Waktu dan Tempat Penelitian Alat dan Bahan Penentuan Konsentrasi Larutan Eudragit

III. BAHAN DAN METODE

3.1. Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilakukan dari bulan November 2006 sampai dengan Januari 2008. Penelitian bertempat di Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, Fakultas MIPA dan Laboratorium Bioteknologi Hewan dan Biomedis, PPSHB, Institut Pertanian Bogor.

3.2. Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini yaitu spektrofotometer Metertek, inkubator bergoyang Certomat WR, sentrifus Beckman GPR, stirer magnetik RCH-3 Eyela, timbangan analitik Ohaus AS200, vortex VWR K- 550-G, pipet mikro Finnpipette, penangas air TZ4ST Autonics, pH meter HANNA, laminar air flow Gelaire BSB4A, autoklaf TOMY SS-245, pengaduk bermagnet, dan alat-alat gelas. Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu isolat Streptomyces sp. 45I-3 asal Kalimantan koleksi Dr. Ir. Yulin Lestari, Departemen Biologi, FMIPA IPB, Substrat Xilan Birchwood Sigma, Sukrosa, Ekstrak Khamir, Agar-agar, DNS 3,5–Asam Dinitrosalisilat, K-Na-Tartrat, NaOH, Na 2 SO 3 , Coomassie Brilliant Blue G-250, Etanol 95 , Asam Fosfor 85 , Na 2 HPO 4 , NaH 2 PO 4 , Asam Sitrat, NaCl, Xilosa, BSA Bovine Serum Albumine, Matriks Amobilisasi Eudragit TM S100 Rohm Pharma dan Akuades. Bahan kimia tersebut dari Merck TM kecuali yang disebutkan dan berkualitas pro analisa.

3.3. Metode Penelitian

3.3.1. Preparasi Ekstrak Kasar Xilanase

Isolat Streptomyces sp. 45I-3 diremajakan pada cawan petri berisi media agar-agar xilan Tabel 2, diinkubasi pada suhu ruang selama 5 hari sampai terbentuk spora. Produksi enzim xilanase dilakukan dengan cara menginokulasikan sebanyak 2 loop diameter 1 cm kultur agar cawan hasil peremajaan ke dalam Erlenmeyer yang berisi 100 ml media cair xilan Tabel 2, tanpa agar. Kultur tersebut diinkubasi pada suhu ruang di dalam inkubator bergoyang kecepatan 150 rpm selama 8 hari. Enzim ekstrak kasar dipanen dengan cara sentrifugasi kultur pada 4500 x g selama 15 menit pada suhu 4 o C. Supernatan merupakan ekstrak kasar xilanase yang digunakan dalam tahap amobilisasi. Tabel 2. Komposisi Media Agar-Agar Xilan Bahan Jumlah Agar-Agar 1.5 Xilan Birchwood 0.75 Sukrosa 10.3 Ekstrak Khamir 1.0 Sumber: Prihandono 2007

3.3.2. Amobilisasi Enzim Xilanase

Ekstrak kasar xilanase diamobilisasi dengan Eudragit TM S100 berdasarkan modifikasi metode Sardar et al. 2000, yang terdiri atas:

1. Pembuatan Larutan Eudragit

TM S100 2 bv Larutan Eudragit TM S100 untuk amobilisasi xilanase ekstraseluler dibuat dengan melarutkan 1 g Eudragit TM S100 ke dalam 40 ml akuades. Dengan pengadukan konstan, diteteskan larutan 3 M NaOH hingga mencapai pH 11.0. Setelah matriks terlarut sempurna, pH larutan diturunkan menjadi 7.0 dengan penambahan larutan 3 M HCl. Volume larutan ditera sampai 100 ml dengan akuades. Larutan disimpan pada 4 o C sampai akan digunakan.

