Isolasi Bacillus Sp. Penghasil Bakteriosin Dan Peningkatan Aktivitasnya Sebagai Penghambat Vibrio Harveyi

i

ISOLASI Bacillus sp. PENGHASIL BAKTERIOSIN DAN
PENINGKATAN AKTIVITASNYA SEBAGAI PENGHAMBAT
Vibrio harveyi

ASAHEDI UMORO

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul “Isolasi Bacillus
sp. Penghasil Bakteriosin dan Peningkatan Aktivitasnya sebagai
Penghambat Vibrio harveyi” adalah benar karya saya dengan arahan dari
komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada
perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari
karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah

disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian
akhir ditesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada
Institut Pertanian Bogor.
Bogor, Januari 2016
Asahedi Umoro

P051120111

ii

RINGKASAN
ASAHEDI UMORO. Isolasi Bacillus sp. Penghasil Bakteriosin dan Peningkatan
Aktivitasnya sebagai Penghambat Vibrio harveyi. Dibimbing oleh NISA
RACHMANIA MUBARIK dan WIDANARNI.
Udang merupakan salah satu komoditas unggulan perikanan budidaya,
dengan permintaan dunia yang terus mengalami peningkatan. Tantangan terbesar
bagi pembudidaya udang saat ini ialah serangan penyakit. Salah satu penyakit
penyebab kegagalan panen dalam budidaya udang ialah serangan vibriosis yang
disebabkan oleh bakteri Vibrio harveyi. Serangan bakteri patogen Vibrio harveyi

ini dapat berakibat terhadap penurunan produksi udang dan kerugian ekonomi
bagi pembudidaya udang. Aplikasi Bacillus sp. dapat digunakan sebagai alternatif
solusi untuk mengontrol pertumbuhan bakteri patogen pada budidaya udang,
karena bakteri Bacillus sp. dapat diaplikasikan sebagai probiotik dan biokotrol
yang menghasilkan senyawa antimikrob polipeptida seperti bakteriosin yang dapat
menghambat pertumbuhan bakteri patogen.
Bakteriosin merupakan senyawa antimikrob polipeptida yang disintesis di
ribosom. Proses sintesis bakteriosin berlangsung selama masa pertumbuhan sel
dan mengikuti pola sintesis protein. Umumnya bakteriosin hanya menghambat
galur-galur yang berkerabatan dekat dengan bakteri penghasil bakteriosin. Hampir
seluruh patogen yang ada dibudidaya perikanan merupakan bakteri gram negatif
sehingga galur Bacillus sp. penghasil bakteriosin terpilih harus mampu
menghasilkan bakteriosin dengan kemampuan spektrum penghambatannya yang
luas sehingga mampu menghambat bakteri Vibrio harveyi yang termasuk patogen
Gram negatif.
Tujuan dari penelitian ini ialah mengisolasi Bacillus sp. penghasil
bakteriosin asal tambak udang, Pangandaran, Jawa Barat dan melakukan
peningkatan aktivitas penghambatannya terhadap Vibrio harveyi. Metode
penelitian yang dilakukan antara lain: 1) isolasi Bacillus sp. dilakukan dengan
pemanasan pada suhu ± 800 C selama 15 menit untuk memberi peluang

tertapisnya Bacillus sp.; 2) seleksi isolat Bacillus sp. yang mempunyai
kemampuan antimikrob dilakukan dengan menggunakan metode doube layer dan
uji aktivitas penghambat bakteriosin dilakukan dengan menggunakan kertas
cakram pada media SWC (Sea Water Complete) padat yang berisi bakteri uji
Vibrio harveyi; 3) isolat Bacillus sp. terpilih dilakukan identifikasi 16S rRNA,
karakteristik morfologi sel, pewarnaan Gram dan endospora; 4) pengendapan
protein dilakukan dengan menggunakan amonium sulfat bertingkat 30-80%; 5)
perhitungan kadar protein dilakukan dengan menggunakan metode Bradford dan
perhitungan bobot molekul dengan metode SDS PAGE; dan 6) dilakukan penguji
aktivitas penghambatan bakteriosin dan uji kompetisi Bacillus sp. terhadap Vibrio
harveyi pada media tumbuh SWC cair.
Dari hasil isolasi sampel sedimen lumpur dan air tambak udang didapatkan
22 isolat Bacillus sp. yang memiliki aktivitas penghambatan dan dipilih lima
isolat potensial dengan aktivitas penghambatan tertinggi yang diduga sebagai
penghasil bakteriosin, yaitu: LTP 1, LTP 4, LTP 6, LTP 14, dan ATP 2. Lima

isolat tersebut kemudian diuji aktivitas penghambatan bakteriosinnya. Isolat LTP
1 merupakan isolat dengan aktivitas antimikrob terbesar dan dipilih untuk analisis
16S rRNA, produksi bakteriosin pada media pertumbuhan, dan uji antagonis
penghambatan terhadap Vibrio harveyi.

Isolat Bacillus LTP 1 telah diidentifikasi sebagai Bacillus subtillis dengan
tingkat kesamaaan 96%. Produksi antimikrob bakteriosin isolat LTP 1 terjadi
selama fase pertumbuhan dengan aktivitas maksimal antimikrob bakteriosin
terjadi pada fase stasioner dengan besar zona hambat 16 mm. Penurunan aktivitas
antimikrob bakteriosin terjadi setelah dilakukan perlakuan dengan enzim
proteinase K. Pengendapan bakteriosin dengan amonium sulfat 70% memiliki
aktivitas penghambatan terbesar dengan indeks penghambatan 2,7 dengan
aktivitas unit penghambatan 2490 mm2/ml. Isolat LTP 1 dapat digunakan sebagai
penghasil bakteriosin yang potensial dan menghambat Vibrio harveyi.
Kata kunci: Bacillus sp., bakteriosin, antimikrob, Vibrio harveyi, udang

iv

SUMMARY
ASAHEDI UMORO. Isolation of Bacillus sp. Producing Bacteriocin and
Enhancement The Inhibitors Activity toward Vibrio harveyi. Supervised by NISA
RACHMANIA MUBARIK dan WIDANARNI.
Shrimp is one of the leading commodity aquaculture with increases in
global demand. Shirmp disease is the biggest challenges for shrimp farmers. One
of the bacterial disease pathogens cause failures culture in shrimp farming is

vibriosis which caused by the Vibrio harveyi. The presence of pathogenic bacteria
Vibrio harveyi in shirmp culture cause a decreasing in shrimp production.
Applications Bacillus sp. can be used as an alternative solution to control the
growth of pathogenic bacteria in shrimp farming. Bacillus sp. can be applied as
probiotic and biocontrol that produce antimicrobial compounds such as
bacteriocins that can inhibit the growth of pathogenic bacteria.
Bacteriocin is a polypeptide antimicrobial compounds produced in
ribosomes. Process of bacteriocins synthesis during the period growth of bacteria
follows the pattern of protein synthesis. Generally bacteriocin only inhibit closely
related strains with bacterial producing bacteriocin. While almost all pathogens in
the aquaculture is a Gram-negative bacteria so that strains of Bacillus sp. selected
should be able to produce bacteriocins with a broad inhibitory spectrum
capabilities to inhibit Vibrio harveyi including Gram-negative bacteria.
The aim of study was to isolate bacteriocin producing Bacillus sp. from
shrimp farms, Pangandaran, West Java and examined its inhibitory activity toward
Vibrio harveyi. The methods used in this research were: 1) isolation of Bacillus
sp. which performed by heating at 800 C for 15 minutes to give the opportunity
selected Bacillus sp.; 2) antimicrobial activity of selected Bacillus sp. was
determined using double layer method and test the inhibitory activity of
bacteriocins by using paper disc at SWC (Sea Water Complete) solid media

