Proses Biodegradasi Diazinon Analisis Aktivitas Mikroba dengan Fluorescein Diacetate FDA Assay

ppm, 500 ppm, 1000 ppm, 1500 ppm, dan 1707 ppm dengan jumlah kompos dalam tanah 6, 10, 20, 30 dan 35. 2. Analisis kompos SMC yang meliputi: TPC, CN, KTK, unsur hara, kadar air, kadar abu, pH, aktivitas mikroba, dan kadar pestisida. 3. Pencampuran kompos dengan tanah yang telah dicemari diazinon. 4. Fermentasiinkubasi pada suhu ruang dengan kadar air bahan 30-60 selama 28 hari. 5. Analisis hasil fermentasiinkubasi kadar diazinon, TPC, CN, KTK, unsur hara, kadar air, kadar abu, pH, dan aktivitas mikroba. Gambar 3 Diagram tahapan penelitian

3.5. Proses Biodegradasi Diazinon

Sampel tanah yang belum dicemari dengan diazinon terlebih dahulu disterilisasi pada suhu 120 o C dalam autoklaf selama 15 menit setelah dingin tanah dicemari dengan pestisida organofosfat merk diazinon 60EC, kemudian tanah tersebut dicampur dengan kompos dengan perbandingan tertentu. Sebelum Sterilisasi tanah Pencampuran Analisis Kompos CN, KTK, unsur hara, Kadar air, kadar abu, pH, kadar pestisida, TPC, aktivitas mikroba Sampling: satu kali seminggu untuk analisis penurunan kadar diazinon, TPC, aktivitas mikroba Fermentasiinkubasi T = suhu ruang Kadar air bahan = 30-60 Waktu = 28 hari Isolasi Mikroba bakteri kapang Identifikasi bakteri Analisis: kadar diazinon, TPC, CN,KTK, unsur hara, kadar air, kadar abu, pH, dan aktivitas mikroba. Uji kemampuan degradasi diazinon Diazinon EC 60 Kompos limbah media jamur Tanah kompos dicampur dengan tanah, terlebih dahulu dilakukan pengujian mutu kompos tersebut. Parameter yang diuji adalah CN, unsur hara, KTK, kadar air, kadar abu, pH, TPC, aktivitas mikroba, dan kadar pestisida. Campuran tersebut kemudian diaduk hingga homogen lalu diinkubasi selama 28 hari dengan kadar air bahan 30-60 pada suhu kamar 28-32 o C dan pH 7-8. Selama proses inkubasi berlangsung sampel ditutup dengan plastik untuk mengurangi terjadinya penguapan dan tidak terkena cahaya. Sampel diambil satu kali seminggu di lima titik dengan dua kali pengambilan kemudian digabung menjadi satu dan diaduk hingga homogen sistem komposit kemudian dianalisis penurunan kadar diazinonnya. Pada akhir proses inkubasi, selain analisis penurunan kadar diazinon juga dilakukan pengujian CN, KTK, unsur hara, kadar abu, kadar air, pH, TPC, dan aktivitas mikroba.

3.6. Analisis Kadar Diazinon

Analisis kadar diazinon menggunakan metode seperti yang dilakukan oleh Ningsih 2001 yaitu menggunakan kromatografi lapis tipis KLT menggunakan plat silika gel 60 F 254 dan spektrofotometer UVVIS Beckman DU 650 pada panjang gelombang 241 nm.

3.6.1. Kromatografi Lapis Tipis KLT

Kromatografi Lapis Tipis adalah metode pemisahan fisikokimia yang lapisan pemisahan terdiri atas bahan berbutir-butir fase diam dan ditempatkan pada penyangga berupa plat gelas logam atau lapisan yang cocok, campuran yang akan dipisahkan berupa larutan. Larutan ditotolkan berupa bercak, kemudian plat diletakkan dalam bejana tertutup rapat yang berisi larutan pengembang yang cocok fase gerak yang telah dijenuhkan. Pemisahan terjadi selama perambatan fase gerak. Derajat retensi pada KLT dinyatakan sebagai “Retention Factor” Rf yang dinyatakan dengan rumus sebagai berikut: Jarak titik pusat bercak dari titik awal Rf = …………………….1 Jarak garis depan dari titik awal Metode ini dilakukan dengan maksud untuk mengetahui adanya atau tidaknya produk turunan hasil degradasi diazinon dalam sampel. Analisis kadar diazinon dengan metode KLT ini menggunakan plat silika gel 60 F 254 , eluen pengembang heksana:etilasetat dengan perbandingan 10:1 vv dan pewarna digunakan serium II sulfat. KLT dilakukan dengan cara mentotolkan sampel pada plat kemudian dimasukkan kedalam bejana yang berisi heksana dan etyl asetat dengan perbandingan 10:1 vv yang telah dijenuhkan selama 30 menit. Lalu didiamkan hingga eluen naik sampai batas garis. Spot yang terbentuk dapat dilihat dengan menggunakan sinar ultraviolet dan pewarnaan dengan menggunakan serium II sulfat.