2. Penentuan Konsentrasi Larutan Eudragit

TM S100 Tahapan ini dilakukan untuk mengetahui konsentrasi larutan Eudragit TM S100 yang optimum untuk mengikat xilanase, dengan menggunakan enam taraf konsentrasi larutan, yaitu 0.1, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0 dan 3.0 bv. Larutan Eudragit TM S100 masing-masing konsentrasi sebanyak 4 ml ditambahkan dengan 1 ml ekstrak kasar xilanase secara terpisah. Setelah inkubasi selama 1 jam pada suhu 30 o C, matriks diendapkan dengan mengatur pH menjadi 4.5 menggunakan larutan 0.1 M asam asetat. Setelah 30 menit, suspensi disentrifugasi pada 12000 x g selama 20 menit dan supernatan dipisahkan. Endapan dicuci dengan 4 ml 0.01 M bufer asetat pH 4.0 Lampiran 1, kemudian suspensi disentrifugasi kembali. Endapan yang terbentuk xilanase yang teramobilkan dilarutkan dalam 0.02 M bufer sitrat fosfat pH 5.0 sehingga volume akhir menjadi 5 ml. Aktivitas xilanase dihitung dengan menentukan gula pereduksi yang terbentuk menggunakan metode Miller 1959 yang tersaji pada Lampiran 2 dan kadar protein dihitung menggunakan metode Bradford 1976 pada Lampiran 3. Aktivitas xilanase pada supernatan dan hasil pencucian dihitung untuk menentukan aktivitas yang tidak terikat, sedangkan aktivitas xilanase pada suspensi xilanase amobil dihitung sebagai aktivitas xilanase amobil. Konsentrasi larutan Eudragit TM S100 yang menghasilkan efektivitas amobilisasi yang optimum dipilih untuk digunakan pada tahap selanjutnya. Aktivitas xilanase amobil nkatml Efektivitas Amobilisasi = x 100 Aktivitas tidak terikat nkatml Dimana: Aktivitas tidak terikat = Aktivitas Enzim Bebas – Aktivitas pada supernatan + Aktivitas pada hasil pencucian

3. Penentuan Rasio Konsentrasi Xilanase dengan Eudragit

TM S100 Langkah selanjutnya yaitu dengan menentukan rasio konsentrasi xilanase dengan larutan Eudragit TM S100 dari penelitian tahap sebelumnya, dengan menggunakan sebelas kombinasi rasio konsentrasi xilanase dan larutan Eudragit TM S100, yaitu 6 : 1, 5 : 1, 4 : 1, 3 : 2, 3 : 1, 2 : 1, 1 : 1, 1 : 2, 1 : 3, 2 : 3 dan 1 : 4. Xilanase ekstrak kasar ditambahkan ke dalam larutan Eudragit TM S100 dengan rasio tertentu dan diinkubasi selama 1 jam pada suhu 30 o C. Matriks diendapkan dengan mengatur pH menjadi 4.5 menggunakan 0.1 M asam asetat. Setelah 30 menit, suspensi disentrifugasi pada 12000 x g selama 20 menit. Endapan dicuci dengan 0.01 M bufer asetat pH 4.0 Lampiran 1, kemudian suspensi disentrifugasi kembali. Endapan yang terbentuk xilanase yang teramobilkan dilarutkan dalam 0,02 M bufer sitrat fosfat pH 5.0. Aktivitas xilanase dan kadar protein dihitung seperti yang tersaji pada Lampiran 2 dan 3. Aktivitas xilanase pada supernatan dan hasil pencucian dihitung untuk menentukan aktivitas yang tidak terikat, sedangkan aktivitas xilanase pada suspensi xilanase amobil dihitung sebagai aktivitas xilanase amobil. Rasio konsentrasi xilanase dengan larutan Eudragit TM S100 yang menghasilkan efektivitas amobilisasi yang optimum dipilih untuk digunakan pada tahap karakterisasi.

