BAB III BAHAN DAN METODE
3.1. Tempat dan Waktu
Tempat penelitian analisis DNA dilakukan di Common Laboratory SEAMEO BIOTROP dan laboratorium Silvikultur Fakultas Kehutanan Institut
Pertanian Bogor. Penelitian ini dilaksanakan pada bukan Februari 2011 sampai dengan Januari 2012.
3.2. Bahan dan Alat Penelitian 3.2.1. Bahan Penelitian
Bahan tanaman yang digunakan berupa daun sengon yang berasal dari tegakan yang diambil secara acak di beberapa hutan rakyat di Jawa. Adapun
daerah-daerah pengambilan sampel dapat dilihat pada Tabel 1. Tabel 1 Lokasi tempat pengambilan sampel daun sengon pada hutan rakyat di
Jawa
Provinsi Kota Kabupaten
Jumlah Sampel
Jawa Barat Cianjur
25 Sukabumi
25 Garut
25 Subang
25 Kuningan
25 Tasikmalaya
25 Jawa Tengah
Wonosobo 25
Jawa Timur Kediri
25 Lumajang
25 Total
225
Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini secara lengkap dapat dilihat pada Lampiran 1. Adapun secara garis besar bahan-bahan yang digunakan
adalah: Nitrogen cair, buffer ekstrak CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium
Bromide, β─Mercaptoethanol, GenElute Plant Genomic DNA Miniprep Kit dari
SIGMA, Chloroform: Isoamylalcohol, phenol, aquabidest, isopropanol dingin, etanol 70 dan buffer TE. Pada proses PCR bahan-bahan yang digunakan adalah:
DNA template, Nuclease free water, primer random dan pereaksi PCR dNTP, Taq polymerase, Buffer PCR, dan MgCl
2
. Adapun bahan-bahan yang digunakan
11
dalam visualisasi DNA yaitu, agarose, aqudest, buffer TAE, loading dye, DNA marker, Etbr atau SYBR safe gel stain DNA. Alat-alat yang digunakan dalam
penelitian ini dapat dilihat secara lengkap pada Lampiran 2.
3.3. Prosedur Penelitian
Metode analisis DNA dengan RAPD dibagi menjadi tiga tahap yaitu ekstraksi DNA, proses PCR yang menghasilkan RAPD, skoring dan analisis data.
Secara umum prosedur penelitian dengan metode RAPD dapat dilihat pada Gambar 1.
3.3.1. Ekstraksi DNA
Ekstraksi DNA merupakan metode pemisahan DNA dari bahan-bahan yang tidak diperlukan. Dalam penelitian ini, ekstraksi DNA Sengon dilakukan dengan
dua metode, yaitu metode CTAB dan GenElute Plant Genomic DNA Miniprep Kit Gambar 1 Bagan tahapan penelitian
Ekstraksi DNA
Interpretasi dan Analisis Data Foto
PCR primer terbaik Elektroforesis Agar 1,5, V : 100 volt
PCR seleksi primer random Elektroforesis agar 1, V : 100 Volt
PCR seleksi primer Sample daun
Tidak
Tidak
deskriptif POPGEN
NTSYS
12
dari SIGMA. Metode CTAB menggunakan larutan buffer CTAB Tris-HCL 1M, NaCl 5M, EDTA 0,5 M dan CTAB 10, dipilih karena lebih murah dan mudah
dilakukan Rogers and Bendich 1994, diacu dalam Aritonang et al. 2007. Adapun langkah awal yang dilakukan dari 2 metode ini hampir sama yaitu, sampel daun
Sengon 0,25 ─0,5 g digerus dengan bantuan nitrogen cair. Hasil gerusan
dimasukkan ke dalam tube 2 ml yang telah diisi 1 ml buffer ekstrak CTAB dan 1
β-mercaptoethanol. Campuran divortex ± 2 menit, kemudian diinkubasi 65 C
selama 30 menit setiap 10 menit campuran dihomogenkan dengan membolak- balikan tabung. Larutan ekstrak DNA dipurifikasi dengan menambahkan 750 µ l
Chloroform, lalu campuran divortex dan disentrifugasi pada kecepatan 11.000 rpm selama 10 menit. Proses sentrifugasi dilakukan untuk memisahkan bahan-
