Pewarnaan Gram dilakukan dengan cara : 1. Gelas objek dibersihkan dengan alkohol 70, lalu dipanggang di atas nyala api
dan dinginkan 2. Biakan diambil dengan ose secara aseptik ke atas gelas objek, diratakan dan
dikering-anginkan 3. Preparat yang telah kering difiksasi dengan cara melewatkan di atas api
4. Pada preparat diteteskan pewarna utama Gram A 1-2 tetes, dibiarka 1 menit lalu dicuci dan dikeringkan
5. Lalu ditetesi dengan larutan mordan Lugol Gram B dibiarkan 1 menit, dicuci dan dikeringkan
6. Kemudian dicuci dengan larutan peluntur Gram C selama 30 detik, dicuci dan dikeringkan
7. Lalu diberi larutan pewarna penutup Gram D dibiarkan 2 menit lalu dicuci dan dikeringkan
8. pengamatan dengan mikroskop dengan pembesaran 100 kali. Bakteri Gram positif berwarna violet dan Gram negatif berwarna merah.
3.7.4. Determinasi dan Identifikasi Bakteri
Untuk identifikasi dan determinasi suatu biakan murni dari hasil isolasi, perlu diamati morfologi koloni serta morfologi individual, sifat-sifat pewarnaan,
sifat fisiologis biokimia, patonogenesitas dan serologinya. Pada identifikasi bakteri yang pertama-tama harus dilakukan adalah pengamatan terhadap
morfologi individual dan pertumbuhannya pada bermacam-macam media. Karena bakteri tidak dapat dideterminasi hanya berdasarkan sifat-sifat morfologinya saja
tapi perlu pula diteliti sifat-sifat biokimia dan faktor-faktor yang mempengaruhi pertumbuhannya media, pH, dan temperatur. Pada pengujian untuk identifikasi
bakteri digunakan pedoman Bergey’s Manual of Determinative Bakteriology Holt et al
. 1994 .
Sifat Morfologi Bakteri:
1. Morfologi sel individual meliputi: ♦ Ukuran, bentuk, dan rangkaian sel
♦ Ada tidaknya spora, dan kedudukan spora ♦ Ada tidaknya flagela, kedudukan, dan jumlah flagela
♦ Ada tidaknya kapsula ♦ Reaksi-reaksi pengecatan pewarnaan
2. Morfologi koloni meliputi bentuk, ukuran, tekstur, warna koloni, tipe medium.
Sifat Biokimia Bakteri:
Pengujian sifat biokimia bakteri meliputi: 1.
Perubahan karbohidrat daya fermentasi terhadap zat-zat gula dan hidrolisis terhadap pati
2. Hidrolisis lemak bakteri dapat menghidrolisis lemak menjadi gliserol dan
asam lemak 3.
Penguraian protein tiap-tiap spesies bakteri mempunyai daya hidrolisis dan penguraian protein yang berbeda-beda
4. Reduksi bermacam-macam unsur bakteri anaerob dapat mereduksi garam
nitrat menjadi nitrit atau amonia, metilen blue atau indikator direduksi menjadi tidak berwarna. Bakteri bersifat aerob obligat dapat mereduksi H
2
O
2
menjadi H
2
O dan O
2
5. Pembentukan figmen pigmen akan tampak bila ada O
2
bebasaerob, dan dalam keadaan anaerob pigmen akan hilang
6. Pengujian biokimia khusus lainnya.
Tahapan identifikasi bakteri adalah sebagai berikut: 1. Isolat bakteri yang akan diuji dibiakkan pada media cair dan dilanjutkan dengan
media agar padat, setelah pertumbuhan lengkap sesuai lamanya inkubasi biakan pada suhu ruang 30-37
o
C bahkan pada suhu thermofilik hingga 50
o
C, selanjutnya diamati morfologi koloninya. Pada tahap ini dilakukan dengan
mengamati kultur biakan dan koloni yang tumbuh pada permukaan agar kasar, halus serta besarnya koloni mm. kemudian dilakukan pengamatan morfologi
pada Media Khusus Gram Negatif Mac Conkey Agar. Selain menggunakan media tersebut diatas juga dapat menggunakan media selektive artinya bakteri
yang akan diamati akan tumbuh pada media khusus SS agar, XLD agar, BRC.