3.6.2. Spektrofotometer UV-VIS

Spektrofotometri adalah suatu metode pengukuran serapan radiasi elektromegnetik pada panjang gelombang tertentu yang sempit dan mendekati monokromatik dan diserap oleh zat. Pelarut yang sering digunakan adalah air, metanol, n-heksana, etanol, minyak bumi, dan eter. Analisis diazinon dengan metode spektrofometri ini merupakan modifikasi yang dilakukan oleh Bavcon et al. 2003 dengan metode yang dilakukan oleh Ningsih 2001, yaitu dilakukan dengan cara mengekstraksi sebanyak 10 gram sampel dengan etil asetat sebanyak 20 ml. Larutan yang diperoleh diuapkan kemudian dilarutkan kembali dengan 2 ml metanol p.a, sampel disonifikasi agar larutan tersebut tercampur dengan baik homogen. Kemudian dilakukan pembacaan pada spektrofotometer UV-VIS Beckman DU 650 dengan sinar UV pada panjang gelombang 241 nm. Absorbansi yang diperoleh kemudian diplot pada kurva standar untuk menghitung konsentrasi diazinon dalam sampel. 3.7. Isolasi Mikroba dan Identifikasi bakteri 3.7.1. Pembuatan Media 3.7.1.1. Potato Dekstrose Agar PDA. Media ini digunakan untuk menginokulasi kapang dari SMC. Cara pembuatan: 1. Ditimbang PDA sebanyak 3.9 g dan agar powder 0.5 g. 2. Kedua bahan tersebut dicampur dan ditambahkan dengan aquadest sebanyak 100 ml, kemudian dipanaskan sambil diaduk. 3. Setelah mendidih dan homogen media disterilisasi dalam autoklaf pada suhu 121 o C selama 15 menit. 4. Media didinginkan hangat kuku lalu ditambahkan khloramphenikol 50 ppm sebanyak 1 ml yang telah disterilkan dengan millipore 0.45 μm. 5. Media dituang ke dalam petri steril ± 1-2 ml, dan didinginkan 6. Setelah padat petri ditutup dan dibalik agar uap air tidak jatuh ke atas permukaan agar. 3.7.1.2. Nutrien Agar NA Media ini digunakan untuk menginokulasi bakteri dari SMC. Cara pembuatan: 1. Ditimbang NA sebanyak 2.3 g dan agar powder 0.5 g. 2. Kedua bahan tersebut dicampur dan ditambahkan dengan aquadest sebanyak 100 ml, kemudian dipanaskan sambil diaduk. 3. Setelah mendidih dan homogen media disterilisasi dalam autoklaf pada suhu 121 o C selama 15 menit. 4. Media didinginkan hangat kuku lalu ditambahkan nistatyn 50 ppm sebanyak 1 ml yang telah disterilkan dengan millipore 0.45 μm. 5. Media dituang ke dalam petri steril ± 1-2 ml, dan didinginkan 6. Setelah padat petri ditutup dan dibalik agar uap air tidak jatuh ke atas permukaan agar.