bahan kimia atau fase organik dari fase air berupa supernatan. Dari kedua fase tersebut yang digunakan untuk tahap selanjutnya adalah fase air yang berisi
benang-benang nukleat. Supernatan dipipet kedalam tube 2 ml yang baru, proses purifikasi dilakukan sebanyak dua kali, hal ini bertujuan untuk memperoleh DNA
yang memiliki tingkat kemurnian tinggi. DNA diendapkan dengan penambahan 1 ml isopropanol dingin. Kemudian dihomogenkan perlahan sampai terbentuk
benang-benang putih. Campuran diinkubasi pada suhu -20
o
C selama minimal 30 menit, kemudian pelet di sentrifugasi pada kecepatan 11.000 rpm selama 10
menit. Setelah itu pelet DNA dilarutkan dengan buffer TE. Selain itu dalam penelitian ini dilakukan juga modifikasi metode ekstraksi
DNA menggunakan buffer CTAB dan menggunakan GenElute Plant Genomic DNA Miniprep Kit dari SIGMA. Dimana setelah mendapatkan supernatan dari
ektraksi DNA dengan penggunaan buffer CTAB dilakukan load lysate dengan menambahkan column preparation 700 µ l kedalam binding column. Setelah itu
dilakukan first column wash dengan menambahkan wash solution sebanyak 500 µ l. Adapun tahap terakhir yaitu tahapan elute DNA dengan menambahkan elution
solution sebanyak 200 µ l. Karakteristik pita DNA dapat diamati dengan melakukan elektroforesis menggunakan gel agarose dengan konsentrasi sebesar
1. Gel yang telah dieletroforesis direndam di dalam Etbr 1x selama 30 menit. Gel divisualisasikan di dalam KODAK Gel Logic 200.
13
3.3.2. PCR Polymerase Chain Reaction
Proses amplifikasi DNA pada PCR membutuhkan bahan campuran yang terdiri dari buffer PCR, MgCl
2
, dNTP yang digunakan sebagai sumber nukleotida pada proses PCR gabungan dATP, dGTP, dCTP dan dTTP, Taq DNA
polymerase, DNA hasil isolasi dan Nuclease Free Water Tabel 2. Sebelum dilakukan proses amplifikasi PCR harus dilakukan pengenceran DNA tamplate
dengan Nuclease Free Water. Hal ini tergantung dari tebal dan tipisnya DNA genomik hasil ekstraksi.
Mengacu pada Promega 2003, jumlah DNA yang diperlukan dalam proses PCR sangat sedikit yaitu sekitar 1
μl atau 10 ngμl. Untuk mengetahui konsentrasi DNA hasil ekstraksi dapat ditetapkan dengan melakukan elektroforesis
menggunakan gel agarose. Hasil amplifikasi DNA dengan PCR ditentukan oleh primer oligonukleotida yang digunakan.
Tabel 2 Komponen bahan untuk reaksi PCR.
No Nama Bahan
1 Sampel Reaksi 1
2 3
4 5
6 7
DNA target Primer
PCR buffer MgCl
2
dNTP Taq DNA polymerase
Nuclease free water 2 µl
1,5 µl 5 µl
2,5 µl 0,5 µl
0,2 µl 13,3 µl
Total Volume 25 µl
Proses PCR dilakukan dengan menggunakan primer hasil seleksi. Adapun tahapan PCR yang dilakukan dapat dilihat pada Tabel 3.
Tabel 3 Tahapan proses PCR Tahapan
Suhu Waktu
Jumlah Siklus
o
C menit
Pre-denaturation Denaturation
Annealing Extension
Final Extension 95
95 37
72 72
2 1
2 2
5 1
35 35
35
1
14
3.3.3. Seleksi Primer
Primer adalah rantai pendek DNA yang dihasilkan secara buatan yang biasanya terdiri antara 10
–25 nukleotida Finkeldey 2005. Dalam teknik RAPD, umumnya primer yang digunakan berupa oligonukleotida yang memiliki panjang
sebesar 10-mer yang dipilih secara acak dan minimum memiliki basa G dan C. Primer yang mempunyai panjang kurang dari 10-mer dapat digunakan tetapi akan
menghasilkan produk amplifikasi yang lebih sedikit dan diperlukan metode pewarnaan yang lebih sensitif untuk mendeteksinya.
