Bahan Penelitian Bahan penelitian yang digunakan adalah Alat Penelitian Prosedur Penelitian

4.5 Metode Penatalaksanaan Penelitian

4.5.1 Bahan Penelitian Bahan penelitian yang digunakan adalah

1. Kitosan Tachypleus gigas hasil penelitian Harry A, 2005 2. Batang kemuning Murraya paniculata L Jack yang diambil dari daerah Patumbak di Medan, Sumatera Utara, Indonesia 3. Etanol 80 sebanyak 6 liter Kimia Farma, Indonesia 4. Larutan asam asetat 1 sebanyak 2 liter Kimia Farma, Indonesia 5. Akuades 1 liter Kimia Farma, Indonesia 6. F.nucleatum ATCC 25586 7. Media BHI Brain Heart Infusion Agar

4.5.2 Alat Penelitian

Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah 1. Timbangan Home Line, China 2. Timbangan analitik Vibra, Japan 3. Kertas perkamen 2 kajang 4. Blender Panasonic, Japan 5. Kapas 250 gram Bio Panca, Indonesia 6. Kertas saring Whatman no.42, England 7. Aluminium foil 1 gulungan Total Wrap, Indonesia 8. Perkolator 9. Erlenmeyer Pyrex, USA 10. Vaccum rotavapor Stuart, 2010 11. Electronic balance Ohyo JP2 6000, Japan dan Denver Instrument Company, USA 12. Autoklaf Tomy, Japan 13. Vortex Iwaki model TM-100, Japan 14. Inkubator CO 2 Sanyo, Japan 15. Pipit mikro Gilson, France Universitas Sumatera Utara 16. Piring petri Pyrex, Japan 17. Ose dan spiritus 18. Kaca pembesar Ootsuka ENV-CL, Japan Gambar 4. Autoklaf Gambar 5. Timbangan analitik Gambar 6. Vortexer Gambar 7. Inkubator CO 2 Universitas Sumatera Utara Gambar 8. Timbangan Gambar 9. Blender Gambar 10. Rotary Evaporator

4.5.3 Prosedur Penelitian

4.5.3.1 Pembuatan ekstrak batang kemuning Murraya paniculata L

Jack Proses pembuatan ekstrak batang kemuning Murraya paniculata L Jack dilakukan berdasarkan Standart Operasional Prosedur Laboratorium Fitokimia Fakultas Farmasi USU dengan langkah-langkah sebagai berikut: a. Pembuatan simplisia Batang kemuning Murraya paniculata L Jack diambil dan ditimbang sebanyak 1 kg Gambar 11, kemudian dikeringkan di dalam lemari pengering dengan suhu 40 o C Gambar 12. Batang dikatakan sudah kering apabila diremas akan Universitas Sumatera Utara mudah hancur. Selanjutnya batang kemuning yang telah kering tersebut dihaluskan dengan blender dan disaring Gambar 13 14 dan didapat serbuk simplisia Gambar 15. b. Proses perkolasi Siapkan 500 gram serbuk simplisia Gambar 16 dan dimasukkan ke dalam bejana tertutup, kemudian dituang etanol 80 Gambar 17 sampai semua simplisia terendam sempurna dan dibiarkan sekurang-kurangnya 3 jam Gambar 18. Kemudian massa simplisia yang telah direndam tersebut dipindahkan sedikit demi sedikit ke dalam perkolator Gambar 19 dengan hati-hati sambil sesekali ditekan dan di atasnya dilapisi selapis kertas saring. Kemudian etanol dituangkan secukupnya ke dalam perkolator sampai cairan mulai menetes dan di atas simplisia masih terdapat selapis cairan penyaring. Selanjutnya, perkolator ditutup dan dibiarkan selama 24 jam. Setelah 24 jam, perkolator dibuka kembali dan cairan dibiarkan menetes dengan kecepatan 1 ml per menit atau 20 tetes per menit Gambar 20. Tambahkan etanol secukupnya dengan berulang-ulang sehingga selalu terdapat selapis cairan penyari di atas simplisia, hingga diperoleh ekstrak Depkes RI, 1979. Perkolat yang telah didapat Gambar 21 dipekatkan dengan alat rotary evaporator Gambar 22 dan dikeringbekukan dengan menggunakan freeze dryer. Gambar 11. Batang kemuning Gambar 12. Dikeringkan di lemari Universitas Sumatera Utara Gambar 13. Batang diblender Gambar 14. Simplisia disaring Gambar 15. Serbuk simplisia Gambar 16. Timbang 500gram Gambar 17. Tuang etanol 80 Gambar 18. Proses maserasi Universitas Sumatera Utara Gambar 19. Masukkan ke perkolator Gambar 20. Proses penetesan Gambar 21. Dipekatkan dengan Gambar 22. ekstrak kemuning Rotary evaporator didapat Gambar 23. Ekstrak cair kemuning Gambar 24. Ekstrak kental didapat dan di keringkan di waterbath disimpan dalam lemari pendingin Universitas Sumatera Utara

