fermentasi 10 ml. lalu diinkubasi selama 18 jam pada suhu 55 C. Adapun
komposisi dari media fermentasi tercantum dalam Lampiran 1.
2. Pembuatan Koloidal Kitin Arnold dan Solomon, 1986.
Koloidal kitin dibuat dengan melarutkan 5 gram kitin komersial dalam 80 mL HCl pekat, kemudian larutan tersebut diaduk dalam gelas
beker memakai stirer hingga merata. Larutan tersebut diinkubasi pada suhu 4
C selama 24 jam. Kemudian disaring mengunakan glass wool. Filtrat yang diperoleh ditambah dengan 200 mL aquades dingin, ditambah
NaOH 12 N hingga pH filtrat mencapai pH 7. Filtrat tersebut kemudian disentrifugasi selama 15 menit dengan kecepatan 7.500 rpm. Supernatan
dibuang sedangkan endapannya merupakan koloidal kitin, seperti yang terlihat dalam Lampiran 2.
3. Pembuatan Glikol Kitin Truddel dan Asselin, 1989
Glikol kitin dibuat dengan cara asetilasi kitosan. Glikol kitin sebanyak 1 gram dilarutkan dalam asam asetat 10 dan dibiarkan dalam
suhu ruang selama 24 jam. Kemudian campuran tersebut ditambah 100 ml metanol secara perlahan di dalam ruang asam, lalu disaring vakum dengan
kertas saring whatman no 42. Filtrat yang dihasilkan ditampung di dalam gelas piala dan ditambah 1.5 ml asetat anhidrida sambil distirer pelan. Lalu
dibiarkan pada suhu kamar ± 30 menit, saat terbentuk gel + 150 ml metanol dan dihomogenkan. Sentrifugasi pada 7000 rpm, 4
C selama 15 menit. Pelet ditambahkan 100 - 150 ml metanol dan dihomogenkan lagi.
Kemudian tahap sentrifugasi diulangi sekali lagi. Pelet ditambahkan 100 ml 0.02 sodium azide dan dihomogenkan lagi selama 4 menit. Larutan
gel yang terbentuk adalah 1 glikol kitin. Untuk lebih jelasnya, diagram alir disajikan pada Lampiran 3.
4. Pembuatan Kurva Standar Glukosamin modifikasi Azis, 2002
Glukosamin komersial sebanyak 100 mg dilarutkan dalam akuades hingga volume 100 ml. Larutan yang diperoleh konsentrasi akhirnya
adalah 1 mgml glukosamin. Tabel 2 memperlihatkan komposisi larutan standar glukosamin.
Tabel 3. Komposisi Larutan Standar Glukosamin Glukosamin µg
Penambahan akuades Konsentrasi
glukosamin µgml hingga volume 1 ml
10 hingga volume 1 ml
10 20
hingga volume 1 ml 20
40 hingga volume 1 ml
40 70
hingga volume 1 ml 70
90 hingga volume 1 ml
90 Larutan standar sebanyak 200 µl dimasukkan kedalam tabung reaksi
dan ditambahkan 200 µl asam asetat 33 dan 200 µl NaNO
2
5. Kemudian larutan divortek dan dibiarkan selama 10 menit. Larutan
selanjutnya ditambahkan 200 µl amonium sulfamat 12.5 , kemudian digoyang pelan selama 30 menit. Selanjutnya ditambahkan 800 µl HCl 5
dan 80 µl 1 indol dalam etanol harus segar. Larutan selanjutnya dipanaskan 100
C selama 5 menit, kemudian dibiarkan sampai suhu menurun. Larutan ditambahkan alkohol 800 µl dan divortek. Untuk
kemudian diukur serapannya pada spektrofotometer pada panjang gelombang 492 nm. Nilai yang diperoleh dibuat grafik dengan nilai y
nilai absorbansi dan x konsentrasi glukosamin.
5. Pembuatan Larutan Bradford Bradford, 1976
Coomassie Brilliant Blue G-250 CBB G-250 sebanyak 100 mg
dilarutkan dalam 50 ml etanol 95 dan ditambah 100 ml asam fosfat 85. Akuades selanjutnya ditambahkan hingga mencapai 1000 ml, kemudian
larutan disaring menggunakan kertas saring. Larutan yang diperoleh merupakan larutan stok Bradford dan bila akan digunakan harus
diencerkan terlebih dahulu mengunakan akuades dengan perbandingan 1 : 4 vv.
6. Pembuatan Kurva Standar Protein Bradford, 1976
100 mg Bovine Serum Albumin BSA dilarutkan dalam 50 ml akuades kemudian ditambahkan NaOH 0,1 N 1 tetes. Larutan dikocok
secara perlahan dan jangan sampai berbusa. Setelah homogen ditambah akuades hingga volume 1000 ml. Konsentrasi akhir larutan standar adalah
1 mgml BSA. Komposisi larutan standar protein disajikan dalam Tabel 3. Tabel 4. Komposisi Larutan Standar Protein
BSA Penambahan akuades
Konsentrasi protein
hingga volume 1000 µl 100
hingga volume 1000 µl 100
200 hingga volume 1000 µl
200 300
hingga volume 1000 µl 300
400 hingga volume 1000 µl
400 500
hingga volume 1000 µl 500
Larutan standar sebanyak 40 µl dimasukkan dalam tabung reaksi dan ditambahkan larutan bradford sebanyak 2 ml. Larutan divortek dan
dibiarkan selama 5 menit. Larutan kemudian diukur serapannya pada spektrofotometer dengan panjang gelombang 595 nm. Blanko
diperlakukan seperti sampel namun larutan standar diganti dengan akuades. Nilai yang diperoleh dibuat grafik dengan persamaan Y= ax + b,
dimana Y adalah nilai absorbansi dan x adalah nilai konsentrasi protein.
7. Pengukuran Aktivitas Enzim Kitin Deasetilase modifikasi Tokuyasu et al., 1996