3.3.3. Karakterisasi Enzim Xilanase Amobil 1. Pengujian pH optimum

Pengujian pH optimum xilanase amobil dilakukan dengan mereaksikan xilanase amobil dengan substrat xilan birchwood 0.5 bv pada suhu 50 o C selama 30 menit pada berbagai kondisi pH larutan bufer dengan selang pH 0.5 unit, yaitu menggunakan bufer sitrat fosfat 0.02 M untuk pH 3.0 – 6.0 dan bufer fosfat 0.02 M untuk pH 6.0 – 7.0. Aktivitas xilanase dihitung berdasarkan gula pereduksi yang terbentuk menggunakan metode Miller 1959 seperti tersaji pada Lampiran 2.

2. Pengujian suhu optimum

Pengujian suhu optimum xilanase amobil dilakukan dengan mereaksikan xilanase amobil dengan substrat xilan birchwood 0.5 bv selama 30 menit pada suhu 30 – 70 o C, dengan selang suhu 10 o C. Aktivitas xilanase dihitung berdasarkan gula pereduksi yang terbentuk menggunakan metode Miller 1959 seperti tersaji pada Lampiran 2.

3. Pengujian Stabilitas Suhu

Pengujian stabilitas xilanase amobil terhadap suhu dilakukan dengan menginkubasikan enzim amobil pada berbagai suhu 30 – 70 o C selama 1 jam. Setelah inkubasi selesai larutan enzim dengan cepat didinginkan di dalam penangas es bersuhu 4 o C. Aktivitas enzim yang tersisa diuji pada kondisi standar reaksi enzimatis xilanase. Aktivitas xilanase dihitung berdasarkan gula pereduksi yang terbentuk menggunakan metode Miller 1959 seperti tersaji pada Lampiran 2. Nilai aktivitas enzim tersisa dinyatakan dalam persentase dibandingkan dengan kontrol enzim tanpa perlakuan.

4. Stabilitas Xilanase Amobil dalam Substrat Xilan Birchwood dan Xilan Tongkol Jagung

Pengujian stabilitas xilanase amobil dalam substrat dilakukan dengan menginkubasikan xilanase amobil dengan xilan birchwood dan xilan tongkol jagung 1 bv dalam 0.02 M bufer sitrat fosfat pada kondisi optimum xilanase amobil suhu 40 o C dan pH 6.0 selama 7 jam. Pengambilan sampel xilanase amobil dilakukan setiap 2 jam. Aktivitas xilanase dihitung berdasarkan gula pereduksi yang terbentuk menggunakan metode Miller 1959 seperti tersaji pada Lampiran 2.

5. Stabilitas Xilanase Amobil pada suhu 40

o C dan pH 5.0 Pengujian stabilitas xilanase amobil ini dilakukan dengan menginkubasikan xilanase amobil dalam 0.02 M bufer sitrat fosfat pH 5.0 pada suhu 40 o C selama 10 jam. Pengambilan sampel xilanase amobil dilakukan setiap 1 jam. Aktivitas xilanase dihitung berdasarkan gula pereduksi yang terbentuk menggunakan metode Miller 1959 seperti tersaji pada Lampiran 2.

3.3.4. Spesifitas Xilanase Amobil terhadap Substrat Xilan Birchwood dan Xilan Tongkol Jagung

Pengujian spesifitas xilanase amobil terhadap xilan birchwood dan xilan tongkol jagung dilakukan untuk mengetahui kemampuan xilanase amobil untuk mendegradasi substrat xilan menjadi xilan rantai pendek, xilooligosakarida dan xilosa. Pengujian dilakukan dengan mencampurkan 1 ml xilanase amobil 0.32 nkatml, 10 ml larutan bufer substrat xilan birchwood atau xilan tongkol jagung 1 bv dan 9 ml larutan bufer sitrat fosfat 0.02 M. Hasil pencampuran tersebut ditempatkan pada Erlenmeyer dan diinkubasikan pada suhu optimumnya. Hasil inkubasi diambil sebanyak 1 ml setiap jamnya selama 5 jam inkubasi dan dididihkan untuk inaktivasi enzim. Hasil pengujian dihitung dengan menentukan Kadar Gula Pereduksi dengan metode DNS Miller 1959 pada Lampiran 2 dan Total Gula dengan metode fenol sulfat Dubois 1956 seperti tersaji pada Lampiran 4, untuk mendapatkan perhitungan Derajat Polimerisasi DP.

