8. Pengukuran Konsentrasi Protein Bradford, 1976
Pengukuran konsentrasi sampel dilakukan dengan cara mereaksikan 40 µl larutan sampel enzim dengan larutan bradford sebanyak 2 ml. Lalu
diukur absorbansinya dengan spektrofotometer pada gelombang 595 nm. Nilai absorbansi kemudian dimasukkan ke dalam kurva standar untuk
menentukan konsentrasi protein yang terkandung dalam sampel enzim. 9. Karakterisasi Enzim Kitin Deasetilase
a. Persiapan Preparat Enzim
Inokulum sebanyak 10, dimasukkan ke dalam media produksi 100 ml dalam erlenmeyer 1000 ml, fermentasi dilakukan
pada inkubator goyang dengan kecepatan 150 rpm pada suhu 55 C.
Enzim kitin deasetilase dipanen jam ke-18. Sampel yang diperoleh kemudian disentrifugasi pada. 9000 rpm, 15 menit pada suhu 4
C. Kemudian dilakukan karakterisasi.
b. Penentuan pH Optimum Aktivitas Enzim
Enzim kitin deasetilase diuji aktivitasnya pada pH 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0 dan 11.0. Buffer yang digunakan untuk pengujian
aktivitas pada pH 5.0 adalah buffer sitrat-phospat 0.05 M, buffer phospat 0.05 M digunakan pengujian pada pH 6.0, 7.0 dan 8.0
digunakan, sedangkan untuk pH 9.0, 10.0 dan 11.0 digunakan buffer glycine-NaOH 0.05 M Lampiran 7, 8 dan 9. Pengujian pH optimum
ini dilakukan pada suhu pertumbuhannya 55 C. Dari pengujian ini
akan didapatkan nilai pH yang ditunjukkan pada nilai aktivitas enzim kitin deasetilase tertinggi.
c. Penentuan Temperatur Optimum Enzim
Enzim kitin deasetilase, substrat glikol kitin dan buffer pH pada pH optimum yang didapatkan dari hasil pengujian pH
optimum, di inkubasi pada kisaran suhu 40 C, 50
C, 60 C dan 70
C sehingga akan didapatkan temperatur optimum dimana enzim kitin
deasetilase memiliki aktivitas spesifik tertinggi.
d. Ketahanan Enzim Terhadap Pengaruh Panas
Enzim kitin deasetilase dilakukan pemanasan pada suhu 60 C
dan 70 C selama 180 menit. Pengambilan sampel dilakukan setiap 30
menit sekali, kemudian dilakukan pengujian aktivitasnya. Ketahanan enzim terhadap pengaruh panas dinyatakan dalam persentase
aktifitas relatif.
e. Pengaruh Penambahan Ion Logam Terhadap Aktivitas Enzim
Uji pengaruh penambahan senyawa logam terhadap enzim dilakukan dengan menambahkan 2 mM dan 5 mM CaCl
2
.2H
2
O; ZnCl
2
; MgCl
2
.6H
2
O; MnCl
2
.4H
2
O; FeSO
4
.7H
2
O pada larutan enzim- substrat-buffer, kemudian enzim di inkubasi pada suhu dan pH
optimumnya. Dari uji ini akan didapatkan berbagai ion logam yang berperan sebagai penghambat inhibitor ataupun aktivator. Dalam hal
ini, pengaruh penambahan ion logam dinyatakan dalam persentase aktivitas relatif enzim.
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
A. PRODUKSI ENZIM
Enzim kitin deasetilase didapatkan dengan cara fermentasi cair substrat koloidal kitin pada medium fermentasi Lampiran 1 dengan Bacillus sp. PT2-
3 sebagai mikroorganisme termofilik penghasil enzim termostabil tersebut. Umumnya, enzim pendegradasi kitin diproduksi secara ekstraselular.
Fermentasi dilakukan selama 18 jam dalam shaker dengan kecepatan putar 150 rpm pada suhu 55
C. Setelah jam ke-18 yang merupakan waktu pemanenan enzim maka akan didapatkan ekstrak kasar enzim. Enzim ini
dikeluarkan oleh sel dan berada pada medium, enzimpun dapat terjebak dalam sel sehingga aktivitasnya dapat menurun. kemudian dilakukan sentrifugasi
untuk memisahkan antara padatan dan cairan. Pada umumnya, pemisahan suspensi makromolekul dari suatu larutan adalah dengan cara melakukan
sentrifugasi dan filtrasi. Mengingat enzim ini bersifat mudah terdegradasi maka proses sentrifugasi
ekstrak kasar enzim tersebut dilakukan pada suhu rendah yakni 4 C. Hal ini
dilakukan karena bertujuan untuk menjaga dan meminimalisasi enzim tersebut dari kehilangan aktivitasnya.
0.00 0.10
0.20 0.30
0.40 0.50
0.60 0.70
0.80
6 12
18 24
30 36
42 48
Waktu jam Akt
ivi ta
s S p
esi fi
k
U m
g pr ot
ei n
sumber : Aziz, 2002
Gambar 6. Grafik Aktivitas Spesifik Kitin Deasetilase Bacillus sp. PT2-3, selama Fermentasi 48 jam.
Kategori