat menyelesaikan Program S3 Ilmua Kimia pada Sekolah Pascasarjan USU.

10.Dr. Nurdin Saidi yang telah meluangkan waktunya dalam pengerjaan spektroskopi di

Jurusan Kimia Fakultas Sains Universitas Malaya – Malaysia.

11.Kepala Laboratorium Penelitian, Dr. Harry Agusnar; Kepala Laboratorium Biokimia,

Drs. Ribu Surbakti, MS.; Kepala Laboratorium Kimia Organik Bahan Alam, Drs. Johanes Simorangkir, MS.; dan Kepala Laboratorium Farmasi, Dra. Marline Nainggolan, MS. atas fasilitas yang telah diberikan selama melaksanakan penelitian.

12.Semua teman sejawat dan peserta Program S3 Ilmu Kimia Sekolah Pascasarjana USU

yang memberikan dukungan sehingga disertasi ini dapat selesai dengan baik.

Pada saat ini tak lupa saya mengucapkan rasa terima kasih yang sedalam-dalamnya kepada kedua orangtua saya atas jasa-jasa mereka yang telah melahirkan, membesarkan, dan mendidik saya dengan sepenuh hati serta memberikan dorongan kepada saya untuk terus belajar sehingga saya dapat mencapai tingkat pendidikan seperti sekarang ini. Kepada Isteriku Nurhasanah, S.Si., anak-anakku Haani Adilah dan Muhammad Rizky Akbar yang telah memberikan bantuan moril dan semangat sehingga saya dapat meyelesaikan disertasi ini.

Akhirnya kepada semua pihak yang telah banyak membantu, baik langsung maupun tidak langsung, hanya Allah SWT yang mampu memberikan balasan terbaik. Mudah-mudahan disertasi ini dapat memberi sumbangan yang berharga bagi perkembangan ilmu kimia khususnya kimia organik bahan alam. Semoga Allah SWT senantiasa memberi rahmat dan hidayahNya kepada kita semua. Amin.

Wabillahi taufiq wal hidayah, Wassalamu’alaikum warahmatullahi wabarakatuh

Medan, September 2007

Chairul Saleh

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan pada tanggal 31 Maret 1973 di Tanjung Balai, anak dari M. Saleh Arief dan Asdarwati merupakan anak pertama dari empat bersaudara..

Penulis menjalani masa pendidikan SD Inpres 105300 di Kedai Durian dari tahun 1980 sampai 1986, kemudian SMP Negeri 2 Delitua dari tahun 1986 sampai 1989 dan selanjutnya SMA Negeri 12 Medan dari tahun 1989 sampai 1992. Kemudian penulis melanjutkan ke Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sumatera Utara, Jurusan Kimia. Penulis lulus sebagai Sarjana Kimia dengan penelitian di bidang Biokimia tahun 1997, dan penulis pernah bekerja pada PT LP3I di Jambi pada tahun 1999.

Penulis melanjutkan Pendidikan Program Magister pada Sekolah Pascasarjana Universitas Padjadjaran dalam Program Studi Ilmu Kimia pada tahun 1999 dan lulus pada tahun 2002 yang dibiayai oleh Departemen Pendidikan Nasional Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi, Proyek Pengembangan Pendidikan S-1 (DUE-QUE), Program Karyasiswa. Penulis bekerja sebagai tenaga pengajar pada FMIPA Jurusan Kimia Universitas Mulawarman Samarinda sejak tahun 2000. Selanjutnya pada tahun 2003 penulis mengikuti Program Doktor (S3) Ilmu Kimia pada Sekolah Pascasarjana Universitas Sumatera Utara.

DAFTAR ISI

Halaman

ABSTRACT ….……… i

ABSTRAK .………..… ii

UCAPAN TERIMA KASIH ……… iii

RIWAYAT HIDUP ………. vi

DAFTAR ISI …….……….……….. vii

DAFTAR GAMBAR ……….………..… x

DAFTAR TABEL ………..……….…. xiv

DAFTAR LAMPIRAN …….……….….. xvii

BAB I PENDAHULUAN ……… 1

1.1 Latar Belakang ……….. 1

1.2 Perumusan Masalah ……….. 7

1.3 Tujuan Penelitian ……….. 7

1.4 Manfaat Penelitian ……… 8

1.5 Metode Penelitian ………. 8

BAB II TINJAUAN PUSTAKA ……….. 9

2.1 Taksonomi Tumbuhan, Morfologi, Habitat dan Manfaat ……… 9

2.2 Perkembangan Penelitian Kimia dari S. album ………. 11

2.3 Steroid Sebagai Turunan Triterpenoid ……….. 17

2.3.1 Tatanama Senyawa Steroid ……….……….. 19

2.3.2 Penomoran Atom Karbon dalam Senyawa Steroid dan Triterpenoid 19 2.3.3 Kejadian Senyawa Steroid dalam Kayu dan Kulit ……… 23

2.3.4 Biosintesis Senyawa Steroid ………. 24

2.4 Penentuan Struktur Senyawa Steroid ……….………... 27

2.4.1 Spektroskopi IR ……… 27

2.4.2 Spektroskopi NMR proton (NMR-1H) …..……….……….. 29

2.4.3 Spektroskopi NMR karbon (NMR-13C) ……..………. 36

2.5 Diabetes Mellitus ………. 43

2.5.1 Insulin ………... 44

2.5.2 Oral Hypoglycemic Agent (OHA) ………... 47

BAB III METODOLOGI PENELITIAN …………..………. 57

3.1 Tempat dan Waktu ………... 57

3.2 Bahan Penelitian ……… 57

3.2.1 Bahan Tumbuhan ……….. 57

3.2.2 Bahan Kimia ………. 57

3.3 Hewan Percobaan ……….. 57

3.4 Peralatan ……… 58

3.5 Prosedur Kerja ……….………. 58

3.5.1 Pengujian Triterpenoid/Steroid ……….……… 58

3.5.2 Ekstraksi dan Fraksinasi ……… 58

3.5.3 Pemisahan dan Pemurnian ………. 59

3.5.4 Uji Kemurnian dan Penentuan Sifat Fisis ………. 61

3.5.5 Identifikasi dan Penentuan Struktur Molekul ……… 61

3.5.6 Uji Aktivitas Hipoglisemik ……….………..… 61

3.5.7 Penggunaan Alat ……… 63

3.5.8 Metode Perhitungan Pengujian Efek Penurunan Kadar Gula Darah . 64 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ……….. 66

4.1 Pengumpulan Bahan Tumbuhan S. album ……… 66

4.2 Tahap Ekstraksi Tumbuhan S. album ………... 66

4.3 Uji Aktivitas Hipoglisemik Ekstrak Metanol ………... 67

4.4 Tahap Fraksinasi ……….….. 74

4.5 Tahap Pemisahan dan Pemurnian ………. 75

4.6 Uji Kemurnian ………... 78

4.7 Penentuan Struktur Molekul ………. 79

4.7.1 Spektroskopi Inframerah (FTIR) ……..….………... 79

4.7.2 Spektroskopi NMR karbon ……….……….. 82

4.7.3 Spektroskopi DEPT ……….. 84

4.7.5 Spektroskopi NMR proton ……… 94

4.7.6 Spektroskopi HMQC ……….……… 96

4.7.7 Spektroskopi COSY ……….….. 99

4.7.8 Spektroskopi HMBC ………. 102

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ……… 108

5.1 Kesimpulan ……… 108

5.2 Saran ………... 109

DAFTAR PUSTAKA ……… 110

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. Senyawa triterpenoid/steroid dalam S. album ………... 2

Gambar 2. Struktur senyawa senegin-II …….………. 4

Gambar 3. Struktur senyawa kotalegenin-16 asetat …………..………. 4

Gambar 4. Empat triterpenoid dari daun Gymnema inodorum ……….….… 5

Gambar 5. Struktur senyawa asam dehidrotrametenolat dan asam colosolat ….… 5 Gambar 6. Lima fitosterol dari Aloe vera ………... 6

Gambar 7. Tumbuhan S. album Linn. ……… 10

Gambar 8. Struktur senyawa α-amirin palmitat ……..………... 11

Gambar 9. Senyawa seskuiterpena dalam minyak S. album ………... 11

Gambar 10. Senyawa santalol dan turunannya dalam minyak S. album …………... 12

Gambar 11. Stereoisomer dari β-bisabolol dalam minyak S. album ………. 12

Gambar 12. Komponen utama minyak S. album ……….…….. 13

Gambar 13. Biosintesis santalena dan bergamotena ……….……. 13

Gambar 14. Jalur biosintesis dari farnesil difosfat ke kurkumena, bisabolena dan bisabolol, dan cis lanceol ……….... 14

Gambar 15. Beberapa senyawa aromatik dari heartwood S. album ……….. 15

Gambar 16. Seskuiterpena tipe camphrenana dan santalena dari heartwood S. album ………. 15

Gambar 17. Struktur senyawa asam betulinat dan β-sitosterol ……… 16

Gambar 18. Berbagai produk yang dihasilkan dari S. album ……… 16

Gambar 19. Kolesterol dan turunan dihidronya ……… 17

Gambar 20. Struktur steroid dasar dengan sistem penomoran ………..……… 19

Gambar 21. Struktur steroid dasar dengan penomoran karbon ………. 20

Gambar 22. Konformasi epimer C-24 dalam steroid ………..……….. 21

Gambar 23. Konformasi kolestana (5α) dan koprostana (5β) ……….. 21

Gambar 25. Struktur senyawa kampesterol dan spinasterol ..……… ….. 23

Gambar 26. Biosintesis skualena oksida ……… 25

Gambar 27. Biosintesis steroid dan triterpenoid tetrasiklik dari skualena oksida …. 26 Gambar 28. Biosintesis sikloartenol dari skualena oksida ……… 27

Gambar 29. Spektrum IR dari kolesterol ……….…….….… 28

Gambar 30. Spektrum NMR-1H dari kolesterol ………..…..…… 31

Gambar 31. Spektrum massa dari kolesterol bebas dan kolesteril asetat .……..…... 38

Gambar 32. Mekanisme kehilangan rantai sisi dan karbon C-15, C-16 dan C-17 dari 5α-stanol ……….…….… 39

Gambar 33. Mekanisme kehilangan rantai sisi dan karbon C-15, C-16 dan C-17 dari Δ7-sterol atau Δ8(14)-sterol ………. 40

Gambar 34. Dua mekanisme fragmentasi dari Δ5-sterol bebas ………... 41

Gambar 35. Fragmentasi ion dalam spektrum massa Δ7-sterol …….………. 42

Gambar 36. Reaksi retro Diels-Alder untuk β-amirin …..…………..………..….. 43

Gambar 37. Metabolisme karbohidrat pada penderita diabetes mellitus ………… 44

Gambar 38. Insulin dalam makhluk hidup ……….……… 45

Gambar 39. Proinsulin manusia dan konversinya menjadi insulin …….…….…... 46

Gambar 40. Sisi aktif insulin ………..……… 46

Gambar 41. Struktur dasar sulfonilurea ……….. 48

Gambar 42. Struktur senyawa tolbutamida ………. 48

Gambar 43. Struktur group toluena-p-sulfonil ……… 48

Gambar 44. Sintesis dari senyawa tolbutamida ……… 49

Gambar 45. Struktur senyawa kloropropamida ……… 49

Gambar 46. Struktur senyawa glibenklamid ………. 50

Gambar 47. Struktur umum senyawa biguanida ……… 50

Gambar 48. Struktur senyawa fenformin ………... 50

Gambar 49. Struktur senyawa metformin ……… 51

Gambar 50. Sintesis dari metformin ……… 51

Gambar 51. Cara kerja obat sebagai Oral Hypoglicemic Agent ………. 52

Gambar 54. Grafik kadar gula darah mencit selama perlakuan ……….. 68

Gambar 55. Kromatografi lapis tipis (silika gel GF254 tebal 0,2 mm, ukuran plat

10 x 9 cm, jarak elusi 8 cm, fase gerak kloroform-etil asetat (9:1), penampak noda asam sulfat 10% dalam etanol) dari 6 fraksi gabung- an hasil kromatografi kolom ………. 75