3.3.5. Penggunaan Berulang Xilanase Amobil

Pengujian penggunaan berulang terhadap enzim amobil dilakukan berdasarkan modifikasi metode Roy et al. 2003 untuk mengetahui kemampuan xilanase amobil untuk dipakai berulang tanpa kehilangan aktivitasnya. Penggunaan berulang ini dilakukan dengan melakukan hidrolisis 18 ml substrat xilan birchwood 1 bv dalam bufer sitrat fosfat 0.02 M pH 5.0 dengan 2 ml xilanase amobil 16.88 nkatml pada suhu 40 o C selama 1 jam. Setelah setiap siklus hidrolisis, xilan yang tidak terdegradasi dipisahkan dengan sentrifugasi pada 2000 x g selama 10 menit. pH supernatan diturunkan menjadi 4.5 dengan penambahan 0.1 M asam asetat sehingga enzim amobil terendapkan dan dipisahkan dengan sentrifugasi pada 12000 x g selama 20 menit. pH supernatan diatur kembali menjadi pH 5.0. Untuk melakukan percobaan siklus kedua, enzim amobil dilarutkan kembali dalam bufer baru dan ditambahkan dengan xilan yang tidak terdegradasi, selanjutnya diproses dengan cara yang sama. Jumlah gula pereduksi pada supernatan diuji menggunakan metode Miller 1959 seperti tersaji pada Lampiran 2.

3.3.6. Prosedur Analisis 1. Pengujian Aktivitas Enzim Xilanase

Pengujian aktivitas enzim xilanase dilakukan dengan menghitung gula pereduksi yang terbentuk sebagai hasil aktivitas xilanase terhadap substratnya dengan metode Miller 1959. Satu unit aktivitas xilanase dinyatakan sebagai banyaknya enzim yang diperlukan untuk menghasilkan 1 µmol gula xilosa dari substrat birchwood per menit pada kondisi optimal reaksi enzimatis. Prosedur pengujian aktivitas xilanase dan kurva standar xilosa disajikan pada Lampiran 2.

2. Pengujian Kadar Protein

Pengujian kadar protein enzim dilakukan dengan metode Bradford 1976. Prosedur pengujian kadar protein dan kurva standar Bovine Serum Albumine BSA disajikan pada Lampiran 3.

3. Pengujian Total Gula

Total gula hasil hidrolisis xilanase ditetapkan berdasarkan metode fenol asam sulfat Dubois 1956 dengan prinsip bahwa gula sederhana, oligosakarida, polisakarida dan turunannya dapat bereaksi dengan fenol dalam asam sulfat menghasilkan warna jingga yang stabil. Penetapan total gula dan kurva standar total gula disajikan pada Lampiran 4.

4. Derajat Polimerisasi

Derajat Polimerisasi menyatakan perbandingan antara total gula dengan gula pereduksi dengan rumus hitung sebagai berikut: Total Gula mgml Derajat Polimerisasi DP = Gula Pereduksi mgml