containing test bacteria Vibrio harveyi; 3) identification of selected Bacillus sp. by
16S rRNA, cell morphology characterized based on Gram staining and endospore
staining; 4) protein precipitation by using ammonium sulfate 30-80%; 5)
measurement of the protein content by using Bradford method and calculation
molecular weight using SDS PAGE; 6) testing inhibitory activity of bacteriocins
and competition test Bacillus sp. against Vibrio harveyi at SWC liquid medium.
From sediment and water from shrimp farms were obtained 22 isolates of
Bacillus which had inhibitory activity and them selected five potential isolates
with the highest inhibitory activity and suggested as bacteriocins producing which
were: LTP 1, LTP 4, LTP 6, LTP 14, and ATP 2. The five isolates were then
tested the inhibitory activity of bacteriocins. The LTP 1 isolate has the biggest
antimicrobial activity and selected to test further. The LTP 1 isolate was identified
as Bacillus subtilis with the similarity level 96%. Production of bacteriocins
antimicrobial from isolate LTP 1 occured during the stationary phase with a large
zone of inhibition is 16 mm. A reduction in antimicrobial activity was recorded
after treatment of bacteriocins with proteolitic enzyme using proteinase K. The
70% ammonium sulfate bacteriocin precipitated is the highest inhibitory of

activity with index inhibitory 2,7 and inhibition activity 2490 mm2/ml. The LTP 1
isolate could be used as bacteriocin producer and also could inhibit growth of

Vibrio harveyi.
.
Keywords: Bacillus sp., bacteriocins, antimicrobial, Vibrio harveyi, shrimp

vi

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2016
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang

Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

ISOLASI Bacillus sp. PENGHASIL BAKTERIOSIN
DAN PENINGKATAN AKTIVITASNYA SEBAGAI
PENGHAMBAT Vibrio harveyi

ASAHEDI UMORO

Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Bioteknologi

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016

viii

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr dr Sri Budiarti

x

PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga penelitian ini berhasil diselesaikan. Penelitian yang
berjudul “Isolasi Bacillus sp. Penghasil Bakteriosin dan Peningkatan Aktivitasnya
sebagai Penghambat Vibrio harveyi”, ini ditujukkan sebagai salah satu syarat
untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Program Studi Bioteknologi
Sekolah Pascasarjana IPB.
Terima kasih penulis ucapkan kepada semua pihak yang telah membantu
dalam penelitian ini baik secara langsung maupun tidak langsung. Ungkapan
terima kasih juga disampaikan kepada Dr Nisa Rachmania Mubarik, MSi sebagai
ketua komisi pembimbing dan Dr Widanarni, MSi sebagai anggota komisi
pembimbing atas bimbingan dan motivasi yang diberikan kepada penulis. Kepada
DIKTI atas Beasiswa Unggulan Dalam Negeri selama menempuh pendidikan
pascasarjanan di IPB.
Ucapan terima kasih juga disampaikan kepada Ibu tercinta dan Istri
tersayang Fadlilah Purna Agustin atas doa dan kasih sayangnya, tim Biotek Hadi
Susilo, Rike Tri Kumala Dewi dan Nutika Kurniati, staf Laboratorium
Mikrobiologi IPB Ibu Heni dan Bapak Jaka, serta teman-teman di Laboratorium
Mikrobiologi IPB dan teman-teman di Sekolah Pacasarjana Biotek angkatan 2012.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, Januari 2016

Asahedi Umoro

DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL ............................................................................................... xiii
DAFTAR GAMBAR .......................................................................................... xiii
DAFTAR LAMPIRAN ....................................................................................... xiii
PENDAHULUAN ...................................................................................................1
Latar Belakang .............................................................................................1
Tujuan Penelitian..........................................................................................2
Manfaat Penelitian........................................................................................2
Hipotesis .......................................................................................................2
TINJAUAN PUSTAKA ..........................................................................................3
Bacillus sp. dalam Akuakultur .....................................................................3
Bakteriosin ...................................................................................................3
Biosintesis Bakteriosin .................................................................................5
Mekanisme Kerja Antibakteri Bakteriosin ...................................................6
Vibrio harveyi ...............................................................................................6
Sistem Pertahanan Imun Udang

7
METODE .................................................................................................................9
Kerangka Penelitian .....................................................................................9
Waktu dan Tempat .......................................................................................9
Bahan Penelitian .........................................................................................10
Pengambilan Sampel ..................................................................................10
Seleksi Isolat Bacillus sp. ...........................................................................10
Uji Aktivitas Penghambatan Antimikrob ...................................................10
Uji Aktivitas Penghambatan Bakteriosin ...................................................10
Kurva Tumbuh dan Penentuan Sintesis Bakteriosin ..................................11
Pengendapan Amonium Sulfat, Penghitungan Kadar Protein, dan
Penentuan Bobot Molekul Protein ...................................................1122111
Karakterisasi Isolat Bakteri ........................................................................12
Identifikasi Bakteri Terpilih .......................................................................12
Uji Penghambatan Bakteriosin dan Kompetisi Bacillus sp. terhadap
Vibrio harveyi secara in vitro .....................................................................12
HASIL DAN PEMBAHASAN ..............................................................................13
Isolasi dan Identifikasi Bacillus sp. Penghasil Bakteriosin .......................13
Aktivitas Penghambatan Bacillus sp. .........................................................13
Kurva Tumbuh dan Sintesis Bakteriosin ....................................................14
Pengendapan Amonium Sulfat dan Pengitungan Bobot Molekul
Bakteriosin .................................................................................................15
Identifikasi Molekuler ................................................................................16
Uji Penghambatan Bakteriosin dan Kompetisi Bacillus sp. terhadap Vibrio
harveyi secara in vitro ................................................................................17
Pembahasan ................................................................................................18

xii

SIMPULAN DAN SARAN............................................................................. 11121
Simpulan ................................................................................................ 1721
Saran
22
DAFTAR PUSTAKA ............................................................................................ 22
LAMPIRAN .......................................................................................................... 29
RIWAYAT HIDUP ............................................................................................... 35
DAFTAR TABEL
1 Jenis bakteriosin dari genus Bacillus sp. .............................................................. 4
2 Kategori kelas senyawa bakteriosin ................................................................... 45
3 Karakteristik morfologi koloni dan sel isolat Bacillus sp. terpilih ..................... 13
4 Aktivitas penghambatan isolat Bacillus sp. terpilih ........................................... 14
5 Perbandingan aktivitas penghambatan sebelum dan sesudah pengendapan ...... 15