Gambar 56. Kromatografi lapis tipis (silika gel GF254 tebal 0,2 mm, ukuran plat

10 x 6 cm, jarak elusi 8 cm, fase gerak petroleum eter-eter (1:1), penampak noda asam sulfat 10% dalam etanol) dari 4 fraksi gabung- an hasil kromatografi kolom ………. 77

Gambar 57. Kromatografi lapis tipis isolat (fraksi D3) hasil kromatografi kolom

(silika gel GF254 pada berbagai fase gerak, tebal 0,2 mm, ukuran plat

10 x 2 cm, jarak elusi 8 cm, penampak noda asam sulfat 10% dalam etanol ………. 78

Gambar 58 Spektrum inframerah dari fraksi D3 menggunakan pellet KBr ………. 80

Gambar 59. Posisi gugus OH dalam konformasi ekuatorial ………. 82

Gambar 60. Spektrum NMR-13C (100 MHz, CDCl3) dari fraksi D3 ………….. 82

Gambar 61 Spektrum DEPT dari fraksi D3 ……….. 84

Gambar 62 Spektrum MS dari fraksi D3 ………... 85

Gambar 63 Delapan kemungkinan senyawa dengan massa 414 ……….. 86 Gambar 64 Pemutusan metil terminal disertai dengan pengeluaran molekul air …. 88 Gambar 65 Pembentukan ion molekul m/z 396 dan m/z 371 ………….…………... 88 Gambar 66 Pemutusan rantai sisi disertai dengan pelepasan molekul air …………. 88

Gambar 67 Dua mekanisme fragmentasi dari Δ5-sterol menghasilkan m/z 329

dan 111 ……….. 90 Gambar 68 Pemutusan metil terminal disertai dengan pengeluaran molekul air …. 91 Gambar 69 Pembentukan ion molekul m/z 396 dan m/z 371 ……….………. 91 Gambar 70. Pemutusan rantai sisi disertai dengan pelepasan molekul air ………… 91 Gambar 71 Pemutusan C-16, C-17 dan molekul air ………. 92

Gambar 72 Reaksi retro Diels-Alder dari ikatan Δ7 ……….. 92

Gambar 75 Spektrum NMR-1H (400 MHz, CDCl3) dari fraksi D3 ……….. 94

Gambar 76 Perbesaran spektrum NMR-1H dari fraksi D3 ……… 95

Gambar 77 Spektrum HMQC dari fraksi D3 ……… 96

Gambar 78 Perbesaran spektrum HMQC dari fraksi D3 ………... 97

Gambar 79 Spektrum COSY dari fraksi D3 ……….. 99

Gambar 80 Perbesaran spektrum COSY dari fraksi D3 ………. 100

Gambar 81 Korelasi antara proton-proton dalam spektrum COSY dari fraksi D3 … 101 Gambar 82 Spektrum HMBC dari fraksi D3 ………. 102

Gambar 83 Perbesaran spektrum HMBC dari fraksi D3 ………..…. 103

Gambar 84 Korelasi yang terjadi pada karbon C-1, C-5, C-9, dan C-10 …………. 104

Gambar 85 Korelasi yang terjadi pada karbon C-12, C-13, C-14, C-16, dan C-17 . 104 Gambar 86 Korelasi yang terjadi pada karbon C-17, C-20, dan C-22 …………..… 105

Gambar 87 Korelasi yang terjadi pada karbon C-24, C-25, C-26, C-27, C-28, dan C-29 ………... 105

Gambar 88 Korelasi antara karbon dengan proton dalam spektrum HMBC ………. 106

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 1. Karakteristik Tumbuhan Santalum album …..……….………... 10

Tabel 2. Nilai absorpsi inframerah ikatan C-O streching untuk senyawa dengan

penggabungan cis- atau trans- cincin A/B, suatu ikatan rangkap dua

dalam cincin B atau suatu group 3α/β-hidroksil ……….………… 29

Tabel 3. Chemical shift (δ, ppm; CDCl3) dari signal H-3 metin dan metil 3-ase-

toksi dalam spektrum NMR-1H dari sterol dan triterpena alkohol ……. 33

Tabel 4. Chemical shift (δ, ppm; CDCl3) dari signal proton olefinat dan allilat

dalam spektrum NMR-1H dari sterol ………. 35

Tabel 5. Karakteristik chemical shift 13C dari sterol dan triterpena alkohol …… 37

Tabel 6. Negara dengan angka tertinggi penderita diabetes mellitus (juta) ……. 44

Tabel 7. Rancangan Penelitian yang digunakan (Rancangan Acak Lengkap) …. 64

Tabel 8. Tabel ANAVA ……… 65 Tabel 9. Hasil uji fitokimia ekstrak metanol pekat akar S. album ….……….….. 66 Tabel 10. Data kadar gula darah mencit setelah pemberian suspensi ekstrak

Akar S. album ………. 67

Tabel 11. Hasil perhitungan Anava kadar gula darah mencit selama 30 menit

perlakuan ……….... 68

Tabel 12. Hasil perhitungan uji beda Duncan kadar gula darah mencit setelah

30 menit perlakuan ……….……… 69

Tabel 13. Hasil perhitungan Anava kadar gula darah mencit setelah 60 menit

perlakuan ……… 69

Tabel 14. Hasil perhitungan uji beda Duncan kadar gula darah mencit setelah

60 menit perlakuan ……….……… 69

Tabel 15. Hasil perhitungan Anava kadar gula darah mencit setelah 90 menit

perlakuan ……….……….. 70

Tabel 17. Hasil perhitungan Anava kadar gula darah mencit setelah 120 menit

perlakuan ……… 71

Tabel 18. Hasil perhitungan uji beda Duncan kadar gula darah mencit setelah 120 menit perlakuan ………..……… 71

Tabel 19. Hasil perhitungan Anava kadar gula darah mencit setelah 150 menit perlakuan ………... 72

Tabel 20. Hasil perhitungan uji beda Duncan kadar gula darah mencit setelah 150 menit perlakuan ………..……… 72

Tabel 21. Hasil perhitungan Anava kadar gula darah mencit setelah 180 menit perlakuan ……….………. 73

Tabel 22. Hasil perhitungan uji beda Duncan kadar gula darah mencit setelah 180 menit perlakuan ……….. 73

Tabel 23. Perbandingan aktivitas hipoglisemik berdasarkan uji Anava & Duncan 74 Tabel 24. Hasil uji fitokimia dan perolehan berat ekstrak dari fraksi kloroform dan air ………. 74

Tabel 25. Hasil uji steroid dan perolehan berat ekstrak dari fraksi A, B, C, D, E, dan F ……….. 76

Tabel 26. Hasil uji steroid dan perolehan berat ekstrak dari fraksi D1, D2, D3, dan D4………. 77

Tabel 27. Nilai Rf noda kromatogram lapis tipis dari fraksi D3 pada berbagai fase gerak ………..………. 79

Tabel 28. Interpretasi spektrum inframerah (bilangan gelombang, bentuk pita, intensitas, dan penempatan gugus terkait) dari isolat ………. 80

Tabel 29. Korelasi frekuensi C-O dengan stereokimia …….………. 81

Tabel 30. Data pergeseran kimia fraksi D3 ……….………..……… 83

Tabel 31. Perbandingan data NMR-13C hasil penelitian dan data literatur (Li-Lin Tay, 1997) ………..……… 83

Tabel 32. Data karbon CH2 dan CH/CH3 dari fraksi D3 ………..….. 84

Tabel 33. Data hubungan spektrum NMR-13C dan DEPT ……….…… 85

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Identifikasi Tumbuhan Santalum album Linn. ……… 114

Lampiran 2. Analisis Data dengan Metode Anava ……….. 115

Lampiran 3. Contoh Perhitungan ………. 118

Lampiran 4. Tabel Duncan ………... 122

Lampiran 5. Konformasi Chair-Boat-Chair-Boat-Unfold : Lanostana dan tipe yang berhubungan ………..……. 123

Lampiran 6. Konformasi Chair-Chair-Chair-Boat-Unfold : Dammarana dan tipe yang berhubungan ……… 124

Lampiran 7. Konformasi Chair-Chair-Chair-Boat-Unfold : Lupana dan tipe yang berhubungan ……… 125-126 Lampiran 8. Konformasi Chair-Chair-Chair-Chair-Chair : Hopana dan tipe yang berhubungan ……… 127

Lampiran 9. Konformasi Chair-Boat-Chair-Chair-Boat : Arborana dan tipe yang berhubungan ……… 128

Lampiran 10. Kerangka dan Penomoran Steroid .………..… 129

Lampiran 11. Hidrokarbon induk, cincin dan rantai sisi untuk sterol ……… 130

Lampiran 12. Posisi Karakteristik Pita Inframerah ……… 131

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Indonesia merupakan salah satu negara yang memiliki hutan tropis yang amat luas dan negara kedua terkaya dengan keanekaragaman hayati sesudah Brazilia (Achmad, 1995). Hutan tropis tersebut merupakan sumber daya alam yang menjadi harta kekayaan serta tambang untuk eksplorasi bahan-bahan kimia yang sangat potensial untuk dikembangkan sebagai salah satu tiang penyangga pembangunan nasional. Indonesia memiliki sekitar 25.000 spesies tumbuhan endemik dan 2000 spesies di antaranya secara etnobotani memiliki kegunaan sebagai bahan pangan, sandang, dan papan. Selanjutnya sekitar 900 spesies tumbuhan tersebut telah digunakan sebagai obat tradisional untuk berbagai macam penyakit (Heyne, 1987). Data tersebut menunjukkan bahwa belum maksimalnya eksplorasi yang dilakukan dalam upaya menelusuri bahan-bahan kimia (metabolit sekunder) yang terkandung dalam tumbuhan tersebut.

Metabolit sekunder yang dihasilkan oleh tumbuhan terbagi ke dalam beberapa golongan utama antara lain alkaloid, flavonoid, terpenoid dan terbentuk melalui empat jalur biosintesis yaitu asam sikimat, asam asetat malonat, poliketida, dan asam mevalonat. Banyak di antara metabolit sekunder tersebut mempunyai aktivitas biologis dapat mengobati berbagai penyakit, salah satunya adalah mengobati penyakit diabetes mellitus yang merupakan penyakit yang terjadi karena defisiensi insulin.

Berbagai obat diabetes mellitus telah disintesis seperti golongan sulfenilurea, biguanida, thiazolidinedion, dan meglitinida untuk dapat mengatasi diabetes mellitus. Berbagai kendala terjadi pada obat sintesis yaitu dapat memberikan efek samping (http://www.med.sc.edu:1082) dan biaya yang lebih besar dalam menghasilkan obat-obat tersebut (DeFronzo, 1999). Untuk mengatasi hal tersebut maka digalilah sumber dari tumbuhan-tumbuhan sebagai penghasil metabolit sekunder. Berbagai tumbuhan seperti bitter melon (Momordica charantia) digunakan sebagai obat tradisional untuk diabetes di India, Afrika dan Amerika Selatan. Buah dan benihnya mengandung

charantin (steroid glikosida) yang mempunyai aktivitas hipoglisemik. Benih Fenugreek (Trigonella foenum-gracum) mengandung diosgenin (sapogenin) yang berkhasiat mengobati diabetes mellitus. Gumar (Gymnema sylvestre) merupakan tumbuhan yang berpotensi dalam mengatasi diabetes mellitus. Daunnya mengandung senyawa aktif asam gymnemat (triterpenoid saponin). Aloe vera (Aloe barbadensis Muller) juga merupakan tumbuhan yang berkhasiat. Senyawa fitosterol yang dihasilkannya mempunyai aktivitas dalam mengatasi diabetes mellitus (http://www.nutraceu-ticalsworld.com).

