13
3 MATERI DAN METODE
Penelitian ini memiliki dua tahap percobaan yang bertujuan untuk mempermudah mencapai tujuan utama penelitian. Percobaan pertama adalah
efektivitas jenis dan dosis antibiotik terhadap penurunan populasi total mikroflora saluran pencernaan ikan mas. Percobaan kedua adalah evaluasi kontribusi
mikroflora saluran pencernaan terhadap efisiensi retensi protein dan pertumbuhan. Dua tahap percobaan yang dilakukan diuraikan sebagai berikut.
3.1 Efektivitas jenis dan dosis antibotik terhadap penurunan populasi mikroflora saluran pencernaan ikan mas
Percobaan pertama, bertujuan untuk menganalisis efektivitas jenis dan dosis antibiotik dalam menurunkan populasi total mikroflora saluran pencernaan
dan selanjutnya akan digunakan sebagai kontrol negatif pada percobaan kedua. 3.1.1 Tempat dan Waktu
Penelitian dilakukan di Laboratorium Fisiologi Hewan Air, Fakultas Perikanan, Laboratorium Biokimia, Fisiologi dan Mikrobiologi Nutrisi,
Laboratorium Ilmu dan Teknologi Pakan Fakultas Peternakan serta Laboratorium SEAFAST South East Asian Food and Agricultural Science and Technology
Center, IPB. Penelitian dilaksanakan selama 2 bulan, mulai bulan Desember 2009 sampai dengan Februari 2010.
3.1.2 Materi a. Hewan uji
Hewan uji yang digunakan berupa ikan mas dengan ukuran berat 15-20 g per ekor. Jumlah ikan yang digunakan sebanyak 108 ekor. Masing-masing
ditempatkan pada aquaria berukuran 50x40x40 cm dan setiap akuarium berisi sebanyak 4 ekor per unit percobaan. Satu unit percobaan mewakili satu ulangan.
b. Sumber inokulum
Saluran pencernaan ikan mas yang telah diberi perlakuan selama 8 hari, merupakan sumber inokulum mikroflora. Saluran pencernaan yang telah
dihaluskan, diencerkan menggunakan NaCl fisiologis 0,85 kemudian dikultur pada media MRSA DeMan Rogosa Sharp Agar dikerjakan secara in vitro.
14 MRSA merupakan media sensitif yang digunakan untuk menguji keberadaan
bakteri gram positif, khususnya bakteri asam laktat.
c. Pakan uji
Pakan uji yang digunakan dalam penelitian ini merupakan pakan iso- energi dan iso-protein yang disusun dengan komposisi nutrien yang telah
disesuaikan dengan kebutuhan hewan uji, dengan kandungan protein sebesar 26. Pakan perlakuan terdiri dari pakan kontrol tanpa antibiotik dan pakan yang
dicampur dengan 3 jenis antibiotik berbeda; streptomisin S, tetrasiklin T, dan amphisilin A dengan dosis berbeda; 100, 150 dan 200 ppm. Pakan basal tanpa
antibiotik merupakan pakan kontrol, yang digunakan sebagai pembanding pada pakan dengan penambahan antibiotik. Komposisi pakan dapat diamati pada Tabel
1. Tabel 1 Komposisi pakan untuk melihat efektivitas jenis dan dosis antibiotik
terhadap penurunan populasi mikroflora saluran pencernaan setiap perlakuan BK
Bahan Pakan K
S100 S150 S200 T100 T150 T200 A100 A150 A200
T. ikan 15,80 15,80 15,80 15,80 15,80 15,80 15,80 15,80 15,80 15,80
T. udang 14,55 14,55 14,55 14,55 14,55 14,55 14,55 14,55 14,55 14,55
T. kedelai 17,49 17,49 17,49 17,49 17,49 17,49 17,49 17,49 17,49 17,49
T. jagung giling 22,44 22,44 22,44 22,44 22,44 22,44 22,44 22,44 22,44 22,44
Dedak 16,74 16,74 16,74 16,74 16,74 16,74 16,74 16,74 16,74 16,74
Terigu 9,98 9,98
9,98 9,98
9,98 9,98
9,98 9,98
9,98 9,98
Minyak Kedelai 3,00 3,00
3,00 3,00
3,00 3,00
3,00 3,00
3,00 3,00
Streptomisin ppm 0,00 100
150 200
Tetrasiklin ppm 100
150 200
Amphisilin ppm 100
150 200
Keterangan: K: Kontrol, S100, S150, S200 Streptomisin dosis 100, 150, 200 ppm, T100, T150, T200 Tetrasiklin dosis 100, 150, 200 ppm dan A100, A150, A200 Ampisilin dosis
100, 150, 200 ppm
Pellet yang telah dibuat diukur gross energinya dan analisis kimia proksimat AOAC 1993. Hasil komposisi kimiawi pellet pada Tabel 1 terdiri dari
kadar air 6,6, abu8,7, lemak kasar 8,6, protein kasar 26,0, serat kasar 3,8, BETN 52,8 dengan gross energi pellet 3465,3 Kalkg.