3.7.2. Isolasi Mikroba Bakteri dan Kapang

Mikroba yang terdapat dalam SMC masih merupakan koloni campuran sehingga perlu dilakukan isolasi untuk mendapatkan isolatbiakan murni koloni tunggal. Isolasi mikroba dapat dilakukan dengan dua cara yaitu : 1. Metode Cawan TuangTaburan Puor Plate Method Metode ini dilakukan dengan cara menggoreskan suspensi bahan yang mengandung bakteri pada permukaan medium agar yang sesuai dalam cawan petri. Setelah diinkubasi pada bekas goresan akan tumbuh koloni-koloni yang terpisah yang mungkin berasal dari satu sel bakteri, sehingga dapat diisolasi lebih lanjut. Metode goresan ini dapat dilakukan dengan metode goresan lurus, kuadran, atau radian. 2. Metode Cawan Gores Streak Plate Method Metode dilakukan dengan cara menginokulasi medium agar yang sedang mencair pada temperatur 50 o C dengan suspensi bahan yang mengandung bakteri dan menuangkannya ke dalam cawan petri, setelah diinkubasi akan terlihat koloni- koloni yang tersebar di permukaan agar. Dalam penelitian ini isolasi mikroba dilakukan dengan metode cawan tuanggores yaitu dengan menginokulasi SMC pada media padat Nutrient Agar NA dan Potato Dekstrose Agar PDA. Pada media padat NA ditambahkan zat antibiotik nistatyn yang berfungsi untuk menghambat pertumbuhan mikroorganisme kapang dan khamir sedangkan pada media padat PDA ditambahkan dengan khloramphenikol untuk menghambat pertumbuhan bakteri. Inokulasi mikroba ini dilakukan dengan dua metode yaitu cair dan padat: 1. Menimbang SMC sebanyak 1gram lalu di larutkan dengan air steril sebanyak 10 ml kemudian di goyang shaker selama 30 menit, supernatan yang diperoleh dipipet sebanyak 100 μl lalu dituang kedalam cawan petri yang berisi media PDA dan NA 2. Ditimbang kompos sebanyak 5 gram lalu ditabur kedalam cawan petri yang yang berisi media PDA dan NA. Masing-masing cawan petri diinkubasi dengan posisi terbalik pada suhu kamar selama 24-48 jam. Bakteri dan kapang yang tumbuh dipindahkan pada media padat lain untuk memperoleh biakan murni. Setelah 2-3 hari isolat yang tumbuh pada media awal dipindahkan dan dipisahkan berdasarkan perbedaan bentuk dan morfologinya ke media padat NA dan PDA lainnya yang tidak mengandung nistatyn dan khloramphenikol. Isolat-isolat tersebut dipindahkan dengan menggunakan jarum ose kemudian menggoreskannya pada media padat untuk memisahkan isolat-isolat tersebut agar diperoleh koloni tunggal single coloni . Koloni tersebut diinkubasi selama 3 hari pada suhu ruang. Hal ini dilakukan berulang-ulang hingga diperoleh isolat yang murni. Isolat yang telah murni dipindahkan ke dalam media agar miring NA dan PDA dengan cara membuat garis zig zag. Kemudian diinkubasi selama 3 hari pada suhu ruang lalu disimpan dalam lemari pendingin.