DAFTAR GAMBAR
1 Kerangka penelitian isolasi Bacillus sp. penghasil bakteriosin dan
peningkatan aktivitasnya sebagai penghambat Vibrio harveyi ........................... 9
2 Kurva pertumbuhan isolat LTP 1 media pertumbuhan SWC cair selama
24 jam pada suhu ± 280 C................................................................................... 14
3 Hasil pengendapan amonium sulfat.................................................................... 15
4 Penentuan bobot molekul bakteriosin isolat LTP1 dengan SDS PAGE ............ 16
5 Identifikasi molekuler gen 16S rRNA ................................................................ 16
6 Uji kompetisi penghambatan Vibrio harveyi pada media SWC cair .................. 17
7 Turbiditas pertumbuhan Vibrio harveyi pada perlakuan penambahan
bakteriosin hasil pengendapan amonium sulfat selama 12 jam inkubasi........... 17
DAFTAR LAMPIRAN
1 Komposisi bahan yang digunakan ...................................................................... 29
2 Data indeks penghambatan isolat Bacillus sp..................................................... 30
3 Pengujian antimikrob Bacillus sp. ...................................................................... 31
4 Pengujian bakteriosin. ........................................................................................ 32
5 Hasil sekuensing isolat Bacillus LTP1 ............................................................... 33

1

PENDAHULUAN

Latar Belakang
Udang merupakan salah satu komoditas unggulan perikanan budidaya,
dengan permintaan dunia yang terus mengalami peningkatan. Indonesia termasuk
negara terbesar pengekspor udang vaname (Litopenaeus vannamei) di dunia selain
beberapa negara seperti Ekuador, Thailand, Vietnam, China, India, dan Malaysia
(FAO 2015). Sebagai salah satu negara pengekspor udang terbesar di dunia,
produksi udang dilakukan dengan sistem budidaya intensif dengan padat tebar dan
pemberian pakan yang tinggi. Pakan yang diberikan pada saat budidaya udang
tidak semua dimanfaatkan oleh udang, akan tetapi sebagian akan terbuang ke
perairan sebagai limbah yang berpotensi menurunkan kualitas lingkungan dan
meningkatkan serangan penyakit. Salah satu penyakit bakteri yang paling serius
dan menyebabkan kematian masal pada udang adalah vibriosis yang disebabkan
oleh bakteri patogen Vibrio harveyi (Zokaeifar et al. 2013). Bakteri ini merupakan
salah satu penyebab kegagalan dalam budidaya udang akibat adanya kematian
masal pada semua stadia udang mulai stadia nauplius, zoea, mysis, dan postlarva
sampai udang dewasa di tambak pembesaran (Saulnier et al. 2000), serta
berdampak pada penurunan jumlah produksi dan menimbulkan kerugian ekonomi
(Muliani et al. 2003; Nasi et al. 2007).
Berbagai upaya pengendalian penyakit vibriosis telah dilakukan salah
satunya dengan penggunan antibiotik. Penggunaan antibiotik dalam pengendalian
penyakit telah dilarang, karena dapat menyebabkan resistensi patogen terhadap
antibiotik dan adanya akumulasi residu antibiotik pada udang sebagai bahan
pangan. Alternatif pengendalian penyakit udang yang disebabkan Vibrio harveyi
secara biologi di tambak udang ialah dengan memanfaatkan Bacillus sp. Bakteri
ini diketahui sebagai bakteri probiotik yang dapat memberikan pengaruh
menguntungkan pada inang dengan meningkatkan penyerapan nilai nutrisi
sehingga meningkatkan pertumbuhan dan kelangsungan hidup udang,
memperbaiki kualitas lingkungan, memperbaiki respon inang terhadap penyakit
dan mempunyai kemampuan untuk menghasilkan senyawa antimikrob peptida
yang mampu untuk menghambat pertumbuhan bakteri patogen (Irina et al. 2001;
Nimrat et al. 2012; Widanarni et al. 2015).
Senyawa antimikrob peptida berupa bakteriosin dan BLIS (Bacteriocin
like inhibitory substance) yang dihasilkan oleh Bacillus sp. memiliki efek
bakterisida atau bakteriostatik yang efektif untuk menghambat pertumbuhan
bakteri patogen di perikanan. Bakteri Bacillus kelompok ini umumnya ditemukan
pada lingkungan perairan tawar hingga perairan laut (Ramachandran et al. 2014;
Rizvi et al. 2014). Senyawa antimikrob polipeptida bakteriosin umumnya
disintesis di ribosom. Proses sintesis ini berlangsung selama masa
pertumbuhannya mengikuti pola sintesis protein dan umumnya hanya
menghambat galur-galur yang berkerabatan dekat dengan bakteri penghasil
bakteriosin. Sedangkan hampir seluruh patogen yang ada di perairan merupakan
bakteri Gram negatif, sehingga perlu dipilih galur Bacillus sp. yang menghasilkan
bakteriosin dengan kemampuan spektrum antagonis yang luas, termasuk pada

2

bakteri Gram negatif, mampu hidup pada kondisi pH rendah, dan tidak sensitif
terhadap zat antibiotik (Ahern et al. 2013).
Kemampuan bakteri Bacillus sp. untuk memproduksi senyawa bakteriosin
dengan spektrum penghambatan yang lebih luas diharapkan dapat menekan Vibrio
harveyi. Penggunaan bakteriosin sebagai pengganti antibiotik memiliki
keunggulan yaitu tidak meninggalkan residu pada udang dan dapat terdegradasi
oleh enzim protease karena merupakan senyawa peptida, sehingga aman
digunakan dibandingkan dengan antibiotik. Mekanisme kerja penghambatan
bakteriosin yaitu diawali dengan bakteriosin berinteraksi dengan struktur
permukaan sel, seperti membran dan atau molekul reseptor kemudian bakteriosin
membuat membran menjadi permeabel melalui pembentukan lubang sehingga
mampu membunuh target bakteri patogen (Nes et al. 2007).
Isolasi dan seleksi bakteri Bacillus sp. dari lingkungan perairan budidaya
udang yang berpotensi menghasilkan senyawa antimikrob bakteriosin dilakukan
dalam penelitian ini. Bakteriosin yang dihasilkan diharapkan dapat menekan dan
mengendalikan bakteri patogen Vibrio harveyi yang menyerang udang dan
penyebab kegagalan panen.

Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengisolat Bacillus sp. penghasil
bakteriosin dari lingkungan tambak udang, Pangandaran, Jawa Barat dan
melakukan peningkatan aktivitas penghambatannya terhadap Vibrio harveyi.

Manfaat Penelitian
Dari hasil penelitian ini diharapkan diperoleh isolat Bacillus sp. sebagai
penghasil senyawa antibakteri bakteriosin yang potensial yang dapat menghambat
pertumbuhan Vibrio harveyi penyebab kegagalan panen pada budidaya udang
vaname.