3.1.3 Prosedur kerja
Hewan uji dipelihara di dalam aquarium dan bagian sisi wadah ditutup dengan terpal berwarna gelap, untuk meminimalisir stress pada ikan yang
15 diakibatkan oleh lingkungan. Untuk menghindari ikan tidak melompat, dibagian
atas aquarium ditutup dengan menggunakan kassa nyamuk, yang sisin-sisinya dijepit. Sebelum digunakan, wadah dan semua peralatannya didisinfektan terlebih
dahulu menggunakan kaporit CaCO
3
Perlakuan pemberian pakan dimulai pada hari pertama setelah pemuasaan 24 jam pasca aklimasi hingga hari ke-8. Pakan uji diberikan dua kali sehari secara
ad libitum pada pagi hari pukul 8.00 WIB dan sore hari pukul 14.00 WIB. Setelah 8 hari diberi pakan uji, ikan uji diamati populasi total mikroflora pada saluran
cerna dengan cara pengambilan saluran pencernaan ikan mas sebagai sumber inokulum. Pengambilan sampel dilakukan dengan pemingsanan hewan uji dengan
zat anastesi minyak cengeh 1 ppm. Pembedahan dilakukan dengan menggunakan gunting yang telah disterilkan dengan alkohol 70 dan dikerjakan dekat api
bunsen untuk mencegah kontaminasi. Organ pencernaan usus dikeluarkan dari ikan mas yang telah dimatikan. Organ pencernaan di ukur panjangnya dan
ditimbang 1,2 g. Organ pencernaan digerus, setelah dihaluskan 1 g diencerkan dengan 9 ml cairan fisiologis NaCl 0.85 steril. Prosedur isolasi mikroba
mengacu pada metode yang dilakukan pada hewan terrestrial seperti petunjuk Hungate 1966, serta mengkombinasikannya dengan prosedur isolasi mikroba
dari saluran pencernaan ikan seperti metode yang dilakukan oleh Nakayama et al. 1994 dan Tae 2003. Kultur mikroba dilakukan dalam suasana aerob.
Pengenceran berseri di lakukan dari 10 . Aquarium diisi air sebanyak 40-45 L dan
direndam dengan kaporit 24 jam, kemudian dibilas dengan rendaman air bersih sebanyak 3 kali dan didiamkan selama 24 jam. Ikan mas dengan bobot rata-rata
15-20g ditebar dengan kepadatan 4 ekor per aquarium 1 unit percobaan. Sebelum di tebar, ikan diaklimasi terlebih dahulu selama 1 minggu dan diberi
pakan pellet, hal ini bertujuan untuk mengadaptasi ikan dengan lingkungan pemeliharaan. Setelah masa aklimasi selesai ikan uji dipuasakan selama 24 jam
dengan tujuan menghilangkan sisa pakan dalam tubuh.