Tumbuhan Santalum album Linn merupakan salah satu tumbuhan yang ada di Indonesia. Tumbuhan ini oleh masyarakat di Samarinda, akarnya digunakan sebagai obat tradisional dalam mengobati penyakit diabetes mellitus. Menurut literatur yang diperoleh bahwa tumbuhan S. album mengandung senyawa-senyawa seskuiterpena. Senyawa-senyawa ini terdapat dalam minyak S. album (Sandalwood oil). Seskuiterpena

yang terbanyak adalah α-santalol dan β-santalol (Christenson et al., 1981) disamping

santalena dan bergamotena. Senyawa santalol mempunyai aktivitas antibakteri dan sedatif (Mahon, 2004). Hubungan biosintesis antara seskuiterpena yang terdapat dalam tumbuhan S. album telah diteliti (Jones et al, 2006). Senyawa triterpenoid/steroid yang

telah dilaporkan dalam S. album (Gambar 1) terdapat dalam daun yaitu β-sitosterol

(steroid) dan dalam kulit batang yaitu amirin palmitat (triterpenoid ester). Amirin palmitat mempunyai aktivitas insektisida melawan Atteva fabriciella, Eligama norcissu dan Eupterote geminata (Malavadhani, 2004), sedangkan dalam akar belum ada publikasi yang menunjukkan adanya steroid.

Gambar 1. Senyawa triterpenoid/steroid dalam S. album O

H H

H

CH3(CH2)14

O

α-amirin palmitat

HO

Biosintesis senyawa seskuiterpena (C15) berasal dari prekursor farnesil

pirofosfat. Bila molekul farnesil pirofosfat mengalami dimerisasi satu sama lain maka akan dihasilkan suatu molekul lebih besar yaitu skualena. Skualena merupakan

prekursor dari senyawa triterpenoid (C30). Skualena dapat mengalami penataan ulang

dan disertai pembentukan cincin akan menghasilkan berbagai tipe kerangka triterpenoid sebagai berikut:

a. Konformasi Chair-Boat-Chair-Boat-Unfold menghasilkan senyawa triterpenoid tipe

Lanostana dan turunannya (Lampiran 5)

b. Konformasi Chair-Chair-Chair-Boat-Unfold menghasilkan senyawa triterpenoid

tipe Dammarana dan turunannya (Lampiran 6)

c. Konformasi Chair-Chair-Chair-Boat-Unfold menghasilkan senyawa triterpenoid

tipe Lupana, Oleanana, Ursana dan turunannya (Lampiran 7)

d. Konformasi Chair-Chair-Chair-Chair-Chair menghasilkan senyawa triterpenoid

tipe Hopana dan turunannya (Lampiran 8)

e. Konformasi Chair-Boat-Chair-Chair-Boad menghasilkan senyawa triterpenoid tipe Arborana dan turunannya (Lampiran 9)

Triterpenoid merupakan famili terbesar ketiga dari terpenoid. Kurang lebih 40 kerangka triterpenoid telah ditemukan. Senyawa triterpenoid dapat diklasifikasikan ke dalam 4 golongan besar yaitu triterpena dan steroid beserta glikosida dari keduanya (Dev, 1989). Beberapa senyawa triterpenoid mempunyai aktivitas seperti anti fungal, anti inflamasi, anti HIV, anti diabetes dan lain sebagainya (Beecher et al., 1989).

Penelitian mengenai kandungan senyawa triterpenoid/steroid dalam tumbuhan

S. album tidak banyak dibandingkan penelitian mengenai senyawa seskuiterpena,

padahal prekursor yang dihasilkan berupa farnesil pirofosfat melimpah. Hal ini dapat dilihat dari komponen terbanyak yaitu senyawa seskuiterpena.

Beberapa senyawa triterpenoid/steroid ada yang mempunyai aktivitas sebagai

Oral Hypoglycemic Agent (OHA). Senegin-II (Gambar 2), suatu triterpenoid glikosida

dari rhizoma Polygala senega L. var. latifolia Torrey et Gray (Polygalaceae) menunjukkan efek hipoglisemik. Ekstrak n-BuOH dari rhizoma senega (5 mg/kg)

menurunkan glukosa darah dari tikus normal dari 191 ± 3 sampai 120 ± 3 mg/dl 4 jam (Kako et al., 1996).

Kotalegenin-16 asetat (Gambar 3), suatu triterpenoid ester tipe Friedelana dari akar Salacia oblonga Wall. (Celastraceae) menunjukkan aktivitas menghambat aldosa reduktase. Aldosa reduktase adalah enzim yang mengubah glukosa menjadi sorbitol dan dihubungkan pada komplikasi diabetes kronik seperti periferal neuropathy, retinopathy dan katarak (Matsuda et al., 1999).

Gambar 2. Struktur senyawa senegin-II

O O OH HO OH OH HO H H OH O OH H O O O O OH O O O O O O O O O OH OH HO OH OH HO OH OH senegin-II O O OH O C O CH3 kotalegenin-16 asetat

Empat triterpenoid (Gambar 4) dari daun Gymnema inodorum menunjukkan aktivitas menghambat absorpsi glukosa dalam intestinal. Triterpenoid tersebut adalah

asam (3β,16β,22α)-16,28-dihidroksiolean-12-en-3-il-O-β-D-glukopiranosil-β

-D-gluko-piranosidu ronat (GiA-1), asam (3β,4α,16β)-16,23,28-trihidroksiolean-12-en-3-il-β

-D-glukopirano-siduronat (GiA-2), asam (3β,4α,16β,22α

)-22-(N-metilantraniloksi)-16,23,28-trihidroksi-olean-12-en-3-il-3-O-β-D-glukopiranosil-β-D-lukopiranosiduronat

(GiA-3) dan asam (3β,4α,16β,22α

)-22-(N-metilantraniloksi)-16,23,28-trihidroksiolean-12-en-3-il-β-D-gluko-piranosiduronat (GiA-4) (Shimizu et al., 2001).

R6H2C CH2R5

CH3 H3C

R1

CH2R3 R4

R2 CH3 CH3

O O

OR7 HOOC

HO R8O

CH3 H

H

H

Senyawa R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8

GiA-1 H H OH OH H H β-Glu H

GiA-2 H H OH OH OH H H H

GiA-3 H O-NMAt OH OH OH H H β-Glu

GiA-4 H O-NMAt OH OH OH H H Η

β-Glu : -β-glucopyranosyl; O-NMAt : -O-N-methylanthraniloxy

Gambar 4. Empat triterpenoid dari daun Gymnema inodorum

Asam dehidrotrametenolat, suatu triterpenoid tipe Lanostana dari Poria cocos Wolf (Polyporaceae) yang ditemukan pada akar tumbuhan pine menunjukkan efek sebagai insulin sensitizer (Sato et al., 2002). Asam colosolat dari daun Langerstonemia

speciosa (L.) Pers. (Lythraceae) menunjukkan sebagai aktivator transportasi glukosa

(Okada et al., 2003). Struktur asam dehidrotrametenolat dan asam colosolat dipaparkan dalam Gambar 5.

HO

OH HOOC

asam dehidrotrametenolat

HO O

COOH

asam colosolat

Gambar 5. Struktur senyawa asam dehidrotrametenolat dan asam colosolat

Lima fitosterol (Gambar 6) dari Aloe vera (Aloe barbadensis Muller) menunjukkan efek anti diabetes. Senyawa triterpenoid tersebut adalah lophenol, 24-metillophenol, 24-etillophenol, sikloartanol dan 24-metilena sikloartanol (Tanaka et al., 2006).

Gambar 6. Lima fitosterol dari Aloe vera Gambar 6. Lima fitosterol dari Aloe vera

HO

24-metil lophenol

HO

24-etil lophenol

HO

lophenol

HO

24-me

HO

Tumbuhan S. album telah dikembangkan penggunaannya sebagai medisinal dan aromaterapi. Penggunaannya (Mahon, 2004) adalah sebagai berikut :

a. Sistem pencernaan (digestive) membantu mengobati diare dan mual-mual (nausea)

b. Sistem pernafasan (respiratory) terutama untuk mengobati bronchitis, catarrh, batuk kering, laryngitis

c. Sistem saraf (nervous) mengobati migraine, insomnia, stres

d. Sistem kulit (skin care) mengobati dermatitis akut, akne, kulit kering (dry chapped

skin) dan kulit berminyak (greasy skin)

e. Aplikasi medisinal untuk mengobati penyakit mata, gonorrhea, herpes, infeksi, sebagai antiseptik, antibakteri, astringen, carminative, disinfektan, diuretik, ekspektoran, refrigeran, sedatif dan stimulan

f. Industri parfum : sebagai komponen fragrance dalam sabun, deterjen, kosmetik dan parfum sedangkan dalam industri makanan sebagai flavor ingredient dalam sebagian besar kategori makanan termasuk soft drink dan alkoholik drink

1.2 Perumusan Masalah

a. Apakah akar tumbuhan Santalum album Linn mengandung senyawa steroid.

b. Bagaimana cara-cara/teknik mengisolasi dan memurnikan senyawa steroid tersebut.

c. Bagaimana kerangka atau struktur senyawa steroid yang terdapat dalam akar S.

album.

d. Apakah akar tumbuhan S. album mempunyai aktivitas sebagai Oral Hypoglycemic

Agent.

1.3 Tujuan Penelitian

a. Mengisolasi senyawa steroid dari akar tumbuhan Santalum album.

b. Mengetahui cara-cara/teknik mengisolasi dan memurnikan senyawa steroid tersebut. c. Menentukan struktur senyawa steroid dengan menggunakan metode kimia (uji

kemurnian dengan berbagai pelarut) dan metode fisikokimia (menggunakan

spektrometer IR, NMR-1H, NMR-13C, DEPT, COSY, HMQC, HMBC, dan MS).

1.4 Manfaat Penelitian

a. Memberikan infomasi tentang kandungan senyawa steroid dari akar tumbuhan

Santalum album dan sebagai database tentang penyebaran senyawa steroid dalam

akar.

b. Memberikan infomasi tentang aktivitas dari akar tumbuhan Santalum album sebagai

obat diabetes mellitus alami yang ramah terhadap lingkungan dan murah sehingga dapat diaplikasikan dalam bidang kesehatan.

1.5 Metode Penelitian

Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah determinasi tumbuhan, pengambilan sampel, penelusuran pustaka, melakukan skrining fitokimia senyawa streroid dengan uji Liebermann-Burchard, melakukan isolasi dengan ekstraksi secara maserasi dan fraksinasi menurut kepolarannya, melakukan pemisahan dan pemurnian dengan menggunakan kromatografi kolom dan silika gel sebagai fase diam, melakukan uji kemurnian dengan cara kimia yaitu menggunakan kromatografi lapis tipis dengan berbagai pelarut, melakukan elusidasi struktur molekul dengan menggunakan

spektrometer IR, NMR-1H, NMR-13C, DEPT, COSY, HMQC, HMBC, dan MS, dan

melakukan uji aktivitas hipoglisemik dari ekstrak metanol akar tumbuhan Santalum

album untuk mengetahui khasiat akar tumbuhan S. album sebagai obat diabetes

BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Tempat dan Waktu

Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Penelitian, Laboratorium Biokimia, Laboratorium Kimia Organik Bahan Alam, Laboratorium Farmasi di Universitas Sumatera Utara - Medan, dimulai pada bulan September 2005 sampai Desember 2006.

3.2 Bahan Penelitian 3.2.1 Bahan Tumbuhan

Bahan tumbuhan yang digunakan dalam penelitian ini adalah akar tumbuhan Cendana (Santalum album Linn.) diperoleh dari pasar tradisional di kota Samarinda. Identifikasi tumbuhan dilakukan di Herbarium Bogoriense Bogor (Lampiran 1).

3.2.2 Bahan Kimia

Bahan kimia yang digunakan terdiri atas berbagai jenis pelarut organik teknis dan proanalis yang biasa digunakan di Laboratorium Kimia Organik Bahan Alam seperti metanol teknis, kloroform, akuades, n-heksan, etil asetat, petroleum eter, eter,

benzena, silika gel Merck GF254 untuk kromatografi lapis tipis, silika gel 60 (70-230

mesh, E. Merck) untuk kromatografi kolom, pereaksi Liebermann-Burchard untuk uji steroid, dan bahan yang digunakan untuk uji toleransi glukosa (aktivitas hipoglisemik) yaitu CMC (carboxy methyl cellulose) sebagai pensuspensi, glibenklamid, dan glukosa.