Hipotesis
Hipotesis yang dapat dikembangkan dalam peneltian ini ialah Bacillus sp.
yang diisolasi dari tambak udang dapat menghasilkan senyawa antibakteri
bakteriosin yang dapat menghambat pertumbuhan Vibrio harveyi.

3

TINJAUAN PUSTAKA

Bacillus sp. dalam Akuakultur
Spesies Bacillus adalah bakteri berbentuk batang, aerob atau fakultatif
anaerob, dan dapat membentuk endospora. Banyaknya spesies pada genus ini
menunjukkan luasnya kemampuan fisiologi yang memungkinkan bakteri ini dapat
hidup pada setiap lingkungan alam. Bacillus sp. yang digunakan sebagai probiotik
pada budidaya udang dapat ditemukan pada sedimen dan saluran pencernaan
udang (Moriarty 1999). Penggunaan Bacillus sp. sebagai probiotik di tambak
udang dapat menghambat bakteri patogen udang karena Bacillus sp. dapat
menghasilkan zat antimikrob polipeptida yang disebut bakteriosin (Lisboa et al.
2006). Perkembangan penelitian mikrob yang menguntungkan bagi akuakultur
mulai dicoba diisolasi dari banyak bahan mikrob air laut, sedimen ataupun organ
hewan yang mampu menghasilkan senyawa antimikrob yang dapat menghambat
pertumbuhan bakteri patogen secara in vitro (Rengpipat et al.1998). Bacillus sp.
dapat berperan sebagai probiotik atau biokontrol yang dapat menekan
pertumbuhan bakteri patogen melalui berbagai mekanisme, misalnya
memproduksi senyawa penghambat (Nimrat et al. 2012).
Probiotik ialah mikrob hidup yang memberikan pengaruh menguntungkan
pada inang dengan memodifikasi komunitas mikrob, memperbaiki nilai nutrisi,
memperbaiki respon inang terhadap penyakit, dan memperbaiki kualitas
lingkungan. Secara umum probiotik untuk budidaya perairan diseleksi
berdasarkan kemampuannya dalam memproduksi senyawa antibakteri.
Mekanisme kerja bakteri probiotik dapat dibagi menjadi beberapa cara yaitu: (1)
produksi senyawa inhibitor; (2) kompetisi terhadap senyawa kimia atau sumber
energi; (3) kompetisi terhadap tempat pelekatan; (4) peningkatan respon imun, (5)
perbaikan kualitas air; dan (6) interaksi dengan fitoplankton (Verschuere et al.
2000). Penggunaan probiotik pada pemeliharaan udang yang terinfeksi oleh
Vibrio harveyi mampu meningkatkan sintasan udang vaname hingga 79.17%
(Widanarni et al. 2014).
Beberapa probiotik Bacillus sp. yang telah digunakan dalam bidang
akuakultur diantaranya B. subtilis, B. megaterium, B. polymyxa, B. licheniformis,
dan B. pumilus yang diketahui berperan dalam pertumbuhan, merangsang sistem
imun, meningkatkan kelulushidupan, serta menghambat bakteri patogen seperti
Vibrio harveyi (Newaj-Fyzul et al. 2014). Probiotik Bacillus sp. merupakan
probiotik umum yang diaplikasikan dan selalu ada pada beberapa produk
komersial dibidang akuakultur karena Bacillus sp. memiliki kemampuan yang
efektif untuk daya pelekatan (adhesion) pada saluran cerna, menyediakan sistem
imunostimulan pada udang, kemampuannya yang dapat membentuk endospora
untuk penyimpanan, serta mampu menghasilkan antimikrob peptida berupa
bakteriosin (Irina et al. 2001; Watson et al. 2008).
Bakteriosin
Bakteriosin merupakan senyawa antimikrob polipeptida yang disintesis di
ribosom oleh bakteri Gram positif atau Gram negatif, proses sintesis ini

4

berlangsung selama masa pertumbuhannya dan umumnya hanya menghambat
galur-galur yang berkerabatan dekat dengan bakteri penghasil bakteriosin (Kone
dan Fung 1992; Jack et al.1995; Drider et al. 2006). Senyawa antimikrob
polipeptida tersebut merupakan senyawa antagonis heterogenus yang
menunjukkan beragam bobot molekul, sifat biokimia, spektrum penghambatan
dan mekanisme kerjanya, serta tersusun dari 20 sampai 60 asam amino (Nes dan
Holo. 2000; Prasad et al. 2005; Lisboa et al. 2006). Bakteriosin pada bakteri
Gram positif umumnya berukuran kecil, stabil terhadap panas dan aktivitas
antimikrobnya memiliki spektrum yang lebih luas dari pada bakteriosin dari
bakteri Gram negatif (Jack et al. 1995), (Tabel 1).
Tabel 1 Jenis bakteriosin dari genus Bacillus sp.
Bobot
Jenis
Organisme
molekul
No
Bakteriosin
(kDa)

Sumber

1

B. cereus

Cerein GN105
Cerein 7A
Cerein 7B

2

B. subtilis

Subtilin

9,0
3,9
4,9
3,2

Subtilin B
Subtilin A
Mersacidin
Ericin S
Ericin A
Bac 14B
LFB112
Bacillocin 490
Peptide A12C
Lichenin
BLIS 5006

3,4
3,4
1,8
3,4
2,9
21
6,3
1,4
0,7
1,4
5,0

BLIS
Megacin 19
Megacin 22
Polyfermenticin
SCD
Thuricin 439
Thuricin 17

11
3,5-6,5
3,5-6,5
14,3

Sharma et al. (2009)
Khalil et al. (2009b)
Khalil et al. (2009a)

2,9
3,2

Ahern et al. (2003)
Gray et al. (2006)

3

B. licheniformis

4

B. amyloliquifaciens

5
6

B. lentus
B. megaterium

7

B. polyfermenticus

8

B. thuringiensis

Naclerio et al. (1993)
Oscariz et al.(1999)
Oscariz et al. (2006)
Benerjee dan Hansen
(1988)
Chan et al. (1993)
Zheng et al. (1999)
Bierbaum et al. (1999)
Stein et al. (2002)
Hammami et al. (2009)
Xie et al. (2009)
Martirani et al. (2002)
Galvez et al. (1993)
Pattnaik et al. (2001)
Lisboa et al. (2006)

Lee et al. (2001)

Kriteria bakteriosin, ialah : (1) umumnya memiliki spektra aktivitas yang
lebih sempit; (2) senyawa aktif merupakan polipeptida atau protein; (3) bersifat
bakterisida; (4) mempunyai reseptor spesifik pada sel sasaran; dan (5) gen
determinan terdapat pada plasmid, plasmid rekombinan episom, kromosom atau
transposon yang berperan pada produksi dan imunitas (Tagg et al. 1976).
Bakteriosin yang dihasilkan oleh bakteri Gram positif biasanya merupakan
polipeptida bermuatan positif yang dapat menembus membran sel dan tersusun
kurang dari 60 residu asam amino. Berdasarkan katagorinya bakteriosin dapat
dikelompokkan menjadi 3 kelas, yaitu: kelas 1 merupakan peptida yang
termodifikasi pada proses pasca translasi; kelas 2 bakteriosin tidak termodifikasi,

