COOH
H C
O H
OH H
3
CO O
COOH
H C
O O
H
3
CO
+ H
2
warna biru Gambar 8. Mekanisme reaksi aglikon saponin triterpenoid dengan penampak
bercak anisaldehid-asam sulfat Kristianti, 2007
H. Isolasi Aglikon Saponin dengan Metode KLT Preparatif
Ekstrak kloroform kecambah kacang hijau diisolasi secara KLTP untuk mendapatkan jumlah yang cukup banyak untuk analisis aglikon saponin tahap
selanjutnya. Isolasi dilakukan dengan menggunakan fase diam silika gel GF
254
pada pelat kaca 20x20 cm dan fase gerak kloroform – metanol 95:5 vv karena pada literatur yang diperoleh, hanya didapatkan data karakteristik aglikon saponin
pembanding dengan fase diam dan fase gerak tersebut.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Cuplikan yang akan dipisahkan ditotolkan membentuk pita dan dikembangkan 2x. Pengembangan berulang dimaksudkan supaya pemisahan
senyawa semakin baik. Dalam penelitian ini, 2x pengembangan sudah menghasilkan pemisahan yang cukup baik. Hal ini dapat dilihat dari bercak yang
didapat yang terlihat cukup jelas dan tidak terlalu dekat satu sama lain, sehingga lebih mudah dikerok. Bercak yang menunjukkan Rf dan warna yang hampir sama
dengan bercak yang diduga aglikon saponin pada KLT pendahuluan dikerok dengan menggunakan spatula dan dikumpulkan. Hasil kerokan ini dilarutkan
dalam kloroform dan disaring dengan sinterred glass. Filtrat kemudian diuapkan sampai volumenya kira – kira 5 ml. Fase diam yang digunakan pada isolasi ini
sejumlah 5 pelat untuk mendapatkan isolat yang lebih banyak. Jumlah kloroform yang digunakan untuk satu kali penyarian adalah 20 ml supaya hasil kerokan
benar-benar terendam oleh pelarut, dan dilakukan 5x penyarian supaya mendapatkan aglikon saponin dalam jumlah yang cukup banyak. Selanjutnya dari
hasil isolat ini dianalisis untuk uji kemurnian dengan menggunakan metode KLT multi-eluen.
I. Uji Kemurnian dengan Metode KLT multi-eluen
Uji kemurnian ini dilakukan untuk memastikan apakah senyawa yang telah dipisahkan benar-benar murni hasil dari isolasi senyawa yang diinginkan,
dan tidak tercampur dengan senyawa lain. Isolat yang diperoleh diuji kemurniannya dengan 3 macam fase gerak yang berbeda, yaitu kloroform –
metanol 95:5 vv, kloroform – metanol – air 64:50:10 vv, dan n-butanol –
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
etanol – air 7:2:5 vv. Jika isolat tersebut murni maka hanya akan menghasilkan satu bercak. Fase gerak yang dipilih adalah fase gerak yang pernah digunakan
dalam identifikasi beberapa macam aglikon saponin dalam literatur Stahl, 1973; Gasparic, 1978; Wagner, 1999 sehingga diharapkan dapat mengelusi aglikon
saponin dalam sampel. Selain itu, fase gerak juga dipilih berdasarkan tingkat kepolarannya sehingga dapat diketahui benar kemurniannya. Fase gerak
kloroform – metanol 95:5 vv bersifat relatif nonpolar dibandingkan dengan kloroform – metanol – air 64:50:10 vv dan n-butanol – etanol – air 7:2:5 vv.
Masing-masing isolat ditotolkan sejumlah 20 µl, karena jumlah tersebut dapat menghasilkan intensitas warna bercak yang cukup jelas dilihat pada deteksi
dengan sinar UV sehingga mudah dalam identifikasinya.