Seleksi primer dimaksudkan untuk mencari primer acak yang menghasilkan penanda polimorfik, karena tidak semua primer nukleotida dapat menghasilkan
produk amplifikasi primer positif dan dari primer positif tidak semuanya menghasilkan fragmen DNA polimorfik. Pada kegiatan ini dilakukan seleksi
terhadap primer, yaitu golongan OPO, OPY, OPA, OPB, OPC dan OPD yang diproduksi oleh Operon Technology. Urutan basa primer yang dicobakan dapat
dilihat pada Tabel 4. Tabel 4 Urutan basa nukleotida 41 primer Operon Technology yang dicobakan.
No Primer
Urutan Nukleotida No
Primer Urutan Nukleotida
1 OPA-1
CAGGCCCTTC 21
OPC-2 GTGAGGCGTC
2 OPA-2
TGCCGAGCTG 22
OPC-3 GGGGGTCTTT
3 OPA-3
AGTCAGCCAC 23
OPC-4 CCGCATCTAC
4 OPA-4
AATCGGGCTG 24
OPC-5 GATGACCGCC
5 OPA-6
GGTCCCTGAC 25
OPC-6 GAACGGACTC
6 OPA-7
GAAACGGGTG 26
OPC-7 GTCCCGACGA
7 OPA-8
GTGACGTAGG 27
OPC-8 TGGACCGGTG
8 OPA-9
GGGTAACGCC 28
OPD-1 ACCGCGAAGG
9 OPA-10
GTGATCGCAG 29
OPD-2 GGACCCAACC
10 OPB-1
GTTTCGCTCC 30
OPD-3 GTCGCCGTCA
11 OPB-2
TGATCCCTGG 31
0PD-4 TCTGGTGAGG
12 OPB-3
CATCCCCCTG 32
OPD-5 TGAGCGGACA
13 OPB-4
GGACTGGAGT 33
OPD-6 ACCTGAACGG
14 OPB-5
TGCGCCCTTC 34
OPD-7 TTGGCACGGG
15 OPB-6
TGCTCTGCCC 35
OPD-8 GTGTGCCCCA
16 OPB-7
GGTGACGCAG 36
OPD-9 CTCTGGAGAC
17 OPB-8
GTCCACACGG 37
OPD-10 GGTCTACACC
18 OPB-9
TGGGGGACTC 38
OPU-5 TTGGCGGCCT
19 OPB-10
CTGCTGGGAC 39
OPY-5 GGCTGCGACA
20 OPC-1
TTCGAGCCAG 40
OPY-3 ACAGCCTGCT
Dari hasil seleksi primer yang dilakukan hanya diambil 5 primer yaitu OPA- 2, OPA-3, OPB-10, OPY-5 dan OPU-5. Urutan nukleotida dari masing-masing
15
primer adalah OPA-2 TGCCGAGCTG, OPA-3 AGTCAGCCAC, OPB-10 CTGCTGGGAC, OPY-5 GGCTGCGACA dan OPU-5 TTGGCGGCCT.
Hasil dari proses PCR tersebut dianalisis dengan melakukan proses elektroforesis menggunakan 1,5 gel agarose dalam larutan buffer TAE 1x dan distaining
dengan menggunakan SYBR safe gel stain DNA.
3.4. Skoring Fragmen RAPD
Hasil PCR yang telah dielektroforesis dilakukan pengambilan foto dan dianalisis dengan melakukan skoring. Profil pita DNA hasil analisis RAPD
diskoring dengan ada atau tidaknya hasil amplifikasi. Jika terdapat pita maka genotipe tersebut dinilai 1 dan jika tidak terdapat pita pada genotipe yang lain
dinilai 0. Contoh proses skoring dapat dilihat pada Gambar 2.
Gambar 2 Cara analisis DNA dengan skoring
3.5. Data Analisis
Kategori