3.3 Hewan Percobaan

Hewan yang digunakan dalam penelitian ini adalah mencit jantan yang sehat dengan berat badan 25-38 g. Sebelum pengujian terlebih dahulu mencit dipelihara dan dirawat dengan sebaik-baiknya sekurang-kurangnya selama 2 minggu. Selanjutnya dapat digunakan lagi secara berulang untuk percobaan berikutnya setelah interval masa istirahat beberapa lama (Ditjen POM, 1979).

3.4 Peralatan

Alat-alat yang digunakan terdiri atas berbagai alat gelas yang biasa digunakan di Laboratorium Kimia Organik Bahan Alam seperti seperangkat alat destilasi, corong pisah, neraca analitik Mettler PM480 Delta Range, evaporator R 114 Buchi dilengkapi dengan sistem vakum Buchi B 169, oven, kromatografi kolom, sumber UV Matsui MT-09 MHE dan Mineralight Lamp Model UVG-54, spektroskopi inframerah FTIR Perkin

Elmer 1600, spektroskopi JEOL 400 MHz JNM-FX400 (NMR-1H, NMR-13C, DEPT

dan NMR-2D), dan spektroskopi massa Shimadzu QP2000A 70 eV untuk penentuan struktur. Neraca hewan (GW-1500), glucometer dan glucotest strip (EZ Smart), Syringe 1 ml, mortir dan pemanas air untuk uji aktivitas hipoglisemik.

3.5 Prosedur Kerja

3.5.1 Pengujian Triterpenoid/Steroid

Sepuluh gram akar tumbuhan S. album halus diekstraksi dengan metanol. Ekstrak metanol kemudian diuapkan dan diekstraksi dengan eter. Residu yang tidak larut dalam eter dikocok kuat-kuat. Adanya busa yang stabil selama 30 menit menunjukkan adanya saponin. Selanjutnya dihidrolisis dengan asam klorida 2 N sebanyak 4 ml dan disaring. Endapan diuji dengan pereaksi Liebermann-Burchard. Warna ungu menunjukkan adanya saponin. Ekstrak eter diuji dengan pereaksi Liebermann-Burchard. Warna hijau menunjukkan adanya steroid dan warna merah menunjukkan adanya triterpena (Lajis, 1985).

3.5.2 Ekstraksi dan Fraksinasi

Serbuk akar tumbuhan S. album sebanyak 2,0 kg diekstraksi secara maserasi dengan menggunakan pelarut metanol selama 24 jam sambil diaduk. Ekstrak metanol dipisahkan dengan cara penyaringan. Maserasi ini dilakukan selama 3 x 24 jam sehingga kandungan senyawa kimia dalam bahan terekstraksi semaksimal mungkin ke dalam pelarut metanol. Ekstrak metanol kemudian dipekatkan dengan menggunakan evaporator sampai diperoleh ekstrak metanol pekat (48,3 g; 2,415%).

Ekstrak metanol pekat yang diperoleh diambil 250,0 mg untuk uji aktivitas hipoglisemik, sisanya sebanyak 40,0 g disuspensi dengan akuades dan difraksinasi

dengan menggunakan pelarut kloroform. Selanjutnya masing-masing fraksi dipekatkan dan diuji steroid. Bagan kerja tahap ekstraksi dan fraksinasi tersebut ditunjukkan pada

Gambar 52, ternyata fraksi ekstrak CHCl3 positif steroid sedangkan fraksi air negatif

steroid.

Serbuk akar

S. album

(2,0 kg)

- dievaporasi pada suhu 40oC

Ekstrak MeOH kental (48,3 g; 2,415%)

- disuspensi dgn akuades

- diekstraksi dgn CHCl₃

Ekstrak CHCl₃

(4,2309 g; 10,577%) Ekstrak H2O

- dimaserasi dgn MeOH 80% (3 x @ 4 L) - disaring

- diuji aktivitas hipoglisemik

40,0 g

Ekstrak MeOH kental

aktivitas hipoglisemik (+)

- diuji L-B steroid

(+) 250,0 mg

Ekstrak MeOH kental

- diuji L-B steroid

(-)

Gambar 52. Bagan kerja tahap ekstraksi dan fraksinasi

3.5.3 Pemisahan dan Pemurnian

Ekstrak kloroform yang menunjukkan positif steroid dipisahkan dengan cara kromatografi kolom menggunakan fase diam silika gel 60 dan dielusi secara isokratik dengan menggunakan pelarut n-heksana–etil asetat (82:18) dengan penampungan 5 ml

setiap fraksi. Semua fraksi hasil pemisahan kromatografi kolom selanjutnya dilakukan

analisis dengan menggunakan kromatografi lapis tipis untuk melihat noda dengan Rf yang

sama. Fraksi-fraksi dengan noda yang sama pada kromatografi lapis tipis digabungkan dan diuapkan pelarutnya. Kemudian fraksi yang diperoleh diuji steroid ternyata fraksi A, B, C, E, dan F negatif terhadap steroid sedangkan fraksi D positif terhadap steorid sehingga fraksi D dimurnikan kembali dengan menggunakan kromatografi kolom. Bagan kerja dari proses pemisahan dan pemurnian ditunjukkan pada Gambar 53.

- hasilnya di KLT (noda dgn R_f sama digabung) pengembang : CHCl₃-EtOAc (9:1)

Fraksi A 8-15 (278,1 mg)

Ekstrak CHCl₃ (2,0 g) Fraksi B 19-26 (99,7 mg) Fraksi C 36-40 (81,9 mg) Fraksi D 52-59 (51,9 mg) Fraksi E 79-104 (24,5 mg)

- di KK dgn silika gel 60 (70-230 mesh) dielusi secara isokratik dengan eluen : n-heksana-EtOAc (82:18) - ditampung tiap 5 ml

Fraksi F 128-170 (50,0 mg)

- hasilnya di KLT (noda dgn R_f sama digabung) pengembang : petroleum eter-eter (1:1) - di KK dgn silika gel 60 (>200 mesh)

dielusi secara isokratik dengan eluen petroleum eter-eter (40:60) - ditampung tiap 1 ml

Fraksi D1

12-15 (13,2 mg)

Fraksi D2

22-24 (9,4 mg)

Fraksi D3

33-34 (11,4 mg)

Fraksi D4

39-43 (14,3 mg)

steroid (+) steroid (+) steroid (+) steroid (+)

steroid (-) steroid (-) steroid (-) steroid (+) steroid (-) steroid (-)

Gambar 53. Bagan kerja tahap pemisahan dan pemurnian

Fraksi D1, D2, dan D3 telah dikirim ke Malaysia ternyata fraksi D3 yang telah

lengkap data spektroskopinya, fraksi D4 setelah dikromatografi lapis tipis memberikan 2

3.5.4 Uji Kemurnian dan Penentuan Sifat Fisis

Uji kemurnian fraksi D3 dilakukan dengan kromatografi lapis tipis dengan

menggunakan berbagai eluen. Penggunaan GC-MS atau HPLC dapat juga dilakukan untuk menguji kemurnian. Pengukuran sifat fisis yaitu titik leleh diukur dengan menggunakan alat Fisher-John Melting Point.

3.5.5 Identifikasi dan Penentuan Struktur Molekul

Penentuan struktur molekul fraksi D3 dilakukan dengan menggunakan

spektroskopi inframerah, spektroskopi NMR 1D yaitu NMR-1H, NMR-13C, DEPT

(Distortionless Enhancement by Polarization Transfer); spektroskopi NMR 2D yaitu

COSY (1H-1H Homonuclear Correlated Spectroscopy), HMQC (1H-13C Heteronuclear

Multiple Quantum Coherence), HMBC (1H-13C Heteronuclear Multiple Bond Connectivity), dan spektroskopi massa yang dilakukan di Laboratorium Jurusan Kimia

Fakultas Sains Universitas Malaya − Malaysia atas bantuan Dr. Nurdin Saidi dari

Universitas Syiah Kuala – Banda Aceh.

3.5.6 Uji Aktivitas Hipoglisemik

3.5.6.1 Pembuatan Larutan Glukosa 50% (b/v)

Sebanyak 50 g glukosa dilarutkan dengan akuades dalam labu 100 ml.

3.5.6.2 Pembuatan Suspensi CMC (carboxy methyl cellulose) 0,5% (b/v)

Sebanyak 10 ml akuades panas (± 60°C) dimasukkan ke dalam mortir, kemudian

sebanyak 0,5 g CMC ditaburkan secara merata, ditutup dan dibiarkan selama ± 15 menit

hingga diperoleh massa transparan, lalu digerus hingga homogen. Kemudian ditambahkan akuades, diaduk dengan cepat hingga terbentuk suspensi, lalu dimasukkan ke dalam labu ukur 100 ml dan dicukupkan dengan akuades hingga garis tanda.

3.5.6.3 Pembuatan Suspensi Glibenklamid 0,02% (b/v)

Sebanyak 0,5 g CMC ditaburkan ke dalam mortir yang berisi akuades panas (±

digerus halus dalam mortir ditambahkan gel CMC sedikit demi sedikit. Kemudian ditambahkan akuades, diaduk dengan cepat hingga terbentuk suspensi, dimasukkan ke dalam labu ukur 100 ml, dicukupkan dengan akuades hingga garis tanda.

3.5.6.4 Pembuatan Suspensi Ekstrak Metanol Santalum album 1% (b/v)

Sebanyak 0,5 g CMC ditaburkan ke dalam mortir yang berisi akuades panas (±

60°C) sebanyak 10 ml, ditutup dan dibiarkan ± 15 menit hingga diperoleh massa

transparan, lalu digerus hingga homogen. Ke dalam 250 mg ekstrak metanol akar S.

album yang telah digerus halus dalam mortir ditambahkan gel CMC sedikit demi

sedikit. Kemudian ditambahkan akuades, diaduk dengan cepat hingga terbentuk suspensi, dimasukkan ke dalam labu ukur 25 ml, dicukupkan dengan akuades hingga garis tanda.

3.5.6.5 Prosedur Kerja Pengujian Efek Farmakologi

Setiap awal percobaan, mencit dipuasakan (tidak makan tetapi tetap minum) selama 16 jam, kemudian berat badan mencit ditimbang. Kadar gula darah ditentukan dengan cara mengambil darah melalu vena ekor yang ditusuk dengan menggunakan jarum suntik. Darah yang keluar dioleskan pada glikostrip yang terpasang pada

glucotest. Dibiarkan selama 8 detik, alat akan bekerja secara otomatis. Angka yang

tampil pada alat dicatat sebagai kadar gula darah (mg/dl).

3.5.6.6 Uji Aktivitas Hipoglisemik

Mencit dipuasakan selama 16 jam. Kemudian berat badan ditimbang dan diukur kadar gula darah puasa. Mencit kemudian diberi larutan glukosa 50% dosis 4 g/kg berat badan secara per oral. Kadar gula darah mencit diukur pada selang waktu 30, 60, 90, 120, 150, 180 menit. Cara penentuan kadar gula darah mencit sama seperti point 3.5.6.5.

3.5.6.7 Penentuan Efek Ekstrak Metanol Akar S.album Terhadap Penurunan Kadar Gula Darah

Mencit dipuasakan selama 16 jam. Kemudian berat badan ditimbang dan diukur kadar gula darah puasa. Kemudian mencit diberi larutan glukosa 50% dosis 4 g/kg berat

badan secara per oral. Setelah 30 menit diukur kadar gula darah mencit, kemudian masing-masing mencit diberi:

a. Suspensi kosong (CMC 0,5%) dosis 1% berat badan per oral

b. Suspensi ekstrak metanol akar S. album dosis 25 mg/kg berat badan per oral c. Suspensi ekstrak metanol akar S. album dosis 50 mg/kg berat badan per oral d. Suspensi ekstrak metanol akar S. album dosis 75 mg/kg berat badan per oral e. Suspensi glibenklamid dosis 1 mg/kg berat badan per oral

Kadar gula darah diukur pada selang waktu 60, 90, 120, 150, dan 180 menit. Cara penentuan kadar gula darah sama seperti point 3.5.6.5.