3.7.3. Pewarnaan bakteri

Pewarnaan bakteri dimaksudkan untuk melihat struktur sel bakteri dengan seksama. Fungsi pewarnaan bakteri terutama memberi warna pada sel dan bagian-bagiannya agar lebih kontras dan tampak lebih jelas, sehingga dapat diamati berbagai bentuk morfologi, jenis gram positif atau gram negatif, susunan bakteri, serta sel-sel bakteri spora, kapsel, atau flagela. Sel-sel bakteri yang tidak diwarnai pada umumnya sukar diamati dengan mikroskop cahaya biasa, karena sitoplasma sel mempunyai indeks bias yang hampir sama dengan indeks bias lingkungannya Lay 1992. Hasil pewarnaan sangat dipengaruhi oleh beberapa faktor yaitu: a. Fiksasi, sebelum bakteri diwarnai terlebih dahulu dilakukan fiksasi dengan menggunakan cara fisik pemanasan atau dengan freeze drying ataupun menggunakan agen kimia asam pikrat, alkohol, aseton, asam kromat-asam osmiat. Fiksasi berfungsi untuk 1 Mencegah mengkerutnya globula-globula protein sel; 2 Mempertinggi sifat reaktif gugusan-gugusan karboksilat, amino primer, sulfihidril; 3 Merubah afinitas pewarna bakteri; 4 Mencegah terjadinya otolisis sel; 5 Dapat membunuh bakteri secara cepat dengan tidak menyebabkan perubahan-perubahan bentuk atau strukturnya; 6 Melekatkan bakteri di atas gelas benda; 7 Membuat sel lebih kuat keras. b. Substrat, tiap pewarna asam maupun basa dapat bereaksi dengan konstituen sel. Oleh karena itu substrat organik lipid, protein, asam nukleat, dan karbohidrat akan mempengaruhi pewarnaan bakteri. Sehingga dapat dibedakan sel-sel yang 1 basofil, yaitu sel-sel yang dapat mengikat pewarna bakteri basa; 2 asidofil atau oksifil, yaitu sel-sel yang dapat mengikat pewarna bakteri asam; 3 sudanolfil, yaitu sel-sel yang dapat mengikat pewarna bakteri yang dapat larut dalam minyak. c. Intensifikasi Pewarnaan, dilakukan dengan mempertinggi kadar pewarna, temperatur pewarnaan 60-90 o C atau menambah suatu mordan. d. Pelunturan pewarna bakteri Decolorizer, digunakan untuk mendapatkan kontras yang baik pada bayangan mikroskop. Beberapa cara pewarnaan bakteri yang biasa dilakukan ialah pewarnaan sederhana, pewarnaan deferensial, pewarnaan Gram, pewarnaan Ziehl Neelsen acid fast, dan pewarnaan negatif Lay 1992. Pada penelitian ini dilakukan pewarnaan bakteri dengan menggunakan metode pewarnaan Gram. Pewarnaan gram meliputi 4 tingkatan yaitu: 1. Pemberian pewarna utama larutan pewarna kristal violet, warna ungu 2. Pengintensifan pewarna utama dengan menambahkan larutan mordan JKJ 3. Pencucian dekolorisasi dengan alkohol 70 4. Pemberian pewarna penutup pewarna lawan, counterstain larutan pewarna safranin yang berwarna merah. Dengan pewarnaan Gram maka dapat dibedakan bakteri yang bersifat positif dan bersifat negatif: 1 Bakteri Gram positif ialah bakteri yang mengikat pewarna utama dengan kuat sehingga tidak dapat dilunturkan dan diwarnai oleh pewarna lawan. Dengan menggunakan mikroskop sel-sel bakteri ini tampak berwarna violet; 2 Bakteri Gram negatif ialah bakteri yang daya ikat terhadap pewarna utama tidak kuat, sehingga dapat dilunturkan dan diwarnai oleh pewarna lawan. Dengan pengamatan mikroskopik sel bakteri ini tampak berwarna merah. Sifat Gram terutama ditentukan oleh sifat-sifat fisik dan kimia dinding sel dan membran sitoplasma. Dinding sel dan membran sitoplasma bakteri Gram positif mempunyai afinitas yang besar terhadap kompleks pewarna kristal violet dan iodium, sedang pada Gram negatif tidak. Pada waktu pewarnaan, larutan kristal violet dan iodium menembus sel bakteri. Pada sel bakteri Gram positif zat- zat ini membentuk senyawa yang sukar larut, tidak larut dalam peluntur, dan tidak diwarnai oleh pewarna penutup sedang bakteri Gram negatif tidak demikian. Pewarnaan Gram dilakukan dengan cara : 1. Gelas objek dibersihkan dengan alkohol 70, lalu dipanggang di atas nyala api dan dinginkan 2. Biakan diambil dengan ose secara aseptik ke atas gelas objek, diratakan dan dikering-anginkan 3. Preparat yang telah kering difiksasi dengan cara melewatkan di atas api 4. Pada preparat diteteskan pewarna utama Gram A 1-2 tetes, dibiarka 1 menit lalu dicuci dan dikeringkan 5. Lalu ditetesi dengan larutan mordan Lugol Gram B dibiarkan 1 menit, dicuci dan dikeringkan 6. Kemudian dicuci dengan larutan peluntur Gram C selama 30 detik, dicuci dan dikeringkan 7. Lalu diberi larutan pewarna penutup Gram D dibiarkan 2 menit lalu dicuci dan dikeringkan 8. pengamatan dengan mikroskop dengan pembesaran 100 kali. Bakteri Gram positif berwarna violet dan Gram negatif berwarna merah.