Tabel II. Hasil uji kemurnian isolat aglikon saponin dengan KLT multi-eluen warna bercak
fase gerak nama
bercak Rf
UV 254 nm anisaldehid-asam sulfat
A 0,59 ungu
biru kloroform – metanol
95:5 vv C 0,59
ungu biru
A 0,92 ungu
biru kloroform – metanol – air
64 : 50 : 10 vv C 0,91
ungu biru
A 0,81 ungu
biru n-butanol – etanol – air
7:2:5 vv C 0,79
ungu biru
Keterangan : A = isolat kecambah kacang hijau sampel
C = isolat Succus Liquiritiae pembanding
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
1 2
Gambar 9. Uji kemurnian dengan KLT multi-eluen dengan fase gerak kloroform – metanol 95:5 vv
Keterangan : A : isolat aglikon saponin kecambah kacang hijau sampel
B : isolat aglikon saponin gabungan Succus Liquiritiae dan kecambah kacang
hijau C : isolat aglikon saponin Succus Liquiritiae pembanding
Deteksi :
1 Dilihat dibawah sinar UV 254 nm 2 Pereaksi anisaldehid-asam sulfat, dipanaskan 110°C selama 5-10 menit,
dilihat dengan sinar tampak
Fase diam : silika gel GF
254
Jarak pengembangan : 10 cm
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
1 2
Gambar 10. Uji kemurnian dengan KLT multi-eluen dengan fase gerak kloroform – metanol – air 64:50:10 vv
Keterangan : A : isolat aglikon saponin kecambah kacang hijau sampel
B : isolat aglikon saponin gabungan Succus Liquiritiae dan kecambah kacang
hijau C : isolat aglikon saponin Succus Liquiritiae pembanding
Deteksi :
1 Dilihat dibawah sinar UV 254 nm 2 Pereaksi anisaldehid-asam sulfat, dipanaskan 110°C selama 5-10 menit,
dilihat dengan sinar tampak Fase diam : silika gel GF
254
Jarak pengembangan : 10 cm
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
1 2
Gambar 11. Uji kemurnian dengan KLT multi-eluen dengan fase gerak n-butanol – etanol – air 7:2:5 vv
Keterangan : A : isolat aglikon saponin kecambah kacang hijau sampel
B : isolat aglikon saponin gabungan Succus Liquiritiae dan kecambah kacang
hijau C : isolat aglikon saponin Succus Liquiritiae pembanding
Deteksi :
1 Dilihat dibawah sinar UV 254 nm 2 Pereaksi anisaldehid-asam sulfat, dipanaskan 110°C selama 5-10 menit,
dilihat dengan sinar tampak Fase diam : silika gel GF
254
Jarak pengembangan : 10 cm
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Dari hasil deteksi menggunakan sinar UV 254 nm menunjukkan adanya peredaman bercak yang berwarna ungu dengan latar belakang berfluoresensi
hijau. Hal ini dikarenakan aglikon saponin memiliki gugus kromofor yang menyerap sinar UV dan tidak memantulkannya kembali, sehingga terjadi
peredaman. Bercak aglikon saponin kecambah kacang hijau dan Succus Liquritiae setelah disemprot dengan pereaksi anisaldehid-asam sulfat tampak menimbulkan
bercak berwarna biru gambar 8. Deteksi dengan pereaksi ini digunakan untuk mengetahui bercak aglikon saponin dan kemungkinan adanya bercak-bercak lain.
Isolat dikatakan sudah murni bila hanya menghasilkan satu bercak saja pada masing-masing komposisi fase gerak.
Pada KLT dengan fase gerak kloroform – metanol 95:5 vv didapatkan bercak tunggal dengan Rf 0,59 baik pada isolat aglikon saponin pada kecambah
kacang hijau maupun Succus Liquiritiae. Dari KLT dengan fase gerak kloroform – metanol – air 64:50:10 vv didapatkan bercak tunggal dengan Rf 0,92 pada
isolat aglikon saponin kecambah kacang hijau dan Rf 0,91 pada isolat aglikon saponin Succus Liquiritiae. Untuk KLT dengan fase gerak n-butanol – etanol – air
7:2:5 vv didapatkan bercak tunggal dengan Rf 0,81 pada isolat aglikon saponin kecambah kacang hijau dan Rf 0,79 pada isolat aglikon saponin Succus
Liquiritiae . Semua bercak pada uji kemurnian ini berwarna ungu pada deteksi
dengan sinar UV 254 nm dan berwarna biru pada deteksi dengan sinar tampak setelah disemprot dengan pereaksi anisaldehid-asam sulfat. Dari hasil
kromatogram yang diperoleh, dapat dilihat bahwa isolat aglikon saponin pada sampel dan pembanding sudah murni dan selanjutnya dapat dilakukan identifikasi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
dengan spektrofotometri UV. Berdasarkan data tersebut juga dapat disimpulkan bahwa sampel kecambah kacang hijau mengandung senyawa yang sama dengan
yang dikandung pembanding Succus Liquiritiae, yaitu saponin golongan triterpenoid. Selain harga Rf dan warna yang mirip, persamaan tersebut juga
didukung dengan hasil KLT pada totolan gabungan antara sampel dan pembanding yang menghasilkan satu bercak saja dan sama dengan bercak sampel
dan pembanding gambar 9, 10, dan 11.
J. Spektrofotometri Ultra Violet UV