3.5.7 Penggunaan Alat

Alat glucometer secara otomatis akan hidup ketika strip dimasukkan dan akan mati ketika strip dicabut. Alat ini tidak menggunakan tombol. Dengan menyentuhkan setetes darah ke strip, reaksi dari wadah strip secara otomatis menyerap darah ke dalam strip melalui aksi kapiler. Ketika wadah terisi penuh oleh darah maka alat glucometer mulai mengukur tingkat glukosa darah. Hasil pengukuran diperoleh selama 8 detik.

2.5.7.1 Prosedur Penggunaan

a. Pengambilan darah mencit dalam keadaan puasa dilakukan dengan cara menyuntik ekor

mencit dengan menggunakan syringe.

b. Ekor yang telah disuntik dengan syringe kemudian diurut ke bawah dengan tujuan agar darah keluar.

c. Kemudian darah mencit tersebut disentuhkan pad strip sampai terisi penuh. Pada layar akan muncul angka 8 dan dibiarkan menghitung mundur hingga keluar hasil pengukuran.

d. Kemudian mencit diberikan larutan glukosa melalui oral dan masing-masing mencit diberikan CMC 1%, suspensi 25, 50, 75 mg/kg BB dan suspensi glibenklamid. Untuk pengukuran selanjutnya digunakan strip yang baru.

3.5.8 Metode Perhitungan Pengujian Efek Penurunan Kadar Gula Darah

Data hasil penelitian menggunakan Rancangan Acak Lengkap (Tabel 7), dianalisis dengan ANAVA (Tabel 8) pada tingkat kepercayaan 95% sedangkan untuk melihat perbedaan rata-rata yang nyata antar perlakuan dapat digunakan uji rata-rata Duncan.

Tabel 7. Rancangan Penelitian yang digunakan (Rancangan Acak Lengkap) Ulangan (r)

Perlakuan

(t) W0 W1 W2 W3 Wn

Jumlah (TA)

Rerata (YA)

CMC KGD0C KGD1C KGD2C KGD3C KGDnC ΣCMC YCMC

M25 KGD02 KGD12 KGD22 KGD32 KGDn2 ΣM25 YM25

M50 KGD05 KGD15 KGD25 KGD35 KGDn5 ΣM50 YM50

M75 KGD07 KGD17 KGD27 KGD37 KGDn7 ΣM75 YM75

SG KGD0G KGD1G KGD2G KGD3G KGDnG ΣSG YSG

Jumlah

(TV) ΣW0 ΣW1 ΣW2 ΣW3 ΣWn Tij Yij

Keterangan:

Yij = M + Tij + Eij ……… (1)

dimana : i = 1, 2, 3, ….. t j = 1, 2, 3, ….. r

Yij = respon varietas ke-i dan ulangan ke-j

M = nilai tengah umum

Tabel 8. Tabel ANAVA Sumber

Variasi db JK KT F Hit F Tabel

Perlakuan Galat

t-1 = V1

(rt-1)-(t-1) = V2

JK P JK G

JK P/V1

JK G/V2

KT P/KT G* F (V1,V2)

Total rt-1 JK P + JK G

Keterangan:

FK =Tij2 / rt……….……..…….. (2)

JK Total = T (Yij2) – FK……….. (3)

JK Perlakuan = (TA2 / r) – FK ……..………. (4)

JK Galat = JK Total – JK Perlakuan ……….. (5)

dimana : FK = Faktor Koreksi JK = Jumlah Kuadrat db = derajat kebebasan

Bila F Hitung > F Tabel (α = 0,05), maka Ho ditolak artinya ada perbedaan yang

nyata antara kedua nilai rata-rata kadar gula darah mencit. Jadi suspensi ekstrak metanol akar Santalum album tersebut berkhasiat menurunkan kadar gula darah mencit.

Bila F Hitung < F Tabel (α = 0,05), maka Ho diterima artinya tidak ada

perbedaan yang nyata antara kedua nilai rata-rata kadar gula darah mencit. Dengan demikian suspensi ekstrak metanol akar Santalum album tersebut tidak berkhasiat menurunkan kadar gula darah mencit.

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Pengumpulan Bahan Tumbuhan S. album

Bahan tumbuhan berupa akar diperoleh dari kota Samarinda.

4.2 Tahap Ekstraksi Tumbuhan S. album

Pada tahap ekstraksi serbuk akar S. album sebanyak 2 kg dimaserasi dengan metanol pada suhu kamar. Maserasi dilakukan selama 24 jam dengan tiga kali perulangan hingga diharapkan semua komponen senyawa terekstraksi ke dalam pelarut metanol (maserat metanol diuji dengan kromatografi lapis tipis hingga tidak menunjukkan noda). Maserat dikumpulkan kemudian diuapkan pelarutnya dengan evaporator pada suhu 40°C. Ekstrak metanol pekat yang diperoleh seberat 48,3 g (rendemen 2,415% dari 2 kg) dan berwarna merah gelap.

Selanjutnya ekstrak metanol pekat diuji fitokimia. Hasil uji fitokimia menunjukkan bahwa ekstrak metanol pekat mengandung steroid. Hasil uji tersebut ditunjukkan pada Tabel 9.

Tabel 9. Hasil uji fitokimia ekstrak metanol pekat akar S. album Steroid

(Liebermann-Burchard)

Alkaloid (Dragendorff)

Flavonoid (Mg-HCl pekat) Warna hijau

+ - -

Ekstrak metanol pekat kemudian dibagi dua, sebanyak 25,0 mg digunakan untuk uji aktivitas hipoglisemik dengan menggunakan hewan mencit dan sebanyak 40,0 g dilanjutkan pada tahap fraksinasi dengan menggunakan pelarut kloroform.

4.3 Uji Aktivitas Hipoglisemik Ekstrak Metanol

Data uji aktivitas hipoglisemik ekstrak metanol akar tumbuhan Santalum album Linn terhadap mencit dipaparkan dalam Tabel 10 dan Gambar 54.

Tabel 10. Data kadar gula darah mencit setelah pemberian suspensi ekstrak akar S. album

KGD setelah pemberian larutan glukosa 50% 4g/kg (menit) Kelompok

Perlakuan

BB Mencit (g)

KGD puasa

(mg/ml) 30 60 90 120 150 180

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

1 30,70 108 258 207 147 129 116 113

2 32,80 110 263 211 150 132 118 115

3 36,20 119 284 228 162 142 128 125

4 36,00 117 281 226 161 141 127 124

5 35,90 110 263 211 151 132 119 116

6 36,80 121 289 232 165 145 130 127

rata-rata 114 273 219 156 137 123 120

CM

C 1%

sd 5,59 13,38 10,73 7,64 6,71 6,03 5,88

1 30,80 110 244 162 130 128 122 93

2 34,50 98 217 144 116 114 108 83

3 34,90 108 239 159 128 126 120 92

4 35,10 100 221 147 118 116 111 85

5 35,10 107 237 158 127 125 118 91

6 36,70 100 222 148 119 117 111 85

rata-rata 104 230 153 123 121 115 88

25 m g/ k g B B

sd 5,10 11,27 7,50 6,03 5,93 5,63 4,31

1 30,70 65 195 96 77 68 67 62

2 31,60 67 177 87 70 62 61 56

3 33,50 68 199 97 78 70 68 63

4 35,40 71 174 85 68 61 60 55

5 36,50 74 190 93 74 66 65 60

6 36,80 75 181 89 71 63 62 57

rata-rata 70 186 91 73 65 64 59

50 m g/ k g B b

sd 3,84 10,21 5,00 4,01 3,57 3,51 3,24

1 30,70 96 142 97 91 70 67 65

2 31,00 98 144 99 92 71 68 66

3 31,20 98 145 99 93 71 69 67

4 33,10 105 155 106 99 76 73 71

5 35,50 106 156 107 100 77 74 72

6 36,60 108 159 109 102 78 75 73

rata-rata 102 150 103 96 74 71 69

75 m g/ k g B B

sd 5,00 7,35 5,05 4,70 3,63 3,48 3,38

1 32,30 72 171 109 59 56 58 67

2 34,80 73 173 111 60 58 59 57

3 35,40 75 178 114 62 62 61 59

4 36,20 82 194 125 68 67 66 64

5 36,50 85 202 130 70 70 69 67

6 37,20 86 204 131 71 70 70 56

rata-rata 79 187 120 65 64 64 62

G li be nkl am id

Gambar 54. Grafik kadar gula darah mencit selama perlakuan

4.3.1 Pengaruh Pemberian Suspensi Ekstrak Metanol S. album, Glibenklamid dan CMC 1% terhadap Kadar Gula Darah Mencit pada 30 menit setelah perlakuan Hasil variansi menunjukkan bahwa pemberian suspensi ekstrak metanol S. album dan suspensi glibenklamid dengan dosis masing-masing menghasilkan perbedaan yang signifikan bila dibandingkan dengan kontrol (suspensi CMC 1%). Hal ini terbukti bahwa F Hitung > F Tabel (Tabel 11) berarti pemberian ekstrak metanol dan glibenklamid dengan dosis tersebut menyebabkan penurunan kadar gula darah mencit dibandingkan dengan kontrol.

Tabel 11. Hasil perhitungan Anava kadar gula darah mencit setelah 30 menit perlakuan

Sumber Variasi DB JK KT F Hitung F Tabel

Perlakuan 4 53642,5334 13410,6333 99,0494 2,7587

Galat 25 3384,8333 135,3933

Total 29 57027,3667

Untuk mengetahui perbedaan rata-rata tiap perlakuan dapat dilakukan uji beda rata-rata Duncan (Tabel 12) dan contoh perhitungan dapat dilihat pada Lampiran 3.

Tabel 12. Hasil perhitungan uji beda Duncan kadar gula darah mencit setelah 30 menit perlakuan

No. Perlakuan Rata-rata Notasi

1 Suspensi CMC 1% 273 a

2 Suspensi ekstrak metanol 25 mg/kg BB 230 b

3 Suspensi ekstrak metanol 50 mg/kg BB 186 c

4 Suspensi ekstrak metanol 75 mg/kg BB 150,17 d

5 Suspensi Glibenklamid 187 c

Kadar rata-rata gula darah mencit 30 menit setelah pemberian suspensi ekstrak metanol S. album dengan berbagai dosis menunjukkan perbedaan yang nyata bila dibandingkan dengan kontrol (CMC 1%) tetapi suspensi ekstrak metanol 50 mg/kg BB tidak berbeda nyata dengan suspensi glibenklamid. Hal ini berarti pemberian ekstrak metanol S. album dengan dosis 50 mg/kg BB memberikan efek hipoglisemik yang relatif sama dengan suspensi glibenklamid (ditunjukkan dengan notasi c).

4.3.2 Pengaruh Pemberian Suspensi Ekstrak Metanol S. album, Glibenklamid dan CMC 1% terhadap Kadar Gula Darah Mencit pada 60 menit setelah perlakuan Pemberian ekstrak metanol S. album dosis 25, 50, dan 75 mg/kg BB menunjukkan berbeda nyata dengan pemberian suspensi glibenklamid pada waktu 60 menit. Hal ini dapat dilihat dari nilai F Hitung > F Tabel (Tabel 13), selanjutnya untuk mengetahui perlakuan yang menunjukkan perbedaan rata-rata yang bermakna maka dilakukan uji beda rata-rata Duncan (Tabel 14).

