C. METODE PENELITIAN
Regenerasi Isolat Bacillus sp. PT2-3
Pembuatan glikol kitin Produksi enzim
Pembuatan koloidal kitin Pembuatan starter
Analisa Karakterisasi enzim Ultrafiltrasi
Sentrifugasi 9000 rpm, 4 C, 15 menit.
pH Optimum Suhu Optimum
Stabilitas panas Pengaruh penambahan ion logam
Gambar 5. Diagram alir metode penelitian.
1. Tahap Pembuatan Starter
Isolat PT2-3 pada media agar Lampiran 1 yang telah dikeluarkan dalam lemari pendingin, dibiarkan dalam suhu kamar. Diambil satu ose
untuk diinokulasikan pada erlenmeyer 100 ml yang berisi media
fermentasi 10 ml. lalu diinkubasi selama 18 jam pada suhu 55 C. Adapun
komposisi dari media fermentasi tercantum dalam Lampiran 1.
2. Pembuatan Koloidal Kitin Arnold dan Solomon, 1986.
Koloidal kitin dibuat dengan melarutkan 5 gram kitin komersial dalam 80 mL HCl pekat, kemudian larutan tersebut diaduk dalam gelas
beker memakai stirer hingga merata. Larutan tersebut diinkubasi pada suhu 4
C selama 24 jam. Kemudian disaring mengunakan glass wool. Filtrat yang diperoleh ditambah dengan 200 mL aquades dingin, ditambah
NaOH 12 N hingga pH filtrat mencapai pH 7. Filtrat tersebut kemudian disentrifugasi selama 15 menit dengan kecepatan 7.500 rpm. Supernatan
dibuang sedangkan endapannya merupakan koloidal kitin, seperti yang terlihat dalam Lampiran 2.
3. Pembuatan Glikol Kitin Truddel dan Asselin, 1989
Glikol kitin dibuat dengan cara asetilasi kitosan. Glikol kitin sebanyak 1 gram dilarutkan dalam asam asetat 10 dan dibiarkan dalam
suhu ruang selama 24 jam. Kemudian campuran tersebut ditambah 100 ml metanol secara perlahan di dalam ruang asam, lalu disaring vakum dengan
kertas saring whatman no 42. Filtrat yang dihasilkan ditampung di dalam gelas piala dan ditambah 1.5 ml asetat anhidrida sambil distirer pelan. Lalu
dibiarkan pada suhu kamar ± 30 menit, saat terbentuk gel + 150 ml metanol dan dihomogenkan. Sentrifugasi pada 7000 rpm, 4
C selama 15 menit. Pelet ditambahkan 100 - 150 ml metanol dan dihomogenkan lagi.
Kemudian tahap sentrifugasi diulangi sekali lagi. Pelet ditambahkan 100 ml 0.02 sodium azide dan dihomogenkan lagi selama 4 menit. Larutan
gel yang terbentuk adalah 1 glikol kitin. Untuk lebih jelasnya, diagram alir disajikan pada Lampiran 3.
4. Pembuatan Kurva Standar Glukosamin modifikasi Azis, 2002
Kategori