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Preparasi Ekstrak Kasar Xilanase Produksi xilanase ekstrak kasar dari isolat bakteri Streptomyces sp. 45I-3, dengan morfologi seperti pada Lampiran 5, yang menggunakan media cair xilan birchwood 0.75 bv mampu menghasilkan aktivitas xilanase sebesar 16.28 nkatml pada waktu optimumnya. Menurut Kulkarni et al. 1999, xilan sebagai polimer dengan berat molekul besar tidak dapat masuk ke dalam sel dan berfungsi sebagai induser langsung. Oleh karena itu, produksi xilanase oleh mikroba dalam media yang mengandung xilan diinduksi oleh adanya fragmen xilan dengan berat molekul kecil seperti xilosa, xilobiosa serta xilooligosakarida yang dapat memasuki sel dan berfungsi sebagai induser untuk sintesa xilanase dalam jumlah besar. Proses tersebut tampak pada Gambar 4. Gambar 4. Regulasi Biosintesis Xilanase Thomson 1993 dalam Kulkarni et al. 1999 Xilanase konstitutif mendegradasi xilan menjadi xilooligosakarida dan xilobiosa, yang akan memasuki sel dan menginduksi gen xilanase yang lain induksi xilanase primer. Xilanase yang terinduksi akan mendegradasi xilan, untuk selanjutnya menjadi xilooligosakarida dan xilobiosa. L-xilosidase yang diproduksi secara konstitutif maupun induktif, mengubah xilobiosa menjadi xilosa dan secara bertahap mengalami transglikosilasi menjadi XylB1-2Xyl and GlcB1- 2Xyl. Senyawa ini memasuki sel dan berperan sebagai induser tambahan terhadap gen yang mengkode enzim xilanolitik menghasilkan induksi xilanase tahap kedua Gambar 4. Menurut Beg et al. 2001, L-sorbosa dan residu lignoselulosa dapat menginduksi dihasilkannya xilanase. Kansoh dan Nagieb 2004 menyebutkan adanya ekstrak khamir pada media produksi sebagai sumber karbon dan nitrogen organik dapat menunjang pertumbuhan sel Streptomyces galbus NR, sehingga dapat meningkatkan produksi xilanase walaupun tidak secara langsung menginduksi sintesis xilanase. Keberadaan beberapa jenis gula yang dapat langsung digunakan seperti glukosa dan xilosa dalam jumlah banyak sebagai sumber karbon untuk proses metabolisme dilaporkan dapat menekan sintesis xilanase Beg et al. 2001. Aktivitas xilanase yang dihasilkan Streptomyces sp. isolat 45I-3 pada penelitian ini lebih kecil dibandingkan dengan aktivitas xilanase jamur, misalnya xilanase Trichoderma reesei 6668 nkatml dan Schizophillum commune 16003 nkatml Subramaniyan dan Prema 2002, tetapi tidak jauh berbeda dengan xilanase Bacillus subtilis galur PAP115 13.34 nkatml Bernier et al. 1983. Namun demikian, xilanase ekstrak kasar yang dihasilkan oleh jamur dan bakteri pendegradasi hemiselulosa, pada umumnya terdeteksi adanya aktivitas selulase Subramaniyan dan Prema 2002. Menurut Meryandini 2005, xilanase ekstrak kasar dari Streptomyces sp. isolat 45I-3 tidak memiliki aktivitas terhadap CMC. Hal ini juga dilaporkan pada Streptomyces galbus NR Kansoh dan Nagieb 2004, Streptomyces sp. S38 Georis et al. 2000, Streptomyces halstedii JM8 Ruiz-Arribas et al. 1995, Streptomyces viridosporus T7a Magnuson dan Crawford 1997. Ketidakberadaan selulase pada aplikasi xilanase untuk industri pulp kertas sangatlah diharapkan agar struktur selulosa kertas dapat dipertahankan.