-1
sampai 10
-7
, dengan cara mengambil 0,5 ml dari kultur mikroba pada media cair dan dimasukkan ke dalam 4,50 ml media
pengencer pertama cairan fisiologis NaCl 0,85, selanjutnya dari media pengencer pertama diambil 0,5 ml dan dimasukkan ke dalam 4,50 ml media
pengencer kedua dan seterusnya hingga media pengencer terakhir. Homogenisasi
16 dengan vortex selalu dilakukan sebelum rangkaian kegiatan pengenceran
dilakukan. Hasil pengenceran 10
-4
– 10
-7
ditransfer sebanyak 0,1 ml ke dalam media kultur padat MRSA. Media MRSA ditujukan untuk melihat perlakuan
terhadap respon populasi bakteri asam laktat pada saluran pencernaan. Kultur dalam media agar in vitro menggunakan metode agar tuang ke dalam cawan
petri sebanyak 10 ml. Hasil kultur diinkubasi pada suhu 29
Keterangan: C selama 48 jam.
Parameter yang diukur merupakan populasi total mikroflora berdasarkan jumlah koloni mikroba yang dihasilkan, data disajikan dalam bentuk Log cfuml dengan
menggunakan rumus Bergeys, 2002 sebagai berikut:
PM = Populasi mikroba cfu ml K = Jumlah Koloni
A = Volume inokulasi dalam media pengencer ml B = Pada pengenceran keberapa koloni mikrobanya dihitung
C = Volume inokulasi dari media pengencer ke media padat ml Pengamatan perlakuan terhadap respon persen kematian dilakukan untuk
melihat efektivitas antibiotik terhadap penurunan populasi total mikroflora, dengan rumus sebagai berikut:
Persen kematian mikroflora Jenis dan dosis antibiotik yang paling efektif menurunkan populasi
mikroflora ditetapkan sebagai kontrol negatif pada percobaan kedua.
3.1.4 Analisis Data
Desain percobaan yang digunakan dalam penelitian ini adalah Rancangan Acak Lengkap Faktorial RAL 3x3 dengan 3 ulangan. Faktor A adalah 3 jenis
antibiotik yang terdiri dari A1 = streptomisin, A2 = tetrasklin dan A3 = amphisilin. Faktor B adalah 3 level dosis yang terdiri dari B1 = 100 ppm, B2 =
150 ppm dan B3 = 200 ppm. Perlakuan kontrol digunakan sebagai pembanding pada pakan dengan antibiotik. Adapun model matematika rancangan tersebut
adalah, sebagai berikut:
17
Y
ijk
= µ + α
i
+ β
j
+ αβ
ij
+ ε
Y
ijk
ijk
adalah nilai pengamatan pada faktor A jenis antibiotik taraf ke i, faktor B dosis taraf ke-j dan kelompok ke k. µ,
α
i
, β
j
adalah komponen aditif dari rataan, pengaruh utama jenis antibiotik dan dosis.
αβ
ij
merupakan komponen interaksi dari jenis antibiotik dan dosis.
ε
ijk
adalah pengaruh acak yang menyebar normal 0,σ
ε 2
Data yang diperoleh dianalisis dengan menggunakan sidik ragam ANOVA menggunakan SPSS 13.0 apabila terdapat perbedaan pada perlakuan
akan dilakukan uji lanjut dengan Duncan test. .
3.2 Evaluasi kontribusi mikroflora saluran pencernaan ikan mas terhadap
efisiensi retensi protein dan pertumbuhan
Percobaan kedua, bertujuan untuk mengevaluasi kontribusi mikroflora saluran pencernaan ikan mas terhadap efisiensi retensi protein dan
pertumbuhannya pada pakan yang menggunakan prebiotik komersial dan alami.
3.2.1 Tempat dan Waktu
Penelitian dilakukan di Laboratorium Fisiologi Hewan Air, Fakultas Perikanan, Laboratorium Biokimia, Fisiologi dan Mikrobiologi Nutrisi dan
Laboratorium Ilmu dan Teknologi Pakan Fakultas Peternakan, IPB. Penelitian dilaksanakan selama 3 bulan, mulai bulan Februari 2010 sampai dengan Mei
2010.
3.2.2 Materi a. Hewan uji
Hewan uji yang digunakan berupa ikan mas dengan ukuran berat 15-20 g per ekor. Jumlah ikan yang digunakan sebanyak 80 ekor. Masing-masing
ditempatkan pada aquaria berukuran 50x40x40 cm dan setiap akuarium berisi sebanyak 4 ekor per unit percobaan. Satu unit percobaan mewakili satu ulangan.
b. Pakan uji
Pakan uji untuk mengevaluasi kontribusi mikroflora saluran pencernaan terhadap efisiensi retensi protein dan pertumbuhan terdiri dari 4 perlakuan.
