13
3.3.2. PCR Polymerase Chain Reaction
Proses amplifikasi DNA pada PCR membutuhkan bahan campuran yang terdiri dari buffer PCR, MgCl
2
, dNTP yang digunakan sebagai sumber nukleotida pada proses PCR gabungan dATP, dGTP, dCTP dan dTTP, Taq DNA
polymerase, DNA hasil isolasi dan Nuclease Free Water Tabel 2. Sebelum dilakukan proses amplifikasi PCR harus dilakukan pengenceran DNA tamplate
dengan Nuclease Free Water. Hal ini tergantung dari tebal dan tipisnya DNA genomik hasil ekstraksi.
Mengacu pada Promega 2003, jumlah DNA yang diperlukan dalam proses PCR sangat sedikit yaitu sekitar 1
μl atau 10 ngμl. Untuk mengetahui konsentrasi DNA hasil ekstraksi dapat ditetapkan dengan melakukan elektroforesis
menggunakan gel agarose. Hasil amplifikasi DNA dengan PCR ditentukan oleh primer oligonukleotida yang digunakan.
Tabel 2 Komponen bahan untuk reaksi PCR.
No Nama Bahan
1 Sampel Reaksi 1
2 3
4 5
6 7
DNA target Primer
PCR buffer MgCl
2
dNTP Taq DNA polymerase
Nuclease free water 2 µl
1,5 µl 5 µl
2,5 µl 0,5 µl
0,2 µl 13,3 µl
Total Volume 25 µl
Proses PCR dilakukan dengan menggunakan primer hasil seleksi. Adapun tahapan PCR yang dilakukan dapat dilihat pada Tabel 3.
Tabel 3 Tahapan proses PCR Tahapan
Suhu Waktu
Jumlah Siklus
o
C menit
Pre-denaturation Denaturation
Annealing Extension
Final Extension 95
95 37
72 72
2 1
2 2
5 1
35 35
35
1
14
3.3.3. Seleksi Primer
Primer adalah rantai pendek DNA yang dihasilkan secara buatan yang biasanya terdiri antara 10
–25 nukleotida Finkeldey 2005. Dalam teknik RAPD, umumnya primer yang digunakan berupa oligonukleotida yang memiliki panjang
sebesar 10-mer yang dipilih secara acak dan minimum memiliki basa G dan C. Primer yang mempunyai panjang kurang dari 10-mer dapat digunakan tetapi akan
menghasilkan produk amplifikasi yang lebih sedikit dan diperlukan metode pewarnaan yang lebih sensitif untuk mendeteksinya.
Seleksi primer dimaksudkan untuk mencari primer acak yang menghasilkan penanda polimorfik, karena tidak semua primer nukleotida dapat menghasilkan
produk amplifikasi primer positif dan dari primer positif tidak semuanya menghasilkan fragmen DNA polimorfik. Pada kegiatan ini dilakukan seleksi
terhadap primer, yaitu golongan OPO, OPY, OPA, OPB, OPC dan OPD yang diproduksi oleh Operon Technology. Urutan basa primer yang dicobakan dapat
dilihat pada Tabel 4. Tabel 4 Urutan basa nukleotida 41 primer Operon Technology yang dicobakan.
No Primer
Urutan Nukleotida No
Primer Urutan Nukleotida
1 OPA-1
CAGGCCCTTC 21
OPC-2 GTGAGGCGTC
2 OPA-2
TGCCGAGCTG 22
OPC-3 GGGGGTCTTT
3 OPA-3
AGTCAGCCAC 23
OPC-4 CCGCATCTAC
4 OPA-4
AATCGGGCTG 24
OPC-5 GATGACCGCC
5 OPA-6
GGTCCCTGAC 25
OPC-6 GAACGGACTC
6 OPA-7
GAAACGGGTG 26
OPC-7 GTCCCGACGA
7 OPA-8
GTGACGTAGG 27
OPC-8 TGGACCGGTG
8 OPA-9
GGGTAACGCC 28
OPD-1 ACCGCGAAGG
9 OPA-10
GTGATCGCAG 29
OPD-2 GGACCCAACC
10 OPB-1
GTTTCGCTCC 30
OPD-3 GTCGCCGTCA
11 OPB-2
TGATCCCTGG 31
0PD-4 TCTGGTGAGG
12 OPB-3
CATCCCCCTG 32
OPD-5 TGAGCGGACA
13 OPB-4
GGACTGGAGT 33
OPD-6 ACCTGAACGG
14 OPB-5
TGCGCCCTTC 34
OPD-7 TTGGCACGGG
15 OPB-6
TGCTCTGCCC 35
OPD-8 GTGTGCCCCA
16 OPB-7
GGTGACGCAG 36
OPD-9 CTCTGGAGAC
17 OPB-8
GTCCACACGG 37
OPD-10 GGTCTACACC
18 OPB-9
TGGGGGACTC 38
OPU-5 TTGGCGGCCT
19 OPB-10
CTGCTGGGAC 39
OPY-5 GGCTGCGACA
20 OPC-1
TTCGAGCCAG 40
OPY-3 ACAGCCTGCT
Dari hasil seleksi primer yang dilakukan hanya diambil 5 primer yaitu OPA- 2, OPA-3, OPB-10, OPY-5 dan OPU-5. Urutan nukleotida dari masing-masing
15
primer adalah OPA-2 TGCCGAGCTG, OPA-3 AGTCAGCCAC, OPB-10 CTGCTGGGAC, OPY-5 GGCTGCGACA dan OPU-5 TTGGCGGCCT.
Hasil dari proses PCR tersebut dianalisis dengan melakukan proses elektroforesis menggunakan 1,5 gel agarose dalam larutan buffer TAE 1x dan distaining
dengan menggunakan SYBR safe gel stain DNA.
3.4. Skoring Fragmen RAPD
Kategori