3.7.4. Determinasi dan Identifikasi Bakteri

Untuk identifikasi dan determinasi suatu biakan murni dari hasil isolasi, perlu diamati morfologi koloni serta morfologi individual, sifat-sifat pewarnaan, sifat fisiologis biokimia, patonogenesitas dan serologinya. Pada identifikasi bakteri yang pertama-tama harus dilakukan adalah pengamatan terhadap morfologi individual dan pertumbuhannya pada bermacam-macam media. Karena bakteri tidak dapat dideterminasi hanya berdasarkan sifat-sifat morfologinya saja tapi perlu pula diteliti sifat-sifat biokimia dan faktor-faktor yang mempengaruhi pertumbuhannya media, pH, dan temperatur. Pada pengujian untuk identifikasi bakteri digunakan pedoman Bergey’s Manual of Determinative Bakteriology Holt et al . 1994 . Sifat Morfologi Bakteri: 1. Morfologi sel individual meliputi: ♦ Ukuran, bentuk, dan rangkaian sel ♦ Ada tidaknya spora, dan kedudukan spora ♦ Ada tidaknya flagela, kedudukan, dan jumlah flagela ♦ Ada tidaknya kapsula ♦ Reaksi-reaksi pengecatan pewarnaan 2. Morfologi koloni meliputi bentuk, ukuran, tekstur, warna koloni, tipe medium. Sifat Biokimia Bakteri: Pengujian sifat biokimia bakteri meliputi: 1. Perubahan karbohidrat daya fermentasi terhadap zat-zat gula dan hidrolisis terhadap pati 2. Hidrolisis lemak bakteri dapat menghidrolisis lemak menjadi gliserol dan asam lemak 3. Penguraian protein tiap-tiap spesies bakteri mempunyai daya hidrolisis dan penguraian protein yang berbeda-beda 4. Reduksi bermacam-macam unsur bakteri anaerob dapat mereduksi garam nitrat menjadi nitrit atau amonia, metilen blue atau indikator direduksi menjadi tidak berwarna. Bakteri bersifat aerob obligat dapat mereduksi H 2 O 2 menjadi H 2 O dan O 2 5. Pembentukan figmen pigmen akan tampak bila ada O 2 bebasaerob, dan dalam keadaan anaerob pigmen akan hilang 6. Pengujian biokimia khusus lainnya. Tahapan identifikasi bakteri adalah sebagai berikut: 1. Isolat bakteri yang akan diuji dibiakkan pada media cair dan dilanjutkan dengan media agar padat, setelah pertumbuhan lengkap sesuai lamanya inkubasi biakan pada suhu ruang 30-37 o C bahkan pada suhu thermofilik hingga 50 o C, selanjutnya diamati morfologi koloninya. Pada tahap ini dilakukan dengan mengamati kultur biakan dan koloni yang tumbuh pada permukaan agar kasar, halus serta besarnya koloni mm. kemudian dilakukan pengamatan morfologi pada Media Khusus Gram Negatif Mac Conkey Agar. Selain menggunakan media tersebut diatas juga dapat menggunakan media selektive artinya bakteri yang akan diamati akan tumbuh pada media khusus SS agar, XLD agar, BRC. 1. Tes Katalase Catalase Test Menggunakan H 2 O 2 3 dengan cara meneteskan larutan tersebut pada permukaan objek glass, biakan murni diambil dengan ose lalu disentuhkan pada tetesan tersebut, bila dalam hitungan detik terdapat gelembung udara menandakan catalase positive. 