Perlakuan terdiri dari; P1 = pakan + antibiotik tetrasiklin 200 ppm sebagai kontrol negatif, P2 = pakan kontrol tanpa antibiotik maupun prebiotik sebagai
18 kontrol positif, P3 = pakan + 2 Fermacto® prebiotik komersial dari Behn-
Meyer, P4 = pakan + 2 MOS mananolighosakarida prebiotik alami. Tabel 2 Komposisi pakan percobaan untuk evaluasi kontribusi mikroflora
terhadap efisiensi retensi protein dan pertumbuhan BK
Bahan Pakan
P1 P2
P3 P4
T. ikan 15,80
15,80 15,80
15,80 T. udang
14,55 14,55
14,55 14,55
T. kedelai 17,49
17,49 17,49
17,49 T. jagung giling
22,44 22,44
21,44 21,44
Dedak 16,74
16,74 15,74
15,74 Terigu
9,98 9,98
9,98 9,98
Minyak Kedelai 3,00
3,00 3,00
3,00 Antibiotik ppm
200 0,00
0,00 0,00
Fermacto ® 2 2
MOS 2 2
Keterangan: P1 = pakan + antibiotik tetrasiklin 200 ppm, P2 = pakan tanpa antibiotik maupun prebiotik, P3 = pakan + 2 Fermacto ® Marlyn 2007, P4 = pakan + 2 MOS
Gatesoupe et al. 2005
Prebiotik komersial yang digunakan adalah Fermacto ®. Fermacto® terbuat dari substrat terfermentasi oleh strain Aspergillus sp, yang dapat secara
efektif meningkatkan pertumbuhan dan menjaga keseimbangan populasi mikroflora saluran pencernaan. Prebiotik alami yang digunakan merupakan MOS
yang diperoleh dari bungkil inti sawit. Penggunaan prebiotik pada ikan belum banyak dilakukan dan memiliki peluang besar dalam upaya meningkatkan
pertumbuhan. Komposisi pakan dapat diamati pada Tabel 2. Pembuatan pakan uji dilakukan dengan mencampur seluruh bahan pakan hingga homogen.
Pencampuran antibiotik dan prebiotik di campurkan pada akhir proses bersamaan dengan pencampuran minyak sebagai emulsifier. Suhu pelleting yang digunakan
adalah 50-60 Tabel 3 Analisis proksimat pakan uji evaluasi kontribusi mikroflora saluran
pencernaan ikan mas terhadap efisensi retensi protein dan pertumbuhan C. Hasil analisis proksimat pakan uji, dapat diamati pada Tabel 3.
Bahan pakan KA
Abu LK
PK SK
BETN GE
Tanpa prebiotik 6,6
8,7 8,6
26,06 3,8
52,84 3465,3
Berprebiotik 8,06
12,07 8,4
25,98 4,81
48,74 3435
Keterangan: KA = kadar air , LK = lemak kasar , PK = protein kasar , SK = serat kasar , BETN = bahan ekstrak tanpa nitrogen dan GE = gross energy kalkg
19
3.2.3 Prosedur kerja a. Persiapan aquarium dan kualitas air
Hewan uji dipelihara di dalam aquarium dan bagian sisi wadah ditutup dengan terpal berwarna gelap, untuk meminimalisir stress pada ikan yang
diakibatkan oleh lingkungan. Untuk menghindari ikan tidak melompat, dibagian atas aquarium ditutup dengan menggunakan kassa nyamuk, yang sisin-sisinya
dijepit. Sebelum digunakan, wadah dan semua peralatannya didisinfektan terlebih dahulu menggunakan kaporit CaCO
3
. Aquarium diisi air sebanyak 40-45 L dan direndam dengan kaporit 24 jam, kemudian dibilas dengan rendaman air bersih
sebanyak 3 kali dan didiamkan selama 24 jam. Ikan mas dengan bobot rata-rata 15-20g ditebar dengan kepadatan 4 ekor per aquarium 1 unit percobaan.