4.5.3.2 Pengenceran Bahan Coba

Ekstrak batang kemuning Murraya paniculata L Jack dalam etanol ditimbang menggunakan electronic balance dan massanya disesuaikan dengan konsentrasi yang diinginkan dengan cara dilarutkan. Untuk penyiapan bahan coba kitosan dengan konsentrasi yang diinginkan konsentrasi 5 dapat dilakukan dengan cara menimbang 0.5 gram kitosan dan dicampurkan ke dalam 10 ml asam asetat 1. Setelah itu, divorteks sampai semua bubuk kitosan dan larutan asam asetat tercampur, maka larutan yang didapat memiliki viskositas yang sangat tinggi dan berupa gel.

4.5.3.3 Pencampuran Bahan Coba

Untuk penyiapan bahan coba kitosan, timbang 0.5 gram kitosan dan campurkan ke dalam 10 ml asam asetat 1. Setelah itu, divorteks sampai semua bubuk kitosan dan larutan asam asetat tercampur, maka larutan yang didapat memiliki viskositas yang sangat tinggi. Untuk penyiapan bahan coba ekstrak batang kemuning, timbang 2 gram ekstrak kental dan campurkan ke dalam 10 ml DMSO. Setelah itu, divorteks hingga larutan tercampur. Selanjutnya, pada konsentrasi kitosan 1 diperlukan 1,6 ml larutan kitosan, pada konsentrasi kitosan 0.6 diperlukan 0.96 ml larutan kitosan, pada konsentrasi kitosan 0.4 diperlukan 0.64 ml larutan kitosan, dan pada konsentrasi kitosan 0.2 diperlukan 0.32 ml larutan kitosan. Untuk konsentrasi ekstrak batang kemuning 7.5 diperlukan 3 ml bahan coba, konsentrasi ekstrak batang kemuning 5 diperlukan 2 ml bahan coba, konsentrasi ekstrak batang kemuning 2.5 diperlukan 1 ml bahan coba, dan konsentrasi ekstrak batang kemuning 1 diperlukan 0.4 ml bahan coba. Pada setiap konsentrasi, volume yang akan disiapkan sebesar 8 ml. Sehingga pada setiap konsentrasi bahan coba kitosan dan batang kemuning akan ditambahkan BHI broth hingga volume total 8 ml. Tujuan ditambahkan BHI broth ke dalam bahan coba supaya bahan coba dapat menempel di agar. Universitas Sumatera Utara

4.5.3.4 Pembuatan Media Bakteri

Sebelum spesimen dibiakkan, terlebih dahulu dibuat media Brain Heart Infusion BHI, sebanyak 37 gram BHI dilarutkan dalam 1000 ml akuades kemudian dituangkan ke dalam 50 petri 20mlpetri lalu media disterilkan dalam autoklaf selama 3 jam dan suhu 27 o C. Setelah disterilkan, media sedikit didinginkan menggunakan alat. Setelah media tidak terlalu panas, media dapat dituang ke dalam masing –masing petri dan dibiarkan hingga dingin.