1. Tes Katalase Catalase Test Menggunakan H
2
O
2
3 dengan cara meneteskan larutan tersebut pada permukaan objek glass, biakan murni diambil dengan ose lalu disentuhkan pada
tetesan tersebut, bila dalam hitungan detik terdapat gelembung udara menandakan catalase positive.
2. Tes Oksidase Oxidase Test Menggunakan NNNN-tetramethyl-p-phenylene diamine dihydrocloride
C
6
H
4
[NCH
3 2
]
2
2HCl dicamper dengan asam askorbat ascorbic acid, larutan tersebut diteteskan pada kertas saring. Biakan murni diambil dengan
ose lalu digoreskan pada kertas saring tersebut. Bila dalam beberapa detik terjadi perubahan warna biruviolet menandakan Oxidase positive
3. Motility-Slide a. Biakan yang tumbuh pada media cairbroth diambil dengan ose dan
diletakkan pada cover glass, object glass. Pergerakan positif terlihat bergerak dan berlarian dengan cepat sedang yang negatif hanya bergerak dan diam
ditempat. b. Metode kedua yaitu menggunakan agar setengah padat yang ditempatkan
pada tabung. Kultur diambil lalu ditusukkan pada media dari atas ke bawah. Setelah diinkubasi selama 24 jam terlihat penyebaran ke arah menyamping
seperti warna keruh berarti menandakan positif. 4. Indole
Indol merupakan zat yang berbau busuk yang dihasilkan oleh bakteri yang
ditumbuhkan dalam medium yang mengandung asam amino triptofan. Uji indol dengan menggunakan pepton cair pada tabung dengan bantuan pereaksi
reagent kovac’s akan terlihat warna merah.
5. Methyl Red-Voger Proskaur MRVP Pengujian ini dapat dilihat pada media methyl red pada tabung berwarna bening
teh, kultur terlebih dahulu dibiakkan semalam setelah terjadi kekeruhan ditambahkan reagen methyl red 50-100 μL. Reaksi positif bila berwarna merah
dan negatif bila berwarna kuning. Sedang untuk pengujian Vorges Proskaur
VP ke dalam media yang sama ditambahkan α-naphtol sebanyak 500-600 μL
lalu dikocok dan ditambahkan KOH 40 sebanyak 200 μL. Reaksi dapat dilihat setelah 20-30 menit berwarna merah jika positif VP.
6. Citrate Menggunakan media agar miring pada tabung yang berwarna hijau
ditambahkan bromthymol blue. Biakan digereskan pada permukaan agar lalu diinkubasi 24-72 jam, perubahan warna menjadi biru jika positif. Untuk yang
negatif di reinkubasi beberapa hari hingga terjadi perubahan. 7. Nitrate Reaction
Menggunakan nutrien broth yang ditambahkan KNO
3
. Biakan murni ditumbuhkan selama semalam setelah keruh menandakan cukup pertumbuhan
dengan menambahkan reagen Nitrate soln A dan soln B terjadi perubahan warna menjadi merah terang.
Setelah pengujian di atas, dilakukan pengujian secara biokimia dengan menggunakan berbagai macam uji gula-gula dengan menggunakan medium
Pepton water sebagai dasar medium digunakan Pepton 10 g, NaCl 5g, dan
aquadest 1000 ml lalu ditambahkan indikator phenol red pH 7.2-7.4 kemudian disterilisasi pada 115
o
C selama 20 menit. Penambahan gula-gula seperti Aesculine, Arabinoce, Dulcitol, Fructose, Galactose, Inisitol, Lactose, Maltose,
Rafinose, Rhamnose, Salicin, Sorbitol, Sucrose, Trehalose, Xylose dengan
masing-masing konsentrasi antara 0.5-1. Setelah penambahan gula-gula dilakukan sterilisasi dengan steam selama 10 menit. Perubahan warna menjadi
kuning bila positif. Secara keseluruhan tahapan proses isolasi mikroba dan determinasiidentifikasi bakteri seperti ditunjukkan pada Gambar 4.
Gambar 4 Tahapan isolasi dan identifikasi bakteri
3.7.5. Uji Kemampuan Degradasi Diazinon