5

stabil panas, mengandung peptida dengan BM < 10 kDa; dan kelas 3 bakteriosin
dengan BM > 30 kDa, sensitif panas (Tabel 2).
Tabel 2 Katagori kelas senyawa bakteriosin
Subkatagori

Contoh

Sumber

Katagori
Tipe A
(molekul
panjang, < 4
kDa

Nisin (Lactococcus lactis)
Subtilin (Bacillus subtilis)
Epidermin (Staphylococcus
epidermidis)

Tipe B
(molekul
bulat, 1,8 – 2,1
kDa)
Subkelas IIa
(bakteriosin
antisteril
seperti
pediocin)

Mersacidin (Bacillus sp. Galur HIL Y85,54728)
Mutacin B-Ny266 (Streptococcus
mutans)
Bavaricin A (Lactococcus sakei)
Coagulin (Bacillus coagulans)
Enterocin SE-K4 (Enterococus
faecium)
Lactoccoccin MMFII (L. Lactis)
Leucocin A (Leuconostoc gelidium)

Subkelas II b
(bakteriosin
dua peptida)

Plantaricin EF (Lactobacillus
plantarum)
Plantaricin JK (L. plantarum)

Subkelas II c
(bakteriosin
peptida lain)

Lactococcin 972 (Lactococcus lactis)

Kelas I

Kelas II

Kelas
III

Helveticin J (Lactococcus helveticus)
Millericin B (Streptococcus miler)

Drider et al. (2006)
Cuesta et al.
(2000)
Teo dan Tan
(2005)
Hoffimann et al.
(2004)
Altena et al. (2000)

Heng et al. (2006)

Motta -Meira et al.
(2005)
Mathot et al.
(2003)

Biosintesis Bakteriosin
Antibiotik dan bakteriosin dapat dibedakan berdasarkan dari proses
biosintesisnya. Bakteriosin disintesis melalui jalur ribosom sedangkan antibiotik
disintesis melalui jalur di luar ribosom dengan melibatkan multienzim.
Kebanyakan bakteriosin disintesis dalam bentuk protein yang tidak aktif yang
memiliki N-terminal leader sequence dan C-terminal prepeptida (Williams et al.
1996). Gen yang berperan pada proses produksi bakteriosin sering dihubungkan
dengan elemen yang dapat bergerak atau pada kromosom yang terkait dengan
trasposon atau plasmid. Bakteriosin dengan bobot molekul rendah dari bakteri
Gram positif umumnya ditranslasi sebagai prepetida kemudian dimodifikasi
menjadi bentuk molekul aktif secara biologis. Fungsi pelengkap spesifik
diperlukan oleh sel penghasil bakteriosin termasuk mekanisme untuk translokasi
ekstrasel bakteriosin dan imunitas terhadap aktivitas bakteriosin tersebut (Parada
et al. 2007).

6

Biosintesis bakteriosin dengan bobot molekul rendah yang dihasilkan oleh
bakteri Gram positif diawali dengan pembentukan prapeptida yaitu bakteriosin
yang belum aktif, dengan ujung N penuntun (N-terminal leader sequence) yang
pendek. Ujung ini terpisah pada saat pematangan dengan bantuan endopeptidase
(de Vost et al. 1991). Contoh pada lantibiotik pemisahan terjadi pada asam amino
prolin, sedangkan pada non lantibiotik terjadi pada asam amino glisin. Pemisahan
ini untuk mempermudah prapetida bergandengan dengan peptida lain yang tepat.
Ujung penuntun N ini berperan penting untuk mengarahkan proses pematangan
berupa penggandengan prapetida dengan peptida lain untuk membentuk
bakteriosin aktif, pelepasan bakteriosin aktif ke ekstraseluler dari model hipotesis
biosintesis pediocin AcH yang berbentuk bebas atau terikat pada dinding sel (Jack
et al.1995).

Mekanisme Kerja Antibakteri Bakteriosin
Mekanisme kerja bakteriosin diketahui bergantung pada konsentrasi
bakteriosin, kemampuan ionisasi, suhu, pH dan fase pertumbuhan sel target.
Spektrum antimikrob didefinisikan sebagai satuan galur yang sensitif terhadap
bakteriosin yang diberikan. Sensitivitas ini tergantung dua tahap pada model in
vivo. Tahap pertama, bakteriosin berinteraksi dengan struktur permukaan sel,
seperti membran dan atau molekul reseptor. Tahap kedua, bakteriosin membuat
permeabilisasi membran melalui pembentukan lubang. Pengikatan awal
dipengaruhi oleh komposisi membran, muatan membran, dan adanya struktur
molekul target (reseptor). Tahap kedua dipengaruhi oleh komposisi membran,
struktur C terminal pada bagian membran yang permeabilisasi dan adanya protein
imunitas dari bakteri penghasil (Drider et al. 2006).
Umumnya kebanyakan bakteriosin aktif di membran yang menyebabkan
permeabillisasi dan kadang membunuh bakteri target. Beberapa bakteriosin jenis
lantibiotik jenis A dan B mampu membunuh sel target bakteri dengan
menghentikan sintesis dinding sel melalui ikatan dengan afinitas besar pada
molekul lipid II, suatu molekul yang memainkan peran esensial pada sintesis
lapisan peptidoglikan. Bakteriosin lantibiotik jenis A juga dapat membunuh
bakteri dengan mekanisme tambahan, yaitu terikat pada molekul lipid dan
kemudian, membuat lubang di membran sitoplasma target. Mekanisme
pembentukan lubang oleh lantibiotik jenis A ialah mekanisme pembunuhan yang
paling penting. Mekanisme pembentukan lubang yang mirip juga ditunjukkan
oleh lantibiotik dua peptida lacticin 3147 (Nes et al. 2007).

Vibrio harveyi
Bakteri Vibrio merupakan bakteri Gram negatif, sel tunggal berbentuk
batang pendek, yang bengkok (koma) atau lurus berukuran panjang 1,4-5,0 µm
dan lebar 0,3-1,3 µm, motil dan mempunyai flagela polar. Sedangkan sifat
biokimianya ialah oksidasi positif, dan fermentatif terhadap glukosa. DNA
genomnya mengandung 38% - 51% mol guanin dan sitosin, tidak membentuk gas
pada produksi asam dari fruktosa dan dapat menggunakan sukrosa sebagai sumber