2. Tes Oksidase Oxidase Test Menggunakan NNNN-tetramethyl-p-phenylene diamine dihydrocloride C 6 H 4 [NCH 3 2 ] 2 2HCl dicamper dengan asam askorbat ascorbic acid, larutan tersebut diteteskan pada kertas saring. Biakan murni diambil dengan ose lalu digoreskan pada kertas saring tersebut. Bila dalam beberapa detik terjadi perubahan warna biruviolet menandakan Oxidase positive 3. Motility-Slide a. Biakan yang tumbuh pada media cairbroth diambil dengan ose dan diletakkan pada cover glass, object glass. Pergerakan positif terlihat bergerak dan berlarian dengan cepat sedang yang negatif hanya bergerak dan diam ditempat. b. Metode kedua yaitu menggunakan agar setengah padat yang ditempatkan pada tabung. Kultur diambil lalu ditusukkan pada media dari atas ke bawah. Setelah diinkubasi selama 24 jam terlihat penyebaran ke arah menyamping seperti warna keruh berarti menandakan positif. 4. Indole Indol merupakan zat yang berbau busuk yang dihasilkan oleh bakteri yang ditumbuhkan dalam medium yang mengandung asam amino triptofan. Uji indol dengan menggunakan pepton cair pada tabung dengan bantuan pereaksi reagent kovac’s akan terlihat warna merah. 5. Methyl Red-Voger Proskaur MRVP Pengujian ini dapat dilihat pada media methyl red pada tabung berwarna bening teh, kultur terlebih dahulu dibiakkan semalam setelah terjadi kekeruhan ditambahkan reagen methyl red 50-100 μL. Reaksi positif bila berwarna merah dan negatif bila berwarna kuning. Sedang untuk pengujian Vorges Proskaur VP ke dalam media yang sama ditambahkan α-naphtol sebanyak 500-600 μL lalu dikocok dan ditambahkan KOH 40 sebanyak 200 μL. Reaksi dapat dilihat setelah 20-30 menit berwarna merah jika positif VP. 6. Citrate Menggunakan media agar miring pada tabung yang berwarna hijau ditambahkan bromthymol blue. Biakan digereskan pada permukaan agar lalu diinkubasi 24-72 jam, perubahan warna menjadi biru jika positif. Untuk yang negatif di reinkubasi beberapa hari hingga terjadi perubahan. 7. Nitrate Reaction Menggunakan nutrien broth yang ditambahkan KNO 3 . Biakan murni ditumbuhkan selama semalam setelah keruh menandakan cukup pertumbuhan dengan menambahkan reagen Nitrate soln A dan soln B terjadi perubahan warna menjadi merah terang. Setelah pengujian di atas, dilakukan pengujian secara biokimia dengan menggunakan berbagai macam uji gula-gula dengan menggunakan medium Pepton water sebagai dasar medium digunakan Pepton 10 g, NaCl 5g, dan aquadest 1000 ml lalu ditambahkan indikator phenol red pH 7.2-7.4 kemudian disterilisasi pada 115 o C selama 20 menit. Penambahan gula-gula seperti Aesculine, Arabinoce, Dulcitol, Fructose, Galactose, Inisitol, Lactose, Maltose, Rafinose, Rhamnose, Salicin, Sorbitol, Sucrose, Trehalose, Xylose dengan masing-masing konsentrasi antara 0.5-1. Setelah penambahan gula-gula dilakukan sterilisasi dengan steam selama 10 menit. Perubahan warna menjadi kuning bila positif. Secara keseluruhan tahapan proses isolasi mikroba dan determinasiidentifikasi bakteri seperti ditunjukkan pada Gambar 4. Gambar 4 Tahapan isolasi dan identifikasi bakteri