Tabel 13. Hasil perhitungan Anava kadar gula darah mencit setelah 60 menit perlakuan

Sumber Variasi DB JK KT F Hitung F Tabel

Perlakuan 4 63384,8667 15846,2167 249,3896 2,7587

Galat 25 1588,5 63,54

Total 29 64973,3667

Tabel 14. Hasil perhitungan uji beda Duncan kadar gula darah mencit setelah 60 menit perlakuan

No. Perlakuan Rata-rata Notasi

1 Suspensi CMC 1% 219,17 a

2 Suspensi ekstrak metanol 25 mg/kg BB 153 b

3 Suspensi ekstrak metanol 50 mg/kg BB 91,17 c

4 Suspensi ekstrak metanol 75 mg/kg BB 102,83 c

Dari Tabel 14 terlihat bahwa kadar gula darah mencit pada selang waktu 60 menit setelah pemberian suspensi ekstrak metanol menunjukkan perbedaan yang signifikan terhadap suspensi glibenklamid dan kontrol (CMC 1%). Hal ini berarti bahwa suspensi ekstrak metanol 50 dan 75 mg/kg BB mempunyai efek hipoglisemik lebih besar daripada suspensi glibenklamid dalam menurunkan kadar gula darah mencit. Suspensi ekstrak metanol dosis 50 mg/kg BB tidak berbeda nyata dengan suspensi ekstrak metanol dosis 75 mg/kg BB, hal ini berarti bahwa suspensi ekstrak metanol dosis 50 dan 75 mg/kg BB mempunyai efek hipoglisemik yang relatif sama.

4.3.3 Pengaruh Pemberian Suspensi Ekstrak Metanol S. album, Glibenklamid dan CMC 1% terhadap Kadar Gula Darah Mencit pada 90 menit setelah perlakuan Pada selang waktu 90 menit setelah pemberian perlakuan, suspensi ekstrak metanol dosis 25, 50 dan 75 mg/kg BB menunjukkan berbeda nyata dengan kontrol (CMC 1%). Hal ini dapat dilihat dari nilai F Hitung > F Tabel (Tabel 15). Untuk menngetahui perbedaan rata-rata antara perlakuan dilakukan uji beda rata-rata Duncan (Tabel 16)

Tabel 15. Hasil perhitungan Anava kadar gula darah mencit setelah 90 menit perlakuan

Sumber Variasi DB JK KT F Hitung F Tabel

Perlakuan 4 33594,1334 8398,5333 264,1605 2,7587

Galat 25 794,8333 31,7933

Total 29 34388,9667

Tabel 16. Hasil perhitungan uji beda Duncan kadar gula darah mencit setelah 90 menit perlakuan

No. Perlakuan Rata-rata Notasi

1 Suspensi CMC 1% 156 a

2 Suspensi ekstrak metanol 25 mg/kg BB 123 b

3 Suspensi ekstrak metanol 50 mg/kg BB 73 c

4 Suspensi ekstrak metanol 75 mg/kg BB 96,17 d

5 Suspensi Glibenklamid 65 c

Dari Tabel 16 menunjukkan bahwa suspensi ekstrak metanol dosis 25 dan 75 mg/kg BB berbeda nyata dengan suspensi glibenklamid dan kontrol (CMC 1%), sementara suspensi ekstrak metanol dosis 50 mg/kg BB juga berbeda nyata dengan

kontrol (CMC 1%) tetapi tidak berbeda nyata dengan glibenklamid. Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak metanol 50 mg/kg BB mempunyai efek hipoglisemik yang relatif sama dengan glibenklamid. Ekstrak metanol dosis 75 mg/kg BB menunjukkan penurunan efek hipoglisemik bila dibandingkan dengan ekstrak metanol dosis 50 mg/kg BB dan glibenklamid dimana pada selang waktu 60 menit setalah pemberian perlakuan dosis 75 mg/kg BB mempunyai efek hipoglisemik lebih besar dari glibenklamid.

4.3.4 Pengaruh Pemberian Suspensi Ekstrak Metanol S. album, Glibenklamid dan CMC 1% terhadap Kadar Gula Darah Mencit pada 120 menit setelah perlakuan Pada selang waktu 120 menit setelah pemberian perlakuan, suspensi ekstrak metanol dosis 25, 50 dan 75 mg/kg BB juga menunjukkan berbeda nyata dengan kontrol (CMC 1%). Hal ini dapat dilihat dari nilai F Hitung > F Tabel (Tabel 17). Untuk menngetahui perbedaan rata-rata antara perlakuan dilakukan uji beda rata-rata Duncan (Tabel 18).

Tabel 17. Hasil perhitungan Anava kadar gula darah mencit setelah 120 menit perlakuan

Sumber Variasi DB JK KT F Hitung F Tabel

Perlakuan 4 28220,2000 7055,0500 248,2424 2,7587

Galat 25 710,5000 28,4200

Total 29 28930,7000

Tabel 18. Hasil perhitungan uji beda Duncan kadar gula darah mencit setelah 120 menit perlakuan

No. Perlakuan Rata-rata Notasi

1 Suspensi CMC 1% 136,83 a

2 Suspensi ekstrak metanol 25 mg/kg BB 121 b

3 Suspensi ekstrak metanol 50 mg/kg BB 65 c

4 Suspensi ekstrak metanol 75 mg/kg BB 73,83 d

5 Suspensi Glibenklamid 63,83 c

Pada selang waktu 120 menit setelah pemberian perlakuan tidak berbeda dengan selang waktu 90 menit dimana suspensi ekstrak metanol S. album dosis 50 mg/kg BB menunjukkan tidak berbeda nyata dengan glibenklamid, hal ini berarti bahwa ektrak metanol dosis 50 mg/kg BB dan glibenklamid mempunyai efek hipoglisemik yang relatif sama, sedangkan ekstrak metanol dosis 25 dan 75 mg/kg BB menunjukkan

berbeda nyata dengan glibenklamid dan kontrol (CMC 1%). Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak metanol dosis 25 dan 75 mg/kg BB tidak mempunyai efek hipoglisemik yang relatif sama dengan glibenklamid pada selang waktu 120 menit.

4.3.5 Pengaruh Pemberian Suspensi Ekstrak Metanol S. album, Glibenklamid dan CMC 1% terhadap Kadar Gula Darah Mencit pada 150 menit setelah perlakuan Pemberian suspensi ekstrak metanol S. album, dan glibenklamid pada selang waktu 150 menit menunjukkan berbeda nyata pada uji Anava (Tabel 19). Hal ini terlihat bahwa F Hitung > F Tabel. Untuk mengetahui perbedaan rata-rata dari tiap perlakuan dilakukan uji beda rata-rata Duncan (Tabel 20).

Tabel 19. Hasil perhitungan Anava kadar gula darah mencit setelah 150 menit perlakuan

Sumber Variasi DB JK KT F Hitung F Tabel

Perlakuan 4 20453 5113,2500 216,0516 2,7587

Galat 25 591,6667 23,6668

Total 29 21044,6667

Tabel 20. Hasil perhitungan uji beda Duncan kadar gula darah mencit setelah 150 menit perlakuan

No. Perlakuan Rata-rata Notasi

1 Suspensi CMC 1% 123 a

2 Suspensi ekstrak metanol 25 mg/kg BB 115 b

3 Suspensi ekstrak metanol 50 mg/kg BB 63,83 c

4 Suspensi ekstrak metanol 75 mg/kg BB 71 c

5 Suspensi Glibenklamid 63,83 c

Dari Tabel 20 terlihat bahwa ekstrak metanol dosis 50 dan 75 mg/kg BB berbeda nyata dengan kontrol (CMC 1%) tetapi tidak berbeda nyata dengan glibenklamid. Ini berarti bahwa ekstrak metanol 50 dan 75 mg/kg BB mempunyai efek hipoglisemik yang relatif sama dengan glibenklamid, sementara ekstrak metanol dosis 25 mg/kg BB berbeda nyata dengan kontrol dan glibenklamid, berarti tidak mempunyai efek hipoglisemik yang relatif sama dengn glibenklamid. Pada selang waktu 150 menit ekstrak metanol dosis 75 mg/kg kembali menunjukkan efek hipoglisemik yang relatif sama dengan glibenklamid dan ekstrak metanol dosis 50 mg/kg BB dimana pada selang waktu 120 menit dosis 75 mg/kg BB menunjukkan penurunan dari efek hipoglisemik.

4.3.6 Pengaruh Pemberian Suspensi Ekstrak Metanol S. album, Glibenklamid dan CMC 1% terhadap Kadar Gula Darah Mencit pada 180 menit setelah perlakuan Pada selang waktu 180 menit setelah pemberian perlakuan suspensi ekstrak metanol S. album dosis 25, 50, dan 75 mg/kg BB menunjukkan berbeda nyata dengan kontrol (CMC 1%), hal ini terlihat dalam uji Anava (Tabel 21) bahwa F Hitung > F Tabel. Untuk mengetahui perbedaan rata setiap perlakuan dilakukan uji beda rata-rata Duncan (Tabel 22).

Tabel 21. Hasil perhitungan Anava kadar gula darah mencit setelah 180 menit perlakuan

Sumber Variasi DB JK KT F Hitung F Tabel

Perlakuan 4 15424,4667 3856,1167 189,3967 2,7587

Galat 25 509 20,3600

Total 29 15933,4667

Tabel 22. Hasil perhitungan uji beda Duncan kadar gula darah mencit setelah 180 menit perlakuan

No. Perlakuan Rata-rata Notasi

1 Suspensi CMC 1% 120 a

2 Suspensi ekstrak metanol 25 mg/kg BB 88,17 b

3 Suspensi ekstrak metanol 50 mg/kg BB 58,83 c

4 Suspensi ekstrak metanol 75 mg/kg BB 69 d

5 Suspensi Glibenklamid 61,67 c

Dari Tabel 22 menunjukkan bahwa suspensi ekstrak metanol dosis 25 dan 75 mg/kg BB berbeda nyata dengan kontrol (CMC1%) dan glibenklamid, berarti bahwa dosis 25 dan 75 mg/kg BB tidak mempunyai efek hipoglisemik yang relatif sama dengan glibenklamid. Ekstrak metanol dosis 50 mg/kg BB menunjukkan berbeda nyata dengan kontrol (CMC1%) tetapi tidak berbeda nyata dengan glibenklamid. Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak metanol dosis 50 mg/kg BB mempunyai efek hipoglisemik yang relatif sama dengan glibenklamid. Dari hasil uji Anava dan Duncan dapat ditabulasikan dalam Tabel 23 aktivitas hipoglisemik dari ekstrak akar S. album dari 30 menit sampai 180 menit perlakuan.

Tabel 23. Perbandingan aktivitas hipoglisemik berdasarkan uji Anava & Duncan

Menit setelah perlakuan Aktivitas hipoglisemik Keterangan

30 menit setelah perlakuan 50 mg/kg BB & Glibenklamid tn

60 menit setelah perlakuan 50 & 75 mg/kg BB tn

90 menit setelah perlakuan 50 mg/kg BB & Glibenklamid tn 120 menit setelah perlakuan 50 mg/kg BB & Glibenklamid tn 150 menit setelah perlakuan 50 mg/kg BB & Glibenklamid tn 180 menit setelah perlakuan 50 & 75 mg/kg BB & Glibenklamid tn tn = tidak beda nyata

Tabel 23 menunjukkan bahwa dosis 50 mg/kg BB mempunyai kekuatan aktivitas hampir sama dengan glibenklamid (obat antidiabetes) daripada dosis 75 mg/kg BB selama perlakuan dari 30 menit sampai 180 menit perlakuan. Semakin besar dosis akan semakin mahal dan senyawa lain yang terdapat dalam ekstrak MeOH akar S. album semakin besar kuantitasnya dimana senyawa ini mungkin mempunyai aktivitas yang berlawanan atau bersifat toksik, namun begitu dosis 75 mg/kg BB tidak diperiksa dalam penelitian ini.

4.4 Tahap Fraksinasi

Ekstrak metanol pekat sebanyak 40 g disuspensi dengan akuades dan dipartisi dengan kloroform (CHCl3:H2O; 1:1) (Metode Banthorpe). Perlakuan ini bertujuan untuk mengekstraksi senyawa steroid bebas (non-glikosida) dalam ekstrak metanol agar terlarut dalam pelarut kloroform. Masing-masing ekstrak kemudian dipekatkan dan diuji steroid . Hasil uji fitokimia ditunjukkan pada Tabel 24.