7

energi. Bakteri ini selain ditemukan di perairan air laut, air tawar dan juga dapat
ditemukan pada perairan air payau (Logan 1994).
Vibrio harveyi merupakan salah satu agen penyakit vibriosis yang banyak
menyerang udang vaname, yang menyebabkan penyakit udang berpendar serta
merupakan patogen oportunistik yang umum dijumpai di lingkungan
pemeliharaan udang atau ikan laut. Jika kondisi kesehatan udang menurun maka
bakteri ini akan bersifat patogen (Lavilla-Pitogo et al. 1990). Berdasarkan hasil
penelitian Widanarni et al. (2012) tingkat kematian udang vaname yang diinfeksi
V. harveyi dengan dosis 106 cfu/ml mencapai 31,67%. Vibrio dapat berperan
sebagai patogen primer ataupun patogen sekunder, sebagai patogen primer Vibrio
masuk melalui kontak langsung dengan organisme, sedangkan sebagai patogen
sekunder, Vibrio menginfeksi organisme yang telah terlebih dahulu terinfeksi
penyakit lain.
Lima jenis penyakit yang disebabkan oleh bakteri Vibrio dan dapat
menyebabkan kematian pada udang antara lain: tail necrosis, shell disease, red
disease, loose shell syndrome (LSS) dan white gut disease (WGD). Infeksi Vibrio
terjadi melalui infeksi lewat pakan, insang, dan hepatopankreas. Vibrio akan
berkoloni pada jaringan utama udang setelah Vibrio melewati jaringan epitel
(Lightner 1993; Jayasree et al. 2006). Penyakit vibriosis disebabkan oleh Vibrio
terjadi ketika udang mengalami stres karena beberapa faktor seperti kualitas air
yang jelek, kepadatan yang tinggi, suhu air yang tinggi, rendahnya oksigen, dan
rendahnya pergantian air yang dilakukan selama budidaya (Brock and Lightner
1990).
Sistem Pertahanan Imun Udang
Sistem imun pada hewan merupakan upaya proteksi terhadap infeksi
maupun melindungi fisiologik homeostasi udang. Respon imunitas hewan akuatik
terdiri atas respon nonspesifik dan spesifik, mekanisme pertahanan udang bersifat
nonspesifik atau kurang mengembangkan sistem kekebalan spesifik dengan
memori yang sangat lemah (tidak memiliki sel memori), dibandingkan vertebrata
tingkat tinggi lainnya yang mempunyai antibodi spesifik atau komplemen (Itami
et al. 1994). Mekanisme pertahanan pada krustasea sebagian besar bergantung
pada sel-sel darah dan proses hemolim. Darah udang tidak mengandung
haemoglobin, sehingga darahnya tidak berwarna merah. Peran haemoglobin
digantikan oleh haemosianin, yaitu suatu protein mengandung Cu yang berfungsi
untuk transpor oksigen dan sebagai bufer dalam darah krustasea. Hemosit
memainkan peranan penting pada pertahanan tubuh krustasea, yaitu dapat
menghilangkan partikel asing yang masuk ke tubuh udang, meliputi tahap-tahap
pengenalan, fagositosis, melanisasi, sitotoksis, dan komunikasi sel (Johansson et
al. 2000).
Tiga tipe sirkulasi hemosit berdasarkan pada keberadaan sitoplasma
granula yaitu hialin, semi granular (setengah berisi butir kecil), dan sel granular
(berisi butir kecil), ketiga tipe masing-masing memiliki morfologi dan fisiologi
tertentu yang menyatakan bahwa avertebrata seperti udang tidak mempunyai
immunoglobulin yang berperan dalam mekanisme kekebalan tubuh. Udang
memiliki respons imunitas yang meliputi respons seluler dan humoral yang
bersifat nonspesifik (Mori 1990; Johansson dan Soderhall 1992; Soderhall dan

8

Cerenius 1992). Sistem pertahanan selular meliputi fagosit sel-sel hemosit,
nodulasi dan enkapsulasi. Sistem pertahanan humoral mencakup phenoloksidase
(PO), prophenoloksidase (proPO), letin, dan aglutinin. Kedua sistem ini bekerja
sama memberikan perlindungan tubuh terhadap infeksi organisme patogen dari
lingkungan (Itami et al. 1994).
Pencegahan penyakit merupakan upaya alternatif untuk menanggulangi
penyebaran penyakit. Salah satu alternatif yang dapat digunakan yaitu dengan
menggunakan imunostimulan untuk meningkatkan kekebalan tubuh udang. Salah
satu mekanisme peningkatan sistem imunitas udang ialah dengan menggunakan
bakteri probiotik yang dapat menstimulasi sistem imun dari udang dengan
menekan mekanisme competitive ecxlucion dengan menekan pertumbuhan bakteri
patogen (senyawa antimikrob, bakteriosin) pada lingkungan hidup udang serta
menghasilkan senyawa-senyawa biologi (glukan, peptidoglikan, dan
lipopolisakarida) yang dapat meningkatkan aktivitas imun (fagositosis dan
aktivitas proPO) pada udang (Johansson et al. 2000).
Stimulasi sistem imun pada udang dengan probiotik juga telah dilakukan
oleh Rengpipat et al. (2000) bahwa udang P. monodon yang diberi pakan dengan
penambahan bakteri probiotik Bacillus S11 telah secara signifikan memperbaiki
tingkat kelangsungan hidup dan meningkatkan respons imun setelah ditantang
dengan V. harveyi. Hal yang sama juga diperoleh Gullian et al. (2004) bahwa
bakteri probiotik Bacillus P64 yang berasal dari hepatopankreas udang sehat
memiliki kemampuan sebagai probiotik dan imunostimulasi pada udang vaname.
Penelitian yang dilakukan oleh Liu et al. (2004) memperlihatkan bahwa bakteri
probiotik Arthrobacter XE-7 mampu melindungi udang L. vannamei melalui
stimulasi ketahanan imun maupun pembentukan mekanisme kompetisi terhadap
bakteri patogen dengan menghasilkan senyawa antimikrob.

9

METODE

Kerangka Penelitian
Kerangka penelitian meliputi: isolasi Bacillus sp. dari air dan sedimen
lumpur tambak udang daerah Pangandaran – Jawa Barat, seleksi isolat penghasil
antimikrob, uji aktivitas bakteriosin, identifikasi isolat terpilih, pengendapan
bakteriosin dengan ammonium sulfat, uji kandungan protein dan perhitungan
bobot molekul protein (Gambar 1).
Air dan sedimen dari tambak udang
daerah Pangandaran; identifikasi
morfologi, pewarnaan gram dan
endospora; uji patogen agar-agar darah

Isolasi dan seleksi isolat Bacillus
sp.

Indeks penghambatan sel

Uji aktivitas antimikrob

a)

Uji indeks penghambatan
supernatan bebas sel (pH 7)
b) Uji sensitivitas proteolitik
(proteinase K)
c) Aktivitas penghambatan (mm2/ml)
a) Penentuan kurva tumbuh dan
sintesis bakteriosin
b) Identifikasi molekuler 16S rRNA

Uji aktivitas bakteriosin

Isolat terpilih (aktivitas
penghambatan tertinggi)

Pengendapan bertingkat
amonium sulfat 30%-80%

Uji kompetisi bakteriosin dan Bacillus
sp. terhadap V. harveyi pada media
SWC cair secara in vitro

a) Uji aktivitas penghambatan Vibrio
harveyi
b) Perhitungan kadar protein dan
bobot molekul protein
c) Penentuan berat molekul (SDS

Gambar 1 Kerangka penelitian isolasi Bacillus sp. penghasil bakteriosin dan
peningkatan aktivitasnya sebagai penghambat Vibrio harveyi

Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Maret 2014 sampai Maret 2015.
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi,
FMIPA, IPB.

