BAB III METODE PENELITIAN
Penelitian ini menggunakan metode eksperimental dengan tahapan penelitian yaitu penyiapan sampel, pembuatan larutan pereaksi, skrining
fitokimia, karakteristik simplisia, pembuatan ekstrak etanol rimpang lengkuas merah, penyiapan hewan uji, pengujian efek antimutagenik pada mencit, dan
pengolahan data. Data hasil penelitian dianalisis secara ANOVA analisis variansi dan dilanjutkan dengan uji Post Hoc Tukey meggunakan program
SPSS Statistical Product and Service Solution versi 18.
3.1 Alat dan Bahan 3.1.1 Alat-alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi alat-alat gelas laboratorium, aluminium foil, blender, lemari pengering, oven listrik, neraca
digital, seperangkat alat destilasi penetapan kadar air, desikator, stopwatch, mortir dan stamfer, rotary evaporator, freeze dryer, neraca hewan, spuit ukuran
1 ml, oral sonde, alat bedah, mikroskop, sentrifugator, politube, mikrotube,
kamera digital MDCE-5A dan papan fibrasi mencit. 3.1.2 Bahan-bahan
Bahan-bahan yang digunakan adalah yaitu rimpang lengkuas merah, monosodium glutamat, makanan hewan berupa pelet, dan bahan kimia
berkualitas pro analisis seperti, asam asetat anhidrat, asam klorida pekat, asam
Universitas Sumatera Utara
nitrat, asam sulfat pekat, besi III klorida, bismut nitrat, iodium, isopropanol, kalium iodida, kloroform, kloralhidrat, larutan giemsa, merkuri II klorida,
metanol, natrium hidroksida, serbuk magnesium, serbuk seng, timbal II asetat, toluena, n-heksan dan
α-naftol, eter minyak tanah, heparin, Air suling, etanol 96, etil asetat, carboxy metil cellulosa CMC, minyak immersi, HCL
2N, serum darah sapi.
3.2 Hewan Percobaan
Hewan percobaan yang digunakan dalam penelitian adalah mencit jantan dengan berat 25-35 gram berumur 2-3 bulan. Sebelum digunakan
sebagai hewan percobaan, semua mencit dipelihara terlebih dahulu selama kurang lebih satu minggu untuk penyesuaian lingkungan, mengontrol
kesehatan dan berat badan serta menyeragamkan makanannya Kusmardi dan Enif, 2007.
3.3 Pembuatan Larutan Pereaksi 3.3.1 Pereaksi mayer
Sebanyak 5 g kalium iodida dalam 10 ml air suling kemudian ditambahkan larutan 1,36 g merkuri II klorida dalam 60 ml air suling.
Larutan dikocok dan ditambahkan air suling hingga 100 ml Ditjen POM, 1995.
3.3.2 Pereaksi Dragendorff
Sebanyak 8 g bismut nitrat dilarutkan dalam asam nitrat pekat 20 ml kemudian dicampur dengan larutan kalium iodida sebanyak 27,2 g dalam 50 ml
air suling. Campuran didiamkan sampai memisah sempurna. Larutan jernih
Universitas Sumatera Utara
diambil dan diencerkan dengan air secukupnya hingga 100 ml Ditjen POM, 1995.
3.3.3 Pereaksi Bouchardat
Sebanyak 4 g kalium iodida dilarutkan dalam 20 ml air suling kemudian ditambah 2 g iodium sambil diaduk sampai larut, lalu ditambah air suling
hingga100 ml Ditjen POM, 1995. 3.3.4 Pereaksi Molish
Sebanyak 3 g α-naftol dilarutkan dalam asam nitrat 0,5 N secukupnya
hingga diperoleh larutan 100 ml Ditjen POM, 1995.
3.3.5 Pereaksi Liebermann-Burchard
Sebanyak 2 bagian asam asetat anhidrat dicampurkan dengan 1 bagian asam sulfat pekat Harborne, 1987.
3.3.6 Pereaksi besi III klorida 1
Sebanyak 1 g besi III klorida dilarutkan dalam air suling hingga 100 ml kemudian disaring Ditjen POM, 1995.
3.3.7 Pereaksi timbal II asetat
Sebanyak 15,17 g timbal II asetat ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air suling hingga 100 ml Ditjen POM, 1995.
3.3.8 Pereaksi natrium hidroksida 2 N
Sebanyak 8 g kristal natrium hidroksida dilarutkan dalam air suling hingga diperoleh larutan 100 ml Ditjen POM, 1979.
3.3.9 Pereaksi asam klorida 2 N
Universitas Sumatera Utara
Sebanyak 17 ml asam klorida pekat diencerkan dengan air suling sampai 100 ml Ditjen POM, 1979.
3.4 Penyiapan Sampel
Penyiapan sampel meliputi pengambilan sampel, identifikasi sampel, dan pengolahan sampel.