4.5.3.5 Pembiakan Spesimen

F.nucleatum yang digunakan adalah spesimen stem sel F.nucleatum ATCC 25586 yang dibiakkan secara murni pada media BHI dalam suasana anaerob hingga didapatkan pertumbuhan yang sehat yang berarti bahwa bakteri tumbuh subur. Ambil beberapa koloni bakteri dengan ose steril lalu diencerkan dengan larutan NaCl 0,9 hingga konsentrasi 10 8 CFUml atau setara dengan 0.5 Mc Farland.

4.5.3.6 Inkubasi bakteri dan bahan coba

Konsentrasi bakteri yang digunakan 10 4 dan 10 8 yang masing –masing berisi bahan coba tiap konsentrasi diinkubasi dalam inkubator selama 3 jam dan 6 jam. Pemilihan waktu inkubasi selama 3 jam dan 6 jam adalah berdasarkan kurva pertumbuhan bakteri dimana bakteri berada dalam fasa log yang berjenjang dari 3-15 jam. Setelah diinkubasi masing-masing selama 3 jam dan 6 jam, dilakukan plating pada tiap petri yang sudah diberi label di atas BHI agar kemudian diinkubasi dalam inkubator selama 24 jam.

4.5.3.7 Penentuan Efek Antibakteri dengan Menggunakan Metode Cakram

Siapkan setiap konsentrasi kitosan blangkas molekul tinggi sebagai perancah dengan ekstrak batang kemuning. Selanjutnya, siapkan bakteri yang telah dikultur. Pada plate yang telah diisi agar diberi label dari masing-masing konsentrasi bahan Universitas Sumatera Utara coba, kemudian teteskan bakteri yang telah dikultur ke atas agar, lalu diose. Pada tahap selanjutnya, letakkan 3 tiga buah cakram di atas agar, kemudian dari masing- masing konsentrasi bahan coba ditetesi ke atas cakram 10µlcakram. Masukkan seluruh petri ke dalam tabung anaerob dan diberikan gas minus oksigen agar didapati suasana anaerob. Selanjutnya, tabung dimasukkan ke dalam inkubator, diamkan selama 24 jam. Kemudian amati perubahan kekeruhan yang terjadi. Tabung dengan kekeruhan yang mulai tampak jernih untuk setiap kelompok perlakuan merupakan konsentrasi minimal ekstrak yang memiliki efek antibakteri terhadap pertumbuhan F.nucleatum dalam media pembenihan setelah diinkubasi 24 jam dan diamati secara visual.

4.5.3.8 Penentuan Efek Antibakteri dengan Menggunakan Metode

Hitung Koloni Bakteri Penentuan efek antibakteri bahan coba dilakukan dengan melakukan penghitungan jumlah koloni menggunakan metode dilusi yaitu setiap konsentrasi kitosan blangkas molekul tinggi sebagai perancah dengan ekstrak batang kemuning setelah diinkubasi selama 3 jam dan 6 jam, bahan coba pada setiap konsentrasi di vortex dan diambil 10 l dengan mikropipet untuk tiap konsentrasi lalu diteteskan ke dalam BHI agar, dilakukan 2 kali replikasi. Selanjutnya diinkubasi dalam inkubator CO 2 dengan suhu 37 o C selama 24 jam. Jumlah koloni bakteri dihitung dengan prinsip satu sel bakteri hidup bila dibiakkan pada media padat akan tumbuh menjadi satu koloni bakteri. Apabila bentuk koloni melebar dianggap berasal dari satu koloni, bila bentuknya dua koloni bersinggungan dianggap sebagai dua koloni. Setelah dihitung jumlah koloni bakteri pada masing-masing tetesan, dikalikan dengan faktor pengenceran dan faktor pengali. Oleh karena pada penelitian konsentrasi yang dilakukan perhitungan jumlah koloni bakteri merupakan konsentrasi awal sebelum dilakukan dilusi maka faktor pengenceran x 1. Selain itu karena pada penetesan suspensi bahan coba dan bakteri pada media padat sebanyak 50 l, maka hasil perhitungan harus dikali dengan faktor pengali 20 untuk mendapatkan hasil standar CFUml. Universitas Sumatera Utara

BAB 5 HASIL PENELITIAN

5.1 Ekstrak Kental Batang Kemuning