4.2. Penentuan Konsentrasi Larutan Eudragit

TM S100 Penentuan konsentrasi larutan Eudragit TM S100 dilakukan untuk mendapatkan konsentrasi Eudragit TM S100 yang optimum untuk mengikat xilanase. Pada percobaan ini larutan xilanase ditambahkan ke dalam berbagai konsentrasi Eudragit TM S100, yaitu 0.1 , 0.5 , 1.0 , 2.0 dan 3.0 bv. Berdasarkan percobaan ini Gambar 5, konsentrasi 1.0 bv merupakan konsentrasi Eudragit TM S100 yang optimum untuk mengikat xilanase ekstrak kasar, karena memiliki persentase efektivitas amobilisasi yang tertinggi, yaitu 15.51 Lampiran 6. 2 4 6 8 10 12 14 16 18 0.1 0.5 1.0 1.5 2.0 3.0 Konsentrasi Larutan Eudragit TM S100 E fekt ivi tas A m o b il isas i Hasil yang diperoleh tersebut lebih rendah dibandingkan dengan hasil-hasil penelitian sebelumnya. Gawande dan Kamat 1999 melaporkan penggunaan polimer anionik Eudragit TM S100 dengan konsentrasi 1 bv berhasil mengikat xilanase dari Aspergillus sp. Galur 5 dan Galur 44 sebesar 70 dan 80 . Bahkan Ai et al. 2005 mendapatkan efektivitas amobilisasi mencapai 92 dengan menggunakan xilanase dari Streptomyces olivaceoviridis E-86 yang ditumbuhkan Gambar 5. Pengaruh Konsentrasi L Amobilisasi dalam media xilan tongkol jagung. arutan Eudragit TM S100 terhadap Efektivitas Keberhasilan pengikatan xilanase pada polimer anionik Eudragit TM S100 dipengaruhi oleh titik isoelektrik pI xilanase dengan sifat polimer anionik Eudragit TM S100. Apabila nilai pI enzim = nilai pH larutan polimer maka protein enzim menjadi tidak bermuatan. Protein enzim akan bermuatan positif jika nilai pH larutan polimer nilai pI enzim, dan sebaliknya akan bermuatan negatif jika nilai pH larutan polimer nilai pI enzim. Eudragit TM S100 merupakan polimer asam metakrilat dan metilmetakrilat yang bersifat mudah larut dalam larutan dengan pH 5.5 sehingga polimer akan mengalami ionisasi dimana gugus karboksil akan melepaskan ion Hidrogen sehingga menjadi bermuatan negatif COO - Roy et al. 2004, seperti tersaji pada Gambar 6. Proses pengikatan xilanase pada polimer anionik Eudragit TM pada kondisi polimer berikatan d git TM S100. Hal ini disebabkan muatan protein xilanase akan bermuatan netral atau negatif sama dengan muatan Eudragit TM S100. v mobilisasi xilanase ekstrak kasar dengan Eudragit TM S100 konsentrasi 1 bv menggunakan beberapa kombinasi volume xilanase ekstrak kasar dengan Eudragit TM S100 1 bv, yaitu kombinasi 6 : 1, 5 : 1, 4 : 1, 3 : 2, 3 : 1, 2 : 1, 1 : 1, 1 : 2, 1 : 3, 2 mobilisasi pada penelitian ini Gambar 7 menunjukkan variasi pengikatan enzim dengan jumlah enzim yang teradsorpsi pada polimer. Kombinasi 5 : 1 tampaknya memberikan kesempatan lebih banyak bagi enzim untuk teradsorpsi pada polimer Eudragit TM S100. ariasi konsentrasi xilanase yang melekat pada matriks mempengaruhi aktivitas xilanase amobil. Rasio xilanase dan Eudragit TM S100 1 bv sebesar 5 : 1 menunjukkan kombina mpatan penggabungan antara substrat dan enzim amobil menjadi lebih banyak, karena densitas enzim pada polimer me fluorescens dan spektroskopi UV terhadap xilanase amobil menunjukkan s load S100 berlangsung terionisasi pH 5.5 sehingga apabila nilai pI enzim ≤ 5.5 maka akan sulit engan Eudra Gambar 6 . Proses Ionisasi Polimer Anionik Eudragit TM S100 Roy et al. 2004 4.3. Penentuan Rasio Volume Xilanase dengan Eudragit TM S100 1 b Bentuk Tidak terlarut Bentuk Terlarut A : 3 dan 1 : 4. Hasil a V si dimana kese ningkat. Sardar et al. 2000 memperlihatkan hasil spektroskopi perubahan struktural yang signifikan, sebagai