3.4.1 Pengambilan sampel
Pengambilan sampel dilakukan secara purposif yaitu tanpa membandingkan dengan sampel yang sama dari daerah lain. Sampel diperoleh
dari Pasar Tradisional Pasar sore padang bulan, Medan, Provinsi Sumatera Utara.
3.4.2 Identifikasi sampel
Identifikasi sampel dilakukan di Herbarium Medanense MEDA, Universitas Sumatera Utara.
3.4.3 Pengolahan sampel
Sampel rimpang lengkuas merah dicuci kemudian ditiriskan dan ditimbang beratnya sebagai berat basah. Selanjutnya rimpang dirajang, lalu
dikeringkan hingga kering ditandai rimpang mudah dipatahkan, kemudian ditimbang lagi sebagai berat kering, kemudian diblender dan ditimbang sebagai
berat serbuk simplisia. Serbuk simplisia dimasukkan ke dalam kantong plastik, diberi etiket dan disimpan di tempat yang kering.
3.5 Pemeriksaan Karakterisasi Simplisia
Pemeriksaan karakterisasi simplisia meliputi pemeriksaan makroskopik dan mikroskopik, penetapan kadar air, penetapan kadar sari yang larut dalam
Universitas Sumatera Utara
air, penetapan kadar sari yang larut dalam etanol, penetapan kadar abu total, dan penetapan kadar abu tidak larut asam Ditjen POM, 1995; WHO, 1998.
3.5.1 Pemeriksaan makroskopik
Pemeriksaan makroskopik dilakukan pada simplisia segar yang meliputi pemeriksaan bentuk, bau, rasa dan warna.
3.5.2 Pemeriksaan mikroskopik
Pemeriksaan mikroskopik terhadap serbuk simplisia dilakukan dengan cara meneteskan kloralhidrat di atas kaca objek, kemudian di atasnya
diletakkan serbuk simplisia, lalu ditutup dengan kaca penutup dan dilihat di bawah mikroskop. Pemeriksaan mikroskopik untuk melihat adanya butir pati
dilakukan di dalam media air. Pemeriksaan mikroskopik untuk melihat adanya minyak atsiri dilakukan dengan penambahan sudan III.
3.5.3 Penetapan kadar air
Penetapan kadar air dilakukan dengan metode Azeotropi destilasi toluen. Alat terdiri dari labu alas 500 ml, alat penampung, pendingin, tabung
penyambung dan tabung penerima. Cara penetapan:
Pada labu bulat dimasukkan 200 ml toluena dan 2 ml air suling, didestilasi selama 2 jam. Setelah itu toluena didinginkan dan volume air di
dalam tabung penerimaan dibaca. Kemudian ke dalam labu dimasukkan 5 g serbuk simplisia yang telah ditimbang, lalu dipanaskan hati-hati selama 15
menit. Setelah toluena mulai mendidih, kecepatan tetesan diatur, lebih kurang 2 tetes tiap detik, hingga sebagian besar air tersuling. Kemudian kecepatan
Universitas Sumatera Utara
penyulingan dinaikkan hingga 4 tetes tiap detik. Setelah 2 jam didestilasi, kemudian toluen dibiarkan dingin, bagian dalam pendingin dibilas dengan
toluena yang telah dijenuhkan. Destilasi dilanjutkan selama 5 menit, kemudian tabung penerima dibiarkan mendingin sampai suhu kamar. Setelah air dan
toluena memisah sempurna, volume air dibaca dengan ketelitian 0,05 ml. Selisih kedua volume air yang dibaca sesuai dengan kandungan air yang
terdapat dalam bahan yang diperiksa. Kadar air dihitung dalam persen WHO, 1998.
3.5.4 Penetapan kadar sari yang larut dalam air
Sebanyak 5 g serbuk yang telah dikeringkan, dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml air kloroform 2,5 ml kloroform dalam air suling 1000 ml dalam
labu bersumbat sambil sesekali dikocok selama 6 jam pertama, dibiarkan selama 18 jam, kemudian disaring. Diuapkan 20 ml filtrat sampai kering dalam
cawan penguap yang berdasar rata yang telah dipanaskan dan ditara. Sisa dipanaskan pada suhu 105°C sampai bobot tetap. Kadar dalam persen sari yang
larut dalam air dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan diudara Ditjen POM, 1995.
3.5.5 Penetapan kadar sari yang larut dalam etanol
Sebanyak 5 g serbuk yang telah dikeringkan di udara, dimaserasi selama 24 jam dengan etanol 96 dalam labu bersumbat sambil sesekali
dikocok selama 6 jam pertama, dibiarkan selama 18 jam, kemudian disaring. Diuapkan 20 ml filtrat sampai kering dalam cawan penguap yang berdasar
rata yang telah dipanaskan dan ditara. Sisa dipanaskan pada suhu 105°C
Universitas Sumatera Utara
sampai bobot tetap. Kadