18
Salah satu masalah yang dihadapi ketika mengekstraksi daun sengon adalah adanya kandungan polisakarida yang tinggi dalam tanaman ditandai dengan
kekentalan pada hasil isolasi DNA. Oleh karena itu, untuk mengatasi hal ini maka perlu dilakukan pengenceran. Setiap sampel DNA mempunyai perlakuan
pengenceran yang berbeda, tergantung dari kualitas DNA. Pengenceran ini dilakukan agar tahap PCR primer dapat menempel pada pita DNA dan dapat
teramplifikasi. Akan tetapi, ekstraksi DNA dari jaringan tanaman dengan tingkat kemurnian yang tinggi seringkali sulit diperoleh.
4.1.1. PCR Polymerase Chain Reaction
4.1.1.1. Seleksi Primer
Seleksi primer bertujuan untuk mencari primer acak yang dapat menghasilkan amplifikasi, karena tidak semua primer nukleotida dapat
menghasilkan produk amplifikasi dan tidak semuanya menghasilkan fragmen DNA polimorfik. Untuk menyeleksi primer yang akan digunakan untuk analisis
RAPD, digunakan 41 primer 10-mer dipakai untuk amplifikasi DNA hasil ekstraksi semua individu Gambar 4.
A1 A2 A3 A4 A6 A7 A8 A9 A10 B1 B2 B3 B B5 B6 B7 B8 B9 B10 M M C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 D5 D1 D2 D3 D4 D6 D7 D8 D9 D10
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 M 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 28 30 31 32 33
Gambar 4 Hasil seleksi primer pada DNA sengon A1 ─A10 = primer OPA-1 –OPA-10;
B1 ─B10 = primer OPB-1–OPB-10; C1─C10 = Primer OPC-1–OPC-10;
D1 ─D10 = Primer OPD-1–OPD-10; 1─8 = Primer OPU─5; 9-14 = Primer
OPA ─2; 15─24 = Primer OPY-5; 25─33 = Primer OPY-3
19
Berdasarkan foto hasil seleksi pada Gambar 4, dapat dilihat kualitas pita pada DNA tanaman Sengon untuk masing-masing primer. Dari 41 primer yang
diseleksi terdapat 20 primer yang menghasilkan pita polimorfik. Tidak semua pita yang dihasilkan menunjukkan kualitas yang bagus. Ada beberapa pita yang
kurang jelas,
sehingga hal
ini mengakibatkan
keraguan dalam
menginterpretasikan serta menganalisis pita DNA Sengon. Hal ini bisa disebabkan karena kurang murninya DNA genom yang dihasilkan, proses pengenceran dan
komposisi bahan-bahan yang kurang tepat. DNA yang kurang murni dan terlalu kental dapat menghambat amplifikasi
saat PCR karena primer tidak dapat menempel pada DNA target. Selain itu, banyaknya kontaminan yang berasal dari bahan kimia yang belum tercuci
sempurna dapat menghambat primer untuk menempel pada DNA target pada tahap annealing.
Dalam penelitian ini dipilih 5 primer terbaik untuk dilakukan interpretasi dan analisis pada penelitian ini yaitu OPA-2, OPY-5, OPU-5, OPB-10 dan OPA-
3. Kualitas pita tersebut disajikan pada Tabel 5. Tabel 5
Kualitas pita pada DNA tanaman Sengon
No Primer
Jumlah Lokus
Kualitas Pita
No Primer
Jumlah Lokus
Kualitas Pita
1 OPA
─1 3
21 OPC
─2 1
2 OPA
─2 2
22 OPC
─3 2
3 OPA
─3 4
23 OPC
─4 3
4 OPA
─4 1
24 OPC
─5 3
5 OPA
─6 ─
25 OPC
─6 1
6 OPA
─7 1
26 OPC
─7 1
7 OPA
─8 2
27 OPC
─8 1
8 OPA
─9 3
28 OPD
─5 ─
9 OPA
─10 2
29 OPD
─1 2
10 OPB
─1 3
30 OPD
─2 3
11 OPB
─2 2
31 OPD
─3 ─
12 OPB
─3 1
32 OPD
─4 2
13 OPB
─4 1
33 OPD
─6 ─
14 OPB
─5 1
34 OPD
─7 ─
15 OPB
─6 1
35 OPD
─8 2
16 OPB
─7 1
36 OPD
─9 1
17 OPB
─8 3
37 OPD
─10 3
18 OPB
─9 1
38 OPU
─5 6
19 OPB
─10 5
39 OPY
─5 5
20 OPC
─1 ─
40 OPY
─3 2
= ada pita, kurang jelas; = ada pita, jelas;
─
= tidak ada pita
20
4.1.2.2. Analisis RAPD Populasi Sengon di Jawa