Sebelum di tebar, ikan diaklimasi terlebih dahulu selama 1 minggu dan diberi pakan pellet, hal ini bertujuan untuk mengadaptasi ikan dengan lingkungan
pemeliharaan. Setelah masa aklimasi selesai ikan uji dipuasakan selama 24 jam dengan tujuan menghilangkan sisa pakan dalam tubuh. Pemberian pakan
dilakukan sebanyak 3 dari berat biomass dengan frekuensi pemberian 2 kali sehari yaitu pukul 8.00 dan 15.00 WIB. Jumlah pakan yang diberikan dan sisa
pakan selama penelitian dicatat untuk mengetahui tingkat konsumsi pakan sebagai dasar dalam menghitung tingkat konsumsi pakan dan efisiensi retensi protein.
Perlakuan terdiri dari 5 ulangan, dengan pengamatan selama 40 hari. Kualitas air yang diamati meliputi, suhu thermometer, pH pH meter, NH
3
b. Analisis proksimat
, dan oksigen terlarut DO meter diukur setiap minggu saat penimbangan bobot biomass.
Analisis proksimat dilakuan pada tubuh ikan sebelum dan setelah diberi perlakuan pada tiap-tiap perlakuan AOAC 1990. Analisis proksimat terdiri atas
protein kasar, lemak kasar, serat kasar abu, bahan ekstrak tanpa nitrogen BETN dan kadar air dari masing-masing bahan antara lain; daging ikan dan pakan uji.
Analisis proksimat bahan pakan dan pakan uji dilakukan pada awal penelitian sedangkan analisis tubuh ikan dilakukan pada awal dan akhir penelitian yang
bertujuan untuk menghitung tingkat retensi protein dan retensi lemak. Sampel pakan uji dan otot ikan uji dianalisis secara kimia sesuai dengan
prosedur yang sudah baku Takeuchi, 1988. Untuk protein kasar dengan metode
20 Kjedahl, lemak kasar dengan metode ekstraksi dengan alat soxhlet, kadar abu
melaui pemanasan sampel dalam tanur pada suhu 400-600 C, kadar serat kasar
dengan metode pelarutan sampel dalam asam dan basa kuat serta pemanasan dan kadar air dengan metode pemanasan dalam oven pada suhu 105-110
c. Perhitungan populasi total mikroflora
C. Analisis proksimat pakan uji dilakukan di awal penelitian sedangkan analisis proksimat
tubuh ikan dilakukan pada awal percobaan diambil 5 ekor ikan yang dipilih secara acak dari stok dan pada akhir percobaan diambil 2 ekor ikan pada tiap perlakuan
dengan 5 ulangan.
Populasi total mikroflora saluran pencernaan ikan mas diamati pada akhir penelitian. Metode yang digunakan untuk memperoleh mikroflora adalah metode
Hungate 1966 yang telah dimodifikasi oleh Nakayama et al. 1993 dan Tae 2003. Kultur mikrob dilakukan dalam suasana aerob. Sumber inokulum
merupakan saluran pencernaan ikan mas, digerus seberat 1 gram, dan diencerkan ke dalam 9 ml NaCl fisiologis 0,85. Pengenceran berseri di lakukan dari 10
-4
sampai 10
-7
, dengan cara mengambil 0,5 ml dari kultur mikroba pada media cair dan dimasukkan ke dalam 4,50 ml media pengencer pertama cairan fisiologis
NaCl 0,85, selanjutnya dari media pengencer pertama diambil 0,5 ml dan dimasukkan ke dalam 4,50 ml media pengencer kedua dan seterusnya hingga
media pengencer terakhir. Homogenisasi dengan vortex selalu dilakukan sebelum rangkaian kegiatan pengenceran dilakukan. Hasil pengenceran terakhir
ditransfer sebanyak 0,1 ml ke dalam media padat MRSA. Penggunaan media MRSA ditujukan untuk melihat respon perlakuan terhadap populasi bakteri asam
laktat pada saluran pencernaan. Kultur dalam media agar in vitro menggunakan metode agar tuang ke dalam cawan petri sebanyak 10 ml. Hasil kultur diinkubasi
pada suhu 29
d. Pengumpulan data
