mengandung nistatyn dan khloramphenikol. Isolat-isolat tersebut dipindahkan dengan menggunakan jarum ose kemudian menggoreskannya pada media padat
untuk memisahkan isolat-isolat tersebut agar diperoleh koloni tunggal single coloni
. Koloni tersebut diinkubasi selama 3 hari pada suhu ruang. Hal ini dilakukan berulang-ulang hingga diperoleh isolat yang murni. Isolat yang telah
murni dipindahkan ke dalam media agar miring NA dan PDA dengan cara membuat garis zig zag. Kemudian diinkubasi selama 3 hari pada suhu ruang lalu
disimpan dalam lemari pendingin.
3.7.3. Pewarnaan bakteri
Pewarnaan bakteri dimaksudkan untuk melihat struktur sel bakteri dengan seksama. Fungsi pewarnaan bakteri terutama memberi warna pada sel dan
bagian-bagiannya agar lebih kontras dan tampak lebih jelas, sehingga dapat diamati berbagai bentuk morfologi, jenis gram positif atau gram negatif,
susunan bakteri, serta sel-sel bakteri spora, kapsel, atau flagela. Sel-sel bakteri yang tidak diwarnai pada umumnya sukar diamati dengan mikroskop cahaya
biasa, karena sitoplasma sel mempunyai indeks bias yang hampir sama dengan indeks bias lingkungannya Lay 1992. Hasil pewarnaan sangat dipengaruhi oleh
beberapa faktor yaitu: a.
Fiksasi, sebelum bakteri diwarnai terlebih dahulu dilakukan fiksasi dengan
menggunakan cara fisik pemanasan atau dengan freeze drying ataupun menggunakan agen kimia asam pikrat, alkohol, aseton, asam kromat-asam
osmiat. Fiksasi berfungsi untuk 1 Mencegah mengkerutnya globula-globula protein sel; 2 Mempertinggi sifat reaktif gugusan-gugusan karboksilat,
amino primer, sulfihidril; 3 Merubah afinitas pewarna bakteri; 4 Mencegah terjadinya otolisis sel; 5 Dapat membunuh bakteri secara cepat dengan tidak
menyebabkan perubahan-perubahan bentuk atau strukturnya; 6 Melekatkan bakteri di atas gelas benda; 7 Membuat sel lebih kuat keras.
b.
Substrat, tiap pewarna asam maupun basa dapat bereaksi dengan konstituen
sel. Oleh karena itu substrat organik lipid, protein, asam nukleat, dan karbohidrat akan mempengaruhi pewarnaan bakteri. Sehingga dapat
dibedakan sel-sel yang 1 basofil, yaitu sel-sel yang dapat mengikat pewarna
bakteri basa; 2 asidofil atau oksifil, yaitu sel-sel yang dapat mengikat pewarna bakteri asam; 3 sudanolfil, yaitu sel-sel yang dapat mengikat
pewarna bakteri yang dapat larut dalam minyak. c.
Intensifikasi Pewarnaan, dilakukan dengan mempertinggi kadar pewarna,
temperatur pewarnaan 60-90
o
C atau menambah suatu mordan. d.
Pelunturan pewarna bakteri Decolorizer, digunakan untuk mendapatkan
kontras yang baik pada bayangan mikroskop. Beberapa cara pewarnaan bakteri yang biasa dilakukan ialah pewarnaan
sederhana, pewarnaan deferensial, pewarnaan Gram, pewarnaan Ziehl Neelsen acid fast, dan pewarnaan negatif Lay 1992. Pada penelitian ini dilakukan
pewarnaan bakteri dengan menggunakan metode pewarnaan Gram. Pewarnaan gram meliputi 4 tingkatan yaitu:
1. Pemberian pewarna utama larutan pewarna kristal violet, warna ungu 2. Pengintensifan pewarna utama dengan menambahkan larutan mordan JKJ
3. Pencucian dekolorisasi dengan alkohol 70 4. Pemberian pewarna penutup pewarna lawan, counterstain larutan pewarna
safranin yang berwarna merah. Dengan pewarnaan Gram maka dapat dibedakan bakteri yang bersifat
positif dan bersifat negatif: 1 Bakteri Gram positif ialah bakteri yang mengikat pewarna utama dengan kuat sehingga tidak dapat dilunturkan dan diwarnai oleh
pewarna lawan. Dengan menggunakan mikroskop sel-sel bakteri ini tampak berwarna violet; 2 Bakteri Gram negatif ialah bakteri yang daya ikat terhadap
pewarna utama tidak kuat, sehingga dapat dilunturkan dan diwarnai oleh pewarna lawan. Dengan pengamatan mikroskopik sel bakteri ini tampak berwarna merah.
Sifat Gram terutama ditentukan oleh sifat-sifat fisik dan kimia dinding sel dan membran sitoplasma. Dinding sel dan membran sitoplasma bakteri Gram
positif mempunyai afinitas yang besar terhadap kompleks pewarna kristal violet dan iodium, sedang pada Gram negatif tidak. Pada waktu pewarnaan, larutan
kristal violet dan iodium menembus sel bakteri. Pada sel bakteri Gram positif zat- zat ini membentuk senyawa yang sukar larut, tidak larut dalam peluntur, dan tidak
diwarnai oleh pewarna penutup sedang bakteri Gram negatif tidak demikian.
Pewarnaan Gram dilakukan dengan cara : 1. Gelas objek dibersihkan dengan alkohol 70, lalu dipanggang di atas nyala api
dan dinginkan 2. Biakan diambil dengan ose secara aseptik ke atas gelas objek, diratakan dan
dikering-anginkan 3. Preparat yang telah kering difiksasi dengan cara melewatkan di atas api
4. Pada preparat diteteskan pewarna utama Gram A 1-2 tetes, dibiarka 1 menit lalu dicuci dan dikeringkan
5. Lalu ditetesi dengan larutan mordan Lugol Gram B dibiarkan 1 menit, dicuci dan dikeringkan
6. Kemudian dicuci dengan larutan peluntur Gram C selama 30 detik, dicuci dan dikeringkan
7. Lalu diberi larutan pewarna penutup Gram D dibiarkan 2 menit lalu dicuci dan dikeringkan
8. pengamatan dengan mikroskop dengan pembesaran 100 kali. Bakteri Gram positif berwarna violet dan Gram negatif berwarna merah.
3.7.4. Determinasi dan Identifikasi Bakteri
