mengandung indikator fluoresensi yang membantu mendeteksi kedudukan pita yang terpisah sepanjang senyawa yang dipisahkan menyerap UV Hostettmann
dan Marston, 1995. Pita yang kedudukannya telah diketahui dikerok dari pelat dengan
spatula atau pengerok berbentuk tabung yang disambungkan ke pengumpul vakum. Cara terakhir tidak dapat dilakukan untuk senyawa peka karena penjerap
yang mengandung senyawa yang sudah murni terus menerus terkena aliran udara dan resiko otooksidasi selalu ada. Kemudian senyawa harus diekstraksi dari
penjerap dengan pelarut sekitar 5 ml untuk 1 g penjerap. Harus diperhatikan bahwa makin lama senyawa berkontak dengan penjerap makin besar
kemungkinan penguraian Hostettmann dan Marston, 1995.
G. Spektrofotometri Ultraviolet
Teknik spektroskopik adalah salah satu teknik analisis fisiko-kimia yang mengamati tentang interaksi atom atau molekul dengan radiasi elektromagnetik
REM. Spektrofotometri ultraviolet merupakan teknik analisis spektroskopik yang memakai sumber radiasi elektromagnetik ultraviolet dekat 190-380 nm
dengan memakai instrumen spektrofotometer. Dasar dari metode ini adalah interaksi antara radiasi elektromegnetik dengan atom, molekul, atau ion. Interaksi
ini akan menyebabkan eksitasi elektron ke tingkat energi yang lebih tinggi Mulja dan Suharman, 1995. Proses eksitasi ini mengakibatkan terjadinya satu atau lebih
transisi. Transisi-transisi tersebut diklasifikasikan sebagai berikut :
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
1. Transisi elektron n Æ π, meliputi transisi elektron-elektron heteroatom tak
berikatan ke orbital antibonding π dan terjadi pada panjang gelombang yang
panjang dan intensitasnya rendah. Transisi ini menunjukkan pergeseran hipsokromik dalam pelarut-pelarut yang lebih polar dan dengan substituen-
substituen yang bersifat pemberi elektron. 2. Transisi elektron n Æ
σ, terjadi pada senyawa-senyawa jenuh yang mengandung heteroatom seperti oksigen, nitrogen, belerang, atau halogen
3. Transisi elektron π Æ π, terjadi pada elektron di orbital π, yaitu pada ikatan
rangkap dua dan rangkap tiga. Eksitasi ini paling mudah terbaca dan bertanggung jawab terhadap spektra elektronik dalam daerah UV dan tampak
4. Transisi elektron σ Æ σ, terjadi pada elektron yang mempunyai ikatan
tunggal kovalen dan menduduki orbital σ. Tingkat energi yang dibutuhkan
untuk eksitasi ini sangat besar Mulja dan Suharman, 1995; Sastrohamidjojo, 2001.
Spektrum ultraviolet adalah suatu gambar antara panjang gelombang atau frekuensi serapan lawan intensitas serapan transmitasi atau absorbansi.
Kromofor merupakan gugus tak jenuh kovalen yang dapat menyerap radiasi dalam daerah ultraviolet dan terlihat. Contoh kromofor adalah gugus karbonil
keton pada aseton yang memberi serapan maksimum pada 188 nm dengan transisi elektronik
πÆπ dan 279 nm dengan transisi elektron nÆπ. Sedangkan auksokrom merupakan gugus jenuh yang bila terikat pada kromofor
akan mengubah panjang gelombang dan intensitas serapan maksimum. Ciri auksokrom adalah heteroatom yang langsung terikat pada kromofor, misal
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
–OCH
3,
–Cl, –OH dan NH
2
. Terikatnya gugus auksokrom oleh gugus kromofor akan mengakibatkan pergeseran pita absorpsi menuju ke panjang gelombang yang
lebih panjang. Pergeseran ini disebut pergeseran merah atau pergeseran batokromik, yang biasanya disertai dengan peningkatan intensitas serapan efek
hiperkromik. Substitusi atau pengaruh pelarut, selain menyebabkan pergeseran batokromik, juga dapat menyebabkan pergeseran hipsokromik pergeseran biru,
yaitu pergeseran serapan ke arah panjang gelombang yang lebih pendek. Sedangkan efek hipokromik adalah penurunan intensitas serapan Pecsok, 1976;
Mulja dan Suharman, 1995; Sastrohamidjojo, 2001. Panjang gelombang dimana terjadi eksitasi elektronik yang memberikan
absorban maksimum disebut panjang gelombang maksimum. Penentuan panjang gelombang maksimum dapat digunakan untuk mengidentifikasi molekul Mulja
dan Suharman, 1995. Spektrum serapan kandungan tumbuhan dapat diukur dalam larutan yang
sangat encer dengan pembanding blangko pelarut serta menggunakan spektrofotometer yang merekam otomatis. Senyawa tak berwarna diukur pada
panjang gelombang 200-400 nm, senyawa berwarna pada panjang gelombang 200-700 nm. Panjang gelombang serapan maksimum dan minimum pada
spektrum serapan yang diperoleh direkam dalam nm, demikian juga kekuatan absorbansi. Bahan yang diperlukan hanya sedikit saja karena sel spektrofotometri
baku 1x1 cm hanya dapat diisi 3 ml larutan. Pengukuran spektrum yang demikian penting pada identifikasi kandungan tumbuhan, yaitu untuk memantau
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
eluat dari kolom kromatografi sewaktu pemurnian dan untuk mendeteksi golongan senyawa tertentu Harborne, 1987.
Pelarut yang dipakai untuk melarutkan sampel dalam spektrofotometri UV harus memenuhi persyaratan sebagai berikut :
1. tidak mengandung sistem ikatan rangkap terkonjugasi pada struktur
molekulnya dan tidak berwarna 2. tidak terjadi interaksi dengan molekul senyawa yang dianalisis
3. kemurniannya harus tinggi atau derajat untuk analisis Mulja dan Suharman, 1995.
Pelarut yang banyak digunakan untuk spektrofotometri UV adalah etanol 95 karena kebanyakan golongan senyawa larut dalam pelarut tersebut. Dan
sebaiknya alkohol mutlak niaga harus dihindari karena mengandung benzena yang menyerap di daerah UV pendek Harborne, 1987.
Komponen-komponen pokok dari spektrofotometer meliputi : 1 sumber tenaga radiasi yang stabil, 2 sistem yang terdiri atas lensa-lensa, cermin,
celah-celah, dan lain-lain, 3 monokromator untuk mengubah radiasi menjadi komponen-komponen panjang gelombang tunggal, 4 tempat cuplikan yang
transparan, dan 5 detektor radiasi yang dihubungkan dengan sistem meter atau pencatat. Diagram sederhana dari spektrofotometer adalah sebagai berikut:
sumber sel
penyerap detektor
pencatat monokromator
Gambar 2. Diagram spektrofotometer
Sastrohamidjojo, 2001
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
H. Keterangan Empiris