Tabel 24. Hasil uji fitokimia dan perolehan berat ekstrak dari fraksi kloroform dan air.

Fraksi Uji Steroid

(Pereaksi Liebermann-Burchard) Berat (g)

Rendemen (%) dari 40 g Kloroform

Air

Warna hijau -

4,2309 -

10,577 - Tabel 24 menunjukkan bahwa fraksi kloroform dan air mengandung steroid. Fraksi kloroform lebih mudah diuapkan daripada fraksi air karena titik didih kloroform lebih rendah daripada air (100°C). Senyawa-senyawa bahan alam dapat mengalami degradasi karena pemanasan. Fraksi kloroform mengandung steroid non-glikosida (non

dalam fraksi kloroform dapat dilakukan dengan fase normal (fase diam silika gel untuk senyawa-senyawa non polar) sedangkan pemisahan steroid dalam fraksi air dilakukan dengan fase terbalik (fase diam C-18 atau shepadex untuk senyawa-senyawa polar). Harga silika gel lebih murah daripada C-18 atau shepadex. Alasan inilah maka dipilih fraksi kloroform untuk dilakukan pemisahan lebih lanjut,

4.5 Tahap Pemisahan dan Pemurnian

Sebanyak 2,0 g fraksi kloroform dilakukan proses pemisahan dengan menggunakan kromatografi kolom dengan silika gel 60 (70 – 230 mesh; 66,67 g) panjang 40 cm, diameter 2,5 cm menggunakan fase gerak n-heksana–etil asetat (82:18). Fraksi-fraksi ditampung setiap 5 ml dan diperoleh sebanyak 170 fraksi. Tiap-tiap fraksi dianalisis secara kromatografi lapis tipis dengan fase gerak kloroform-etil asetat (9:1). Fraksi-fraksi dengan pola Rf yang sama digabungkan menjadi satu kemudian pelarut diuapkan. Dari 170 fraksi diperoleh 6 fraksi gabungan. Kromatogram lapis tipis fraksi-fraksi yang dikelompokkan dapat dilihat pada Gambar 55.

Gambar 55. Kromatografi lapis tipis (silika gel GF254 tebal 0,2 mm, ukuran plat 10 x 9 cm), jarak elusi 8 cm, fase gerak kloroform-etil asetat (9:1), penampak noda asam sulfat

Fraksi-fraksi yang menampakkan pola noda yang sama pada kromatogram lapis tipis digabungkan dan diuapkan pelarutnya sehingga diperoleh fraksi A (8-15) seberat 278,1 mg, fraksi B (19-26) seberat 99,7 mg, fraksi C (36-40) seberat 81,9 mg, fraksi D (52-59) seberat 51,9 mg, fraksi E (79-104) seberat 24,5 mg, dan fraksi F (128-170) seberat 50,0 mg. Keenam fraksi dilakukan uji steroid. Hasil uji steroid dengan menggunakan pereaksi Liebermann-Burchard dan perolehan berat ekstraksi dari setiap fraksi ditunjukkan pada Tabel 25.

Tabel 25. Hasil uji steroid dan perolehan berat ekstrak dari fraksi A, B, C, D, E, dan F

Fraksi Uji Steroid

(Pereaksi Liebermann-Burchard) Berat (mg)

Rendemen (%) dari 2 g A (8-15) B (19-26) C (36-40) D (52-59) E (79-.104) F (128-170) - - - Warna hijau - - 278,1 99,7 81,9 51,9 24,5 50,0 13,905 4,985 4,095 2,595 1,225 2,500

Pada Tabel 25 terlihat bahwa fraksi D positif terhadap pereaksi steroid sehingga fraksi D dilakukan pemisahan lebih lanjut. Fraksi D sebanyak 50 mg dipisahkan kembali dengan menggunakan kromatografi kolom dengan silika gel 60 (>200 mesh; 9,11 g) panjang 30 cm, diameter 1 cm menggunakan fase gerak petroleum eter–eter (40:60). Selanjutnya masing-masing fraksi ditampung sebanyak 1 ml dan diperoleh 43 fraksi. Setelah dilakukan kromatografi lapis tipis dengan fase gerak petroleum eter–eter (1:1), eluat ini menghasilkan empat fraksi yang menunjukkan pemisahan yang berbeda. Noda dengan Rf yang sama dari fraksi D setelah digabungkan ditunjukkan pada Gambar 56.

Rf= 0 .9 4

Rf= 0 .7 9

Rf= 0.3 6

Rf= 0.15 Rf= 0.21

D₂

D₁ D₃ D₄

Gambar 56. Kromatografi lapis tipis (silika gel GF254 tebal 0,2 mm, ukuran plat 10 x 6 cm), jarak elusi 8 cm, fase gerak petroleum eter-eter (1:1), penampak noda asam sulfat 10% dalam etanol) dari 4 fraksi gabungan hasil kromatografi kolom

Fraksi-fraksi yang menunjukkan noda dengan Rf yang sama pada kromatografi lapis tipis digabungkan dan diuapkan pelarutnya sehingga diperoleh fraksi D1 (12-15) seberat 13,2 mg, fraksi D2 (22-24) seberat 9,4 mg, fraksi D3 (33-34) seberat 11,4 mg, dan fraksi D4 (39-43) seberat 14,3 mg. Terhadap keempat fraksi dilakukan uji steroid. Hasil uji steroid dan perolehan berat ekstrak setiap fraksi dipaparkan pada Tabel 26.

Tabel 26. Hasil uji steroid dan perolehan berat ekstrak dari fraksi D1, D2, D3, dan D4

Fraksi Uji Steroid

(Pereaksi Liebermann-Burchard) Berat (mg) Rendemen (%) _{dari 50 mg} D1 (12-15)

D2 (22-24) D3 (33-34) D4 (39-43)

Warna hijau Warna hijau Warna hijau Warna hijau

13,2 9,4 11,4 14,3

26,4 18,8 22,8 28,6

Pada Tabel 26 terlihat bahwa fraksi D1-D4 positif terhadap pereaksi Liebermann-Burchard, fraksi D1 (12-15) berupa wax, fraksi D2 (22-24) dan fraksi D3 (33-34) berupa fase padatan. Fraksi D2 dan D3 menunjukkan satu noda dan berbentuk kristal berwarna putih. Kemudian terhadap fraksi-fraksi tersebut dilakukan uji kemurnian dengan menggunakan kromatografi lapis tipis.

4.6 Uji Kemurnian

Kromatogram dari kromatografi lapis tipis yang dipaparkan pada Gambar 56 menunjukkan bahwa fraksi D3 memperlihatkan noda tunggal. Fraksi D3 yang memberikan noda tunggal tersebut kemudian dilakukan analisis kemurnian dengan kromatografi lapis tipis dengan menggunakan berbagai fase gerak yaitu:

n-heksana-etil asetat (70:30, I) kloroform (IV)

n-heksana-kloroform (50:50, II) kloroform-metanol (90:10, V) petroleum eter-eter (40:60, III)

Rf= 0.79

V

Rf= 0.69

IV

Rf= 0.47

III

Rf= 0.09

II

Rf= 0.07

I

Gambar 57 Kromatografi lapis tipis fraksi D3 hasil kromatografi kolom (silika gel GF254 pada berbagai fase gerak, tebal 0,2 mm, ukuran plat 10 x 2 cm), jarak elusi 8 cm, penampak noda asam sulfat 10% dalam etanol).

Ternyata dengan berbagai campuran dua fase gerak pada kromatografi lapis tipis semua kromatogram menunjukkan adanya noda tunggal. Dengan demikian dapat

dengan menggunakan fase gerak yang berbeda dapat dilihat pada Gambar 57 dan Tabel 27 menunjukkan harga Rf masing-masing kromatogram.

Tabel 27. Nilai Rf noda kromatogram lapis tipis dari fraksi D3 pada berbagai fase gerak

Kromatogram Fase gerak Nilai Rf noda

I II III IV V

n-heksana-etil asetat (70:30) n-heksana-kloroform (50:50) petroleum eter-eter (40:60) kloroform (100)

kloroform-metanol (90:10)

0,07 0,09 0,47 0,69 0,79

Analisis selanjutnya dilakukan pengukuran titik leleh dengan alat “Fisher John Melting Point”. Pengamatan menunjukkan bahwa fraksi D3 meleleh pada suhu 135-137°C. Selain dilakukan uji kimia isolat dianalisis dengan menggunakan spektroskopi inframerah, NMR-1H dan NMR-13C, Distortionless Enhancement by Polarization Transfer (DEPT), 1H-1H Homonuclear Correlated Spectroscopy (COSY), 1H-13C Heteronuclear Multiple Quantum Coherence (HMQC), 1H-13C Heteronuclear Multiple Bond Connectivity (HMBC), dan Mass Spektroscopy (MS).

4.7 Penentuan Struktur Molekul

Isolat murni yang mempunyai titik leleh 135-137°C memberikan warna hijau dengan pereaksi Liebermann-Burchard, menunjukkan bahwa senyawa ini termasuk golongan steroid. Penentuan senyawa ini dilakukan dengan menggunakan spektroskopi inframerah, NMR-1H, NMR-13C, DEPT, HMQC, COSY, HMBC, dan MS.

4.7.1 Spektroskopi Inframerah (FTIR)

Spektrum inframerah senyawa isolat murni ditunjukkan dalam Gambar 58 dan data bilangan gelombang, bentuk pita, intensitas dan gugus terkait dipaparkan pada Tabel 28.

Gambar 58. Spektrum inframerah dari fraksi D3 menggunakan pellet KBr

Tabel 28. Interpretasi spektrum inframerah (bilangan gelombang, bentuk pita, intensitas, dan penempatan gugus terkait) dari isolat.

Bilangan gelombang (ν, cm-1)

Bentuk

Pita Intensitas

Penempatan Gugus Terkait

3417,36 Melebar Sedang ν O-H (ikatan hidrogen antarmolekul)

2936,87 Tajam Kuat ν C-H (pada CH3)

2868,34 Tajam Sedang ν C-H (pada CH2)

1661,53 Tajam Sedang ν C=C non konjugasi

1464,54 Tajam Sedang γ C-H pada (CH2) 1376,22 Tajam Sedang γ C-H pada (CH3)

1328,67 Tajam Sedang γ O-H

1051,74 Tajam Sedang ν C-OH (alkohol siklik sekunder)

956,64 Tajam Sedang γ =C-H out-of-plane

Spektrum inframerah memperlihatkan bahwa senyawa yang diperoleh menunjukkan serapan melebar pada daerah bilangan gelombang ν 3417,36 cm-1 yang diduga adalah serapan uluran (stretching) dari gugus O-H (3200–3550 cm-1). Dugaan ini diperkuat oleh adanya serapan pada daerah bilangan gelombang ν 1328,67 cm-1 yang

menunjukkan adanya serapan tekukan (bending) dari gugus O-H (1330-1420 cm-1) dan bilangan gelombang ν 1051,74 cm-1 yang menunjukkan adanya uluran C-OH siklik (990–1060 cm-1). Pita serapan pada daerah bilangan gelombang ini memberikan gambaran bahwa senyawa isolat merupakan senyawa siklik yang mengandung gugus OH.

Kedudukan OH dalam molekul berada pada posisi 3β (ekuatorial) dapat diperlihatkan pada Tabel 29 & Gambar 59.