3.7.5. Uji Kemampuan Degradasi Diazinon

Mikroorganisme dapat mendegradasi pestisida apabila mikroorganisme tersebut diadaptasikan terlebih dahulu dengan lingkungan yang mengandung pestisida. Karena dalam proses adaptasi tersebut terjadi sintesis enzim yang dibutuhkan unuk mendegradasi senyawa-senyawa rekalsitran Gumbira-Said dan Fauzi 1995. Persiapan Sampel Pembuatan Media PDA NA Pembiakan inokulasi mikroba Pembiakan Bakteri dalam media NA Pembiakan KapangKhamir dalam media PDA Isolasi Bakteri Isolasi KapangKhamir Determinasiidentifikasi bakter i Pewarnaan bakteri Uji sifat Biokimia Koloni tunggal Koloni tunggal GenusSpesies Bakteri yang diperoleh dari hasil identifikasi lalu diujikan pertumbuhannya. Media pertumbuhan dan adaptasi yang digunakan adalah Nutrient Agar NA padat yang mengandung 100 dan 500 ppm diazinon. Bakteri yang tumbuh kemudian dilakukan uji pembentukan zona jernih untuk menguji kemampuannya dalam mendegradasi diazinon. Media yang digunakan adalah media MSPY Mineral Salt Pepton Yeast yang mengandung diazinon 1000 ppm, 1500 ppm, dan 1700 ppm. Bakteri tersebut diinokulasi selama empat hari untuk melihat aktivitasnya dalam mendegradasi diazinon. 3.7.5.1. Pembuatan Media NA adaptasi. Cara pembuatan media ini yakni dengan menimbang NA sebanyak 2.3 g dan agar powder 0.5 g ke dalam 100 ml air destilata kemudian dipanaskan sambil diaduk. Setelah mendidih dan homogen media disterilisasi dalam autoklaf pada suhu 121 o C selama 15 menit. Kemudian media didinginkan hangat kuku lalu ditambahkan diazinon 100 dan 500 ppm lalu dituang ke dalam petri steril. Setelah padat petri ditutup dan dibalik agar uap air tidak jatuh ke atas permukaan agar. Kemudian bakteri diinokulasikan dan diinkubasi pada suhu 30 o C selama 3 hari. 3.7.5.2. Pembuatan Media MSPY. Pembuatan media MSPY dilakukan dengan cara melarutkan KH 2 PO 4 0.2 g, K 2 HPO 4 0.5 g, MgSO 4 .7H 2 O 0.2 g, NaCl 0.2 g, CaCl 2 .2H 2 O 0.05 g, FeSO 4 .7H 2 O 0.025 g, Na 2 MoO 4, 0.005 g, MnSO 4 0.0005 g, NaWo 2 0.0005 g, Bakto peptone 1.0 g, dan Yeast extract 2.0 g, ke dalam gelas piala yang berisi 1 liter air destilata kemudian diaduk sambil mengatur pH pada kisaran 7.0 pH netral. Lalu larutan media dipindahkan ke dalam erlenmeyer yang berukuran 1 liter dan diisi bacto agar sebanyak 15 g, kemudian disterilkan dalam autoklaf Oshiro 1996. Media steril tersebut kemudian ditambahkan diazinon dengan konsentrasi masing- masing, 1000 ppm, 1500 ppm, dan 1700 pm. Menurut Margot dan Stammbach 1964, bahwa diazinon menguap pada suhu 83-84 o C, sensitif terhadap oksidasi pada suhu di atas 100 o C dan terdegradasi pada di atas 120 o C sehingga diazinon tidak dapat disterilkan dengan autoklaf. Oleh karena itu diazinon harus disterilkan melalui proses sterilisasi penyaringan yakni dengan menggunakan filter ukuran 0.45 μm millipore.

3.8. Analisis Aktivitas Mikroba dengan Fluorescein Diacetate FDA Assay

Analisis aktivitas mikroba dilakukan dengan menggunakan metode seperti yang dilakukan oleh Eggen 1999, yaitu menggunakan Fluorescein Diacetate FDA Assay. FDA tidak digunakan untuk menghitung biomassa mikrobial tetapi untuk membandingkan aktivitas mikroba hydrolitik dalam satu ekosistem yang sama. Penentuan FDA dilakukan dengan cara menginkubasi sampel dalam larutan buffer, yang bertindak sebagai penerima elektron yang menurunkan warna fluorescein. Intensitas warna ditentukan dengan menggunakan spektofotometri. Larutan standar FDA dibuat dengan melarutkan 0.0399 gram FDA ke dalam 100 mL aseton. Kemudian ditimbang 10 gram kompos ke dalam erlenmeyer yang telah diisi dengan larutan standar FDA masing-masing 0, 0.1; 0.2, 0.3, 0.5, 1.0 dan 1.5 mL, masing-masing erlenmeyer ditambah 50 mL buffer fosfat. Larutan standar diinkubasi dengan penggoyangan rotary shaker pada kecepatan 120 rpm selama satu jam kemudian ditambahkan 50 mL aseton untuk menghentikan reaksi hidrolisis. Larutan disentrifugasi dengan kecepatan 6000 rpm selama 10 menit, lalu disaring. Absorban filtrat diukur dengan spektrofotometri UV-VIS Beckman DU 650 pada panjang gelombang λ 490 nm. Perlakuan pada sampel dilakukan dengan cara menimbang FDA 0.200 gram lalu dilarutkan dengan aseton kemudian ditambah dangan “deionized water” aquabidest hingga 100 mL sebagai larutan stok. Sampel di timbang masing- masing 10 gram ke dalam erlenmeyer lalu ditambah 50 ml buffer fosfat pH 7.6 dan larutan FDA 0.5 mL kemudian diinkubasi dengan rotary shaker pada kecepatan 120 rpm selama satu jam kemudian ditambahkan 50 mL aseton. Larutan didekantasi pindahkan ke dalam tabung sentrifugasi dan disetrifugasi dengan kecepatan 6000 rpm selama 10 menit, lalu disaring dengan millipore 0.45 μm. Absorban diukur dengan spektrofotometri pada panjang gelombang λ 490 nm.

3.9. Rancangan Percobaan