11
dalam visualisasi DNA yaitu, agarose, aqudest, buffer TAE, loading dye, DNA marker, Etbr atau SYBR safe gel stain DNA. Alat-alat yang digunakan dalam
penelitian ini dapat dilihat secara lengkap pada Lampiran 2.
3.3. Prosedur Penelitian
Metode analisis DNA dengan RAPD dibagi menjadi tiga tahap yaitu ekstraksi DNA, proses PCR yang menghasilkan RAPD, skoring dan analisis data.
Secara umum prosedur penelitian dengan metode RAPD dapat dilihat pada Gambar 1.
3.3.1. Ekstraksi DNA
Ekstraksi DNA merupakan metode pemisahan DNA dari bahan-bahan yang tidak diperlukan. Dalam penelitian ini, ekstraksi DNA Sengon dilakukan dengan
dua metode, yaitu metode CTAB dan GenElute Plant Genomic DNA Miniprep Kit Gambar 1 Bagan tahapan penelitian
Ekstraksi DNA
Interpretasi dan Analisis Data Foto
PCR primer terbaik Elektroforesis Agar 1,5, V : 100 volt
PCR seleksi primer random Elektroforesis agar 1, V : 100 Volt
PCR seleksi primer Sample daun
Tidak
Tidak
deskriptif POPGEN
NTSYS
12
dari SIGMA. Metode CTAB menggunakan larutan buffer CTAB Tris-HCL 1M, NaCl 5M, EDTA 0,5 M dan CTAB 10, dipilih karena lebih murah dan mudah
dilakukan Rogers and Bendich 1994, diacu dalam Aritonang et al. 2007. Adapun langkah awal yang dilakukan dari 2 metode ini hampir sama yaitu, sampel daun
Sengon 0,25 ─0,5 g digerus dengan bantuan nitrogen cair. Hasil gerusan
dimasukkan ke dalam tube 2 ml yang telah diisi 1 ml buffer ekstrak CTAB dan 1
β-mercaptoethanol. Campuran divortex ± 2 menit, kemudian diinkubasi 65 C
selama 30 menit setiap 10 menit campuran dihomogenkan dengan membolak- balikan tabung. Larutan ekstrak DNA dipurifikasi dengan menambahkan 750 µ l
Chloroform, lalu campuran divortex dan disentrifugasi pada kecepatan 11.000 rpm selama 10 menit. Proses sentrifugasi dilakukan untuk memisahkan bahan-
bahan kimia atau fase organik dari fase air berupa supernatan. Dari kedua fase tersebut yang digunakan untuk tahap selanjutnya adalah fase air yang berisi
benang-benang nukleat. Supernatan dipipet kedalam tube 2 ml yang baru, proses purifikasi dilakukan sebanyak dua kali, hal ini bertujuan untuk memperoleh DNA
yang memiliki tingkat kemurnian tinggi. DNA diendapkan dengan penambahan 1 ml isopropanol dingin. Kemudian dihomogenkan perlahan sampai terbentuk
benang-benang putih. Campuran diinkubasi pada suhu -20
o
C selama minimal 30 menit, kemudian pelet di sentrifugasi pada kecepatan 11.000 rpm selama 10
menit. Setelah itu pelet DNA dilarutkan dengan buffer TE. Selain itu dalam penelitian ini dilakukan juga modifikasi metode ekstraksi
DNA menggunakan buffer CTAB dan menggunakan GenElute Plant Genomic DNA Miniprep Kit dari SIGMA. Dimana setelah mendapatkan supernatan dari
ektraksi DNA dengan penggunaan buffer CTAB dilakukan load lysate dengan menambahkan column preparation 700 µ l kedalam binding column. Setelah itu
dilakukan first column wash dengan menambahkan wash solution sebanyak 500 µ l. Adapun tahap terakhir yaitu tahapan elute DNA dengan menambahkan elution
solution sebanyak 200 µ l. Karakteristik pita DNA dapat diamati dengan melakukan elektroforesis menggunakan gel agarose dengan konsentrasi sebesar
1. Gel yang telah dieletroforesis direndam di dalam Etbr 1x selama 30 menit. Gel divisualisasikan di dalam KODAK Gel Logic 200.
13
3.3.2. PCR Polymerase Chain Reaction