hasil amobilisa i dengan muatan protein yang berbeda terhadap matriksnya. Menurut Bosley dan Peilow 5 10 15 20 25 1 : 4 1 : 3 1 : 2 2 : 3 1 : 1 3 : 2 2 : 1 3 : 1 4 : 1 5 : 1 6 : 1 Rasio Volume Xilanase Ekstrak Kasar : Larutan Eudragit TM S100 1 bv E fe k tiv it a s A m o b il is eraksi yang Gambar 7. Pengaruh Rasio Volume Xilanase Ekstrak Kasar dengan Larutan Eudragit TM S100 1 bv terhadap Efektivitas Amobilisasi Peningkatan pada volume enzim 6 : 1 menurunkan efektivitas amobilisasi karena enzim yang mengumpul crowding mengurangi kesempatan bagi substrat molekul makro untuk menempel pada sisi aktif enzim. Fenomena sterik t dan fluks produk. Laju transfer massa pada substrat dan produk menuju dan dari 2000 dalam Roy et al. 2004, pada muatan enzim yang sedikit, terdapat banyak permukaan matriks yang tersedia. Molekul enzim cenderung untuk memaksimalkan kontak dengan permukaan dan menyebabkan distorsi konformasi pada proses ini. Pada awalnya, molekul enzim akan menempati area dengan afinitas tinggi pada permukaan matriks, sehingga menimbulkan int 30 35 40 a s i mendorong terjadinya kehilangan aktivitas yang lebih besar. Faktor-faktor ini selanjutnya akan berkurang sejalan dengan peningkatan konsentrasi enzim. crowding di sekeliling situs aktif ini telah banyak dikaji dan umumnya memang banyak terjadi pada substrat molekuler makro seperti pada xilan Sardar et al 2000. Hasil serupa pernah dilaporkan pada enzim amobil lain, yaitu papain Hyndman et al. 1992, siklodekstrin glukositransferase Abdel-Naby 1999 dan kitinase Wang dan Chio 1998. Berdasarkan hasil penentuan kondisi imobilisasi yang optimum pada matriks Eudragit TM S100 Lampiran 6 dan 7, diketahui bahwa xilanase amobil memiliki aktivitas yang lebih rendah dibandingkan xilanase bebas. Hal ini kemungkinan disebabkan oleh limitasipenghambatan difusional pada substra matriks amobilisasi bukanlah suatu masalah bagi enzim bebas. Agar substrat dapat bereaksi dengan enzim amobil, substrat harus berdifusi masuk ke dalam matriks dan produk harus berdifusi keluar. Proses difusional pada enzim amobil ini seringkali menyebabkan konsentrasi substrat yang lebih rendah dan konsentrasi produk yang lebih tinggi pada situs aktif enzim dibandingkan pada larutan enzim bebas. Masalah difusional ini menjadi lebih signifikan pada substrat molekul makro, seperti xilan Siso et al Meskipun aktivitas lebih rendah, tapi pengikatan matriks dengan enzim menggunakan Eudragit TM S100 menunjukkan stabilitas enzim amobil terhadap pemaparan berulang dari beberapa siklus perubahan pH Gambar 15. Proses amobilisasi menyebabkan penurunan aktivitas xilanase menjadi xilanase amobil. Dalam Sardar et al. 2000, data spektroskopi CD Circular Dichr ejauh ini dilaporkan lebih rendah dibandingkan denga rubahan keadaan ion enzim dapat terjadi pada gugus asam amino yang berfungsi katalitik . 1990. 23.97 . Hal ini kemungkinan akibat terjadinya perubahan konformasi pada oism pada panjang gelombang 272 nm menunjukkan perubahan absorbansi yang drastis pada xilanase amobil dibandingkan xilanase bebas. Absorbansi sekitar 272 nm merefleksikan lingkungan mikro sekitar gugus asam amino pada protein dan mengkorelasikan faktor struktural dengan faktor efektivitas amobilisasi. Oleh karena itu, perubahan absorbansi tersebut menunjukkan perubahan konformasi yang disebabkan oleh proses adsorpsi pada amobilisasi. Aktivitas xilanase amobil s n enzim amobil lain Roy et al. 1984, Abdel Naby 1993, Tyagi dan Gupta 1995.

4.4. Pengujian pH Optimum