Tabel 29. Korelasi frekuensi C-O dengan stereokimia

Uluran C-O, cm-1

Struktur Konformasi Steroid

Alkohol

Steroid metoksi

Steroid asetat

A/B trans, 3β Ekuatorial 1037-1040 1100-1102 1025-1031

A/B trans, 3α Aksial 996-1002 1086 1013-1022

A/B cis, 3α Ekuatorial 1037-1044 1100 1026-1029

A/B cis, 3β Aksial 1032-1036 1088-1090 1018-1022

Δ5

C=C, 3β Ekuatorial* 1050-1052 1104 1030

Δ5

C=C, 3α Aksial 1034

A/B trans, 2α Ekuatorial 1030-1035

A/B trans, 2β Aksial 1010

A/B trans, 4α Ekuatorial 1040

A/B trans, 4β Aksial 1000

Triterpenoid alkohol Triterpenoid asetat 1013-1031

3β Ekuatorial

1040-1045 1023-1026

3α Aksial 1063-1068 1033-1040

Sumber : Cole, 1963

Adanya pita tajam dengan intensitas kuat pada bilangan gelombang ν 2936,87 cm-1 adalah merupakan uluran C-H dari CH3 dan pita serapan pada bilangan gelombang

ν 2868,34 cm-1 merupakan uluran C-H pada CH2 (alkana, 2850–3000 cm-1). Hal ini diperkuat dengan adanya serapan pada daerah bilangan gelombang γ 1376,22 cm-1 yang menunjukkan adanya tekukan C-H dari CH3 (rocking, 1350-1370 cm-1) dan pita serapan pada bilangan gelombang γ 1464, 54 cm-1 yang menunjukkan adanya tekukan C-H dari CH2 (scissoring, 1450-1470 cm-1).

Pita serapan pada bilangan gelombang ν 1661,53 cm-1 yang tajam menunjukkan adanya uluran C=C non konjugasi (1620–1680 cm-1). Dugaan ini diperkuat dengan adanya serapan pada bilangan gelombang γ 956,64 cm-1 yang menunjukkan adanya tekukan =C-H (650–1000 cm-1).

Dari interpretasi data di atas dapat disimpulkan bahwa fraksi D3 mengandung inti siklik, hidroksi (3β, ekuatorial), alkil (CH3 dan CH2), dan ena non konjugasi (Δ5).

C3 C5

HO

H

νC-O1051-1052

Gambar 59. Posisi gugus OH dalam konformasi ekuatorial

4.7.2 Spektroskopi NMR karbon

Spektrum NMR karbon (100 MHz, CDCl3) dari fraksi D3 ditunjukkan dalam Gambar 60 dan data pergeseran kimianya dipaparkan pada Tabel 30.

Tabel 30. Data pergeseran kimia fraksi D3

No. peak Pergeseran kimia (ppm) No. peak Pergeseran kimia (ppm)

1 11,849 16 33,931

2 11,973 17 36,136 3 18,768 18 36,490 4 19,015 19 37,238 5 19,385 20 39,764 6 19,805 21 42,290 7 21,072 22 42,306 8 23,055 23 46,069 9 24,289 24 50,114 10 26,359 25 56,037 11 28,238 26 56,753

12 29,135 27 71,800 (C-OH)

13 30,920 28 121,706 (=CH2)

14 31,652 29 140,752 (=C-R)

15 31,891 CDCl3 77,000 (t)

Spektrum NMR-13C menunjukkan bahwa terdapat 29 atom karbon (Lampiran 13) penyusun fraksi D3. Spektrum NMR-13C menyatakan adanya group hidroksil (δC = 71,800) dan dua group ena (δC 121,706 dan δC 140,752). Perbandingan data NMR-13C hasil penelitian dengan data literatur ditunjukkan dalam Tabel 31.

Tabel 31. Perbandingan data NMR-13C hasil penelitian dan data literatur (Li-Lin Tay, 1997)

Peak Hasil Literatur* Dugaan Peak Hasil Literatur* Dugaan

1 11,849 11,87 C-18 16 33,931 33,92 C-22

2 11,973 12,32 C-29 17 36,136 36,28 C-20

3 18,768 18,84 C-21 18 36,490 36,52 C-10

4 19,015 18,98 C-26 19 37,238 37,27 C-1

5 19,385 19,41 C-19 20 39,764 39,78 C-12

6 19,805 19,61 C-27 21 42,290 42,31 C-4

7 21,072 21,10 C-11 22 42,306 42,33 C-13

8 23,055 23,02 C-28 23 46,069 46,07 C-24

9 24,289 24,32 C-15 24 50,114 50,14 C-9

10 26,359 26,38 C-23 25 56,037 56,08 C-17

11 28,238 28,25 C-16 26 56,753 56,77 C-14

12 29,135 28,95 C-25 27 71,800 (C-OH) 71,84 C-3

13 30,920 31,68 C-2 28 121,706 (=CH2) 121,72 C-6

14 31,652 31,92 C-7 29 140,752 (=C-R) 140,76 C-5

4.7.3 Spektroskopi DEPT (Distortionless Enhancement by Polarization Transfer) Spektrum NMR karbon DEPT dari fraksi D3 ditunjukkan dalam Gambar 61 dan data menunjukkan banyaknya CH2 dan CH/CH3 dipaparkan pada Tabel 32.

Gambar 61. Spektrum DEPT dari fraksi D3

Tabel 32. Data karbon CH2 dan CH/CH3 dari fraksi D3.

Karbon CH/CH3 (peak ke atas) Karbon CH2 (peak ke bawah) No. peak Pergeseran kimia (ppm) No. peak Pergeseran kimia (ppm)

1 11,817 CH3 1 21,023 CH2

2 11,940 CH3 2 22,989 CH2

3 18,736 CH3 3 24,239 CH2

4 18,982 CH3 4 26,252 CH2

5 19,368 CH3 5 28,172 CH2

6 19,797 CH3 6 31,562 CH2

7 29,061 CH 7 31,841 CH2

8 31,866 CH 8 33,898 CH2

9 36,103 CH 9 37,205 CH2

10 46,253 CH 10 39,706 CH2

11 50,056 CH 11 42,208 CH2

12 55,980 CH 13 56,704 CH

14 71,759 CH (C-OH) 15 121,690 CH (C=C)

Jumlah karbon dapat dihitung sbb: CH/CH3 (DEPT) berjumlah 15 buah CH2 (DEPT) berjumlah 11 buah C berjumlah 29 (NMR-13C) - 26 = 3 buah

Spektrum DEPT menunjukkan adanya enam karbon metil, sebelas karbon metilena, sembilan karbon metin dan tiga karbon kuartener (Tabel 32). Tabel 33 menunjukkan hubungan spektrum NMR-13C, DEPT dan perkiraan nomor karbon.

Tabel 33. Data hubungan spektrum NMR-13C dan DEPT.

Peak 13C DEPT Gugus Posisi Peak 13C DEPT Gugus Posisi

1 11,849 11,817 CH3 C-18 16 33,931 33,898 CH2 C-22

2 11,973 11,940 CH3 C-29 17 36,136 36,103 CH C-20

3 18,768 18,736 CH3 C-21 18 36,490 - C C-10

4 19,015 18,982 CH3 C-26 19 37,238 37,205 CH2 C-1

5 19,385 19,368 CH3 C-19 20 39,764 39,706 CH2 C-12

6 19,805 19,797 CH3 C-27 21 42,290 42,208 CH2 C-4

7 21,072 21,023 CH2 C-11 22 42,306 - C C-13

8 23,055 22,989 CH2 C-28 23 46,069 46,253 CH C-24

9 24,289 24,239 CH2 C-15 24 50,114 50,056 CH C-9

10 26,359 26,252 CH2 C-23 25 56,037 55,980 CH C-17

11 28,238 28,172 CH2 C-16 26 56,753 56,704 CH C-14

12 29,135 29,061 CH C-25 27 71,800 71,759 CH-OH C-3

13 30,920 31,562 CH2 C-2 28 121,706 121,690 -C=CH C-6

14 31,652 31,841 CH2 C-7 29 140,752 - -C=CR C-5

15 31,891 31,866 CH C-8

4.7.4. Spektroskopi Massa

Spektrum massa dari fraksi D3 ditunjukkan dalam Gambar 62. Senyawa dengan massa 414 dan mempunyai inti siklik, hidroksil, alkana dan alkena melalui penelusuran pustaka ada 8 senyawa. Senyawa tersebut ditunjukkan pada Gambar 63.

Lampiran 8. Konformasi Chair-Chair-Chair-Chair-Chair : Hopana dan tipe yang berhubungan

Lampiran 9. Konformasi Chair-Boat-Chair-Chair-Boat : Arborana dan tipe yang berhubungan

Lampiran 10. Kerangka dan Penomoran Steroid 10 5 1 4 2 3 8 7 9 6 13 14 12 11 16 15 17 H H H H H Gonane 10 5 1 4 2 3 8 7 9 6 13 14 12 11 16 15 17 H H CH₃ 18 H H Estrane 10 5 1 4 2 3 8 7 9 6 13 14 12 11 16 15 17 CH₃ 19 H CH₃ 18 H H Andostrane 10 5 1 4 2 3 8 7 9 6 13 14 12 11 16 15 17 CH₃ 19 H CH₃ 18 H H

20 CH21 3

Pregnane 10 5 1 4 2 3 8 7 9 6 13 14 12 11 16 15 17 CH₃ 19 H CH₃ 18 H H 20 22 C H₃

21 23 CH24 3

Cholane 10 5 1 4 2 3 8 7 9 6 13 14 12 11 16 15 17 CH₃ 19 H CH₃ 18 H H 20 22 C H₃ 21 23 24

25 CH26 3

CH₃ 27 Cholestane 10 5 1 4 2 3 8 7 9 6 13 14 12 11 16 15 17 CH₃ 19 H CH₃ 18 H H 20 22 C H₃ 21 23 24

25 CH26 3

CH₃ 27 CH₃ 28 Campestane 10 5 1 4 2 3 8 7 9 6 13 14 12 11 16 15 17 CH₃ 19 H CH₃ 18 H H 20 22 C H₃ 21 23 24

25 CH26 3

CH₃ 27 CH₃ 28 Ergostane 10 5 1 4 2 3 8 7 9 6 13 14 12 11 16 15 17 CH₃ 19 H CH₃ 18 H H 20 22 C H₃ 21 23 24

25 CH26 3

CH₃ 27 28 CH₃ 29 Stigmastane 10 5 1 4 2 3 8 7 9 6 13 14 12 11 16 15 17 CH₃ 19 H CH₃ 18 H H 20 22 C H₃ 21 23 24

25 CH26 3

CH₃ 27 28 CH₃ 29 Poriferastane

Lampiran 11. Hidrokarbon induk, cincin dan rantai sisi untuk sterol (didasarkan pada Rekomendasi IUPAC-IUB tahun 1989)

Lanostana

H H

H

(5α, 8β, 9α, 10β, 13β, 14α, 17β, 20R)

Sikloartana

H H

Lampiran 12. Posisi Karakteristik Pita Inframerah

Group Frequency range (cm-1)

OH stretching vibrations Free OH

Intramolecular hydrogen bonds Intermolecular hydrogen bonds Chelate compounds

3610-3645 (sharp) 3450-3600 (sharp) 3200-3550 (broad) 2500-3200 (very broad) NH stretching vibrations

Free NH

Hydrogen-bonded NH

3300-3500 3070-3350 CH stretching vibrations

≡C-H =C-H C-CH3

O-CH3

N-CH3 (aromatic)

N-CH3 (aliphatic)

CH2

CH

3280-3340 3000-3100

2872 ± 10, 2962 ± 10 2815-2832

2810-2820 2780-2805

2853 ± 10, 2926 ± 10 2880-2900

C≡N stretching vibrations Nonconjugated

Conjugated

2240-2260 2215-2240 C≡C stretching vibrations

C≡CH (terminal) C-C≡C-C

C-C≡C-C≡CH

2100-2140 2190-2260 2040, 2200 C=C stretching vibrations

Nonconjugated Conjugated

1620-1680 1585-1625 CH bending vibrations

CH2

CH3

1405-1465 1355-1395 C-OH stretching vibrations

Secondary cyclic alcohols 990-1060

CH out-of-plane bending vibrations in substituted ethylenc systems

-CH=CH2

-CH=CH- (cis) -CH=CH- (trans)

905-915, 985-995 650-750

960-970

Lampiran 13. Kerangka Fraksi D3 beserta Chemical Shift NMR-13C

HO

37,238 19,385

71,800 30,920

42,290

11,849

31,891

121,706 140,752

42,306 18,768

31,652

24,289 21,072

50,114 56,753

39,764

36,490

56,037 36,136

23,055

28,238 33,931

26,359

19,015 11,973

46,069

19,805 29,135