10

Bahan Penelitian
Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah sampel air dan sedimen
lumpur yang diambil dari tambak udang daerah Pangandaran – Jawa Barat dengan
koordinat 7°41'- 7°45"LS dan 108°30- 108°35'BT.

Pengambilan Sampel
Sampel air tambak diambil sebanyak 100 ml sedangkan sedimen lumpur
tambak diambil kira-kira 100 g kemudian dimasukkan ke dalam botol sampel.
Semua sampel disimpan di dalam kondisi dingin hingga sampai di laboratorium
(Jamilah et al. 2011).

Seleksi Isolat Bacillus sp.
Sampel diencerkan dengan garam fisiologis hingga pengenceran 10-4- 10-6
kemudian dipanaskan di dalam penangas air pada suhu 80 0C selama 15 menit.
Sebanyak 0.1 mL sampel kemudian disebar pada media agar-agar SWC (seawater
complete) (Lampiran 1), kemudian diinkubasi pada suhu ruang. Metode ini
memberi peluang bagi tertapisnya Bacillus sp. (Jamilah et al. 2011).

Uji Aktivitas Penghambatan Antimikrob
Isolat bakteri Bacillus sp. dan bakteri V. harveyi diremajakan pada media
SWC, kemudian diinkubasi selama ± dua hari. Untuk mengetahui kemampuan
isolat bakteri Bacillus sp. yang menghasilkan zat antimikrob dalam menghambat
V. harveyi maka sebanyak 50 µl biakan bakteri V. harveyi dengan kepadatan sel
106 CFU/ml disuspensikan dalam 50 ml SWC semipadat, kemudian dituang
sekitar ± 10 ml pada permukaan SWC padat dan didiamkan beberapa saat hingga
beku. Selanjutnya isolat bakteri Bacillus sp. yang berumur dua hari digores atau
ditotolkan pada agar-agar SWC yang sudah berisikan bakteri V. harveyi dengan
menggunakan jarum ose dan diinkubasi pada suhu ± 280 C selama 24 jam. Bakteri
yang memiliki kemampuan dalam menghasilkan senyawa antimikrob
menunjukkan adanya zona bening (zona penghambatan) di sekitar koloni dan
dihitung indeks penghambatannya dengan menggunakan persamaan (Isramilda
2007).
Diameter zona hambat (mm)  Diameter koloni (mm)
Indeks Penghambatan =
Diameter koloni (mm)

Uji Aktivitas Penghambatan Bakteriosin
Isolat yang sudah diketahui indeks penghambatannya terhadap V. harveyi
ditumbuhkan pada media SWC cair dan diinkubasi selama 24 jam pada inkubator
bergoyang pada suhu ± 280 C, kemudian kultur bakteri disentrifuse pada

11

kecepatan 10.000 rpm (Sentrifuge Hermle dengan rotor 220.97) selama lima
menit. Supernatan dilakukan penetralan pada pH 7 dengan penambahan 0,1 M
NaOH. Sebanyak 100 µl biakan bakteri V. harveyi dengan kepadatan sel 106
CFU/ml dituang pada media agar-agar SWC dan dilakukan penggoresan dengan
menggunakan cotton bud steril untuk meratakan. Sebanyak 10-20 µl supernatan
diteteskan ke kertas cakram berukuran 5 mm dengan ketebalan 2 mm. Kemudian
diinkubasi selama 24 jam pada suhu ± 280 C dan zona bening (zona
penghambatan) yang terbentuk dihitung (Sharma et al. 2011) dan Aktivitas
penghambatan (mm2/ml) bakteriosin dihitung dengan persamaan (Usmiati dan
Marwati 2007).
Akitivitas hambat (mm2/ml) =
Luas zona bening (mm 2 )  Luas kertas cakram (mm 2 )
Volume supernatan bebas sel (ml)
Pengujian kepekaan supernatan bebas sel (bakteriosin) terhadap enzim
proteolitik dilakukan untuk memastikan aktivitas penghambatan bakteriosin
terhadap V. harveyi disebabkan oleh senyawa protein bakteriosin bukan oleh
senyawa lainya. Pengujian kepekaan enzim proteolitik dilakukan dengan
menambahkan enzim proteinase K (1 mg/ml) sebanyak 10 µl pada supernatan
bebas sel 100 µl dan diinkubasi selama 2 jam pada suhu ± 280 C kemudian diuji
aktivitas penghambatan terhadap V. harveyi (Nguyen et al. 2014).

Kurva Tumbuh dan Penentuan Sintesis Bakteriosin
Satu lup isolat Bacillus sp. terpilih berumur 24 jam dan memiliki aktivitas
penghambatan terbesar ditumbuhkan pada 10 ml media SWC cair kemudian
ditumbuhkan selama 12 jam. Kemudian kultur dipindahkan sebanyak 1,5 ml ke
dalam media cair 150 ml dan diinkubasi selama 24 jam untuk diamati
pertumbuhan sel dengan mengukur absorbansinya pada panjang gelombang 600
nm setiap 3 jam. Penentuan sintesis bakteriosin dilakukan setiap 3 jam selama 24
jam dengan mengambil sebanyak 3 ml kultur ke dalam tabung mikro dan
dilakukan sentrifuse pada kecepatan 10.000 rpm (Centrifuge Hermle dengan rotor
220,97) selama 5 menit kemudian supernatan bebas sel diuji aktivitas
antimikrobnya terhadap V. harveyi (Lisboa et al. 2006) dan dihitung kadar
proteinnya.

Pengendapan Amonium Sulfat, Penghitungan Kadar Protein, dan Penentuan
Bobot Molekul Protein
Isolat Bacillus sp. terpilih ditumbuhkan di dalam media SWC cair hingga
memasuki fase awal stationer, lalu sel dipisahkan dengan sentrifugasi dan protein
di dalam supernatan dilakukan presipitasi dengan penambahan 10% amonium
sulfat secara bertingkat dari 30-80%. Kemudian presipitat dilarutkan ke dalam
sodium phospate–buffer saline (PBS) pH 7. Hasil endapan protein kemudian
dilakukan pengujian aktivitas antimikrob (Lisboa et al. 2006) dan dihitung
konsentrasi proteinnya (Bradford 1976). Selanjutnya ditentukan bobot molekulnya
dengan metode sodium dodecyl sulfate polyacrylamide (SDS PAGE). Penentuan

12

bobot molekul ditentukan dengan menggunakan 12% gel pemisah dan 4% gel
penumpuk. Kondisi elektroforesis ialah 50 mA, 100 volt selama 30 menit. Hasil
elektroforesis diwarnai oleh Coomasie Brilliant Blue G-250 (CBB G-250). Bobot
molekul sampel dihitung dengan menggunakan kurva standar bobot molekul
protein (Oscariz et al. 1999).

Karakterisasi Isolat Bakteri
Isolat Bacillus sp. dikarakterisasi berdasarkan ciri-ciri morfologi dan
fisiologi berdasarkan: pewarnaan Gram, dan spora mengikuti Bergey’s Manual of
Determintive Bacteriology.

Identifikasi Bakteri Terpilih
Isolasi DNA genom dilakukan menggunakan Geneid Presto Mini gDNA
Bacteria Kit. Primer yang digunakan ialah primer spesifik untuk prokariot, 63f
(5’-CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC-3’) dan 1387r (5’-GGG CGG WGT
GTA CAA GGC-3’) (Marchesi et al.1998). Komposisi reaksi PCR dengan
volume reaksi 50 µl yang mengandung 25 µl mix PCR, 0.8 µl DNA template, 0.5
µl primer forward (10 pmol), 0.5 µl primer reverse (10 pmol) dan 23.2 µl ddH2O
steril. Kondisi PCR yaitu pradenaturasi (94 0C, 5 menit), denaturasi (94 0C, 1
menit), annealing (55 0C, 1 menit), elongation (72 0C, 1 menit), dan post
elongation (720C, 7 menit) sebanyak 27 siklus. Elektroforesis dengan
menggunakan agarosa 1% pada tegangan listrik 80 Volt selama 45 menit.
Visualisasi DNA dilakukan di atas UV transiluminator menggunakan pewarna
Etidium Bromida (EtBr). DNA hasil amplifikasi disekuen untuk mengetahui
urutan basa nukleotidanya. Urutan basa nukleotida hasil sekuen kemudian
disejajarkan dengan data GeneBank menggunakan program BLASTN (Basic
Local Alignment Search Tool-Nucleotida) dari situs NCBI (National Center for
Biotechnology Information). Analisis filogenetik dilakukan menggunakan
program MEGA 5 dengan metode Neighbour Joining (NJ) dengan bootstrap
1000x (Tamura 2007).

Uji Penghambatan Bakteriosin dan Kompetisi Bacillus sp. terhadap Vibrio
harveyi secara in vitro
Bakteriosin hasil pengendapan ammonium sulfat diinokulasi bersama
dengan bakteri V. harveyi (106 CFU/ml) pada media SWC cair 50 ml dengan
perbandingan bakteriosin : V. harveyi 1:1 (50 µl : 50 µl) dan 2:1 (100 µl : 50 µl)
dan satu erlemeyer digunakan sebagai kontrol (tanpa penambahan bakteriosin).
Inkubasi dilakukan selama 24 jam pada suhu ± 280 C untuk menentukan
kemampuan penghambatan bakteriosin terhadap V. harveyi. Sedangkan uji
kompetisi Bacillus sp. dengan bakteri V. harveyi dilakukan dengan
menginokulasikan Bacillus sp. dan V. harveyi dengan perbandingan 1:1 (50 µl :

13

50 µl) dan 1:2 (100 µl : 50 µl) diinkubasi selama 24 jam. Jumlah sel V. harveyi
yang tumbuh dihitung dengan metode cawan sebar pada media TCBS padat.
Kemampuan kompetisi ditentukan dengan menghitung jumlah Vibrio
harveyi dengan metode cawan sebar. Penentuan persentase penghambatan
dihitung dengan persamaan.
Kontrol - Perlakuan
Persen Penghambatan =
x100%
Kontrol

HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi dan Identifikasi Bacillus sp. Penghasil Bakteriosin
Sebanyak 22 isolat Bacillus sp. diperoleh dari sampel sedimen lumpur dan
air tambak udang Pangandaran, Jawa Barat. Dari 22 isolat yang didapat dilakukan
seleksi penghambatan terhadap bakteri Vibrio harveyi dan diperoleh 12 isolat
yang mempunyai aktivitas antimikrob (Lampiran 2). Hasil seleksi dari 12 isolat
tersebut dipilih lima isolat terbaik, yaitu: LTP 1, LTP 4, LTP 6, LTP 14, dan ATP
2, yang memiliki indeks penghambatan terbesar untuk diamati karakteristik
morfologi isolat dan diuji lanjut aktivitas antimikrob bakteriosin (Tabel 3).
Tabel 3 Karakteristik morfologi koloni dan sel isolat Bacillus sp. terpilih
No Morfologi
1
2
3

Koloni
Tepi
Elevasi
Warna

4
5
6

Sel
Bentuk
Gram
Endospora

l

LTP 1
Utuh
Timbul
Putih
susu
Batang
Positif
Ada

Isolat Bacillus sp. Terpilih
LTP 4
LTP 6
LTP 14
Berombak Berombak
Berombak
Rata
Melengkung Melengkung
Putih susu Putih susu
Putih susu

Batang
Positif
Ada

Batang
Positif
Ada

Batang
Positif
Ada

ATP 2
Utuh
Timbul
Putih
susu
Batang
Positif
Ada

Aktivitas Penghambatan Bacillus sp.
Hasil uji aktivitas penghambatan kelima isolat Bacillus sp. terhadap V.
harveyi (sel 106 cfu/ml) menunjukkan bahwa indeks penghambatan yang didapat
berkisar antara 1,07-1,77 dengan nilai tertinggi pada isolat LTP 1. Aktivitas
penghambatan supernatan bebas sel untuk kelima isolat berkisar antara 1,53 –
1,93 dengan nilai tertinggi pada isolat LTP 1. Aktivitas unit yang didapat dari
kelima isolat Bacillus sp. berkisar antara 1063-1492 mm2/ml, dengan nilai
tertinggi pada isolat LTP 1. Berdasarkan pengujian kepekaan bakteriosin terhadap
enzim proteolitik (proteinase K) menunjukkan bahwa supernatan bebas sel
ternyata sensitif terhadap enzim proteinase K, dengan tidak adanya zona

14

penghambatan terhadap V. harveyi jika dibandingkan dengan tanpa penambahan
enzim proteinase K (Tabel 4).
Tabel 4 Aktivitas penghambatan isolat Bacillus sp. terpilih terhadap V. harveyi
Asal
Isolat

No
1
2
3
4
5

Sedimen
Sedimen
Sedimen
Sedimen
Air

Indeks Penghambatan
Isolat
Sel
LTP 1
LTP 4
LTP 6
LTP 14
ATP 2

1,77±0,93
1,26±0,16
1,22±0,38
1,07±0,81
1,53±0,35

Supernata
n
1,93±0,12
1,67±0,31
1,53±0,31
1,8±0,20
1,73±0,31

Aktivitas
hambat
mm2/ml

Protein
mg/ml

Kepekaan
enzim
proteolitik

1492
1199
1063
1342
1270

0,0834
0,0697
0,0661
0,0796
0,0763

+
+
+
+
+

Kurva Tumbuh dan Sintesis Bakteriosin
Isolat LTP 1 yang merupakan isolat dengan kemampuan penghambatan
terbaik dipilih untuk dilakukan pengamatan terhadap laju fase pertumbuhan,
waktu sintesis bakteriosin, dan pengukuran kadar proteinnya. Sintesis bakteriosin
sudah mulai terjadi pada fase logaritmik, aktivitas penghambatan supernatan
(bakteriosin) mulai terjadi pada waktu pengamatan jam ke-9 dengan zona hambat
yang terjadi 8 mm sedangkan penghambatan sel bakteri Bacillus sp. terjadi pada
jam ke-3 dengan zona hambat 7,3 dan nilai kadar protein selama fase
pertumbuhan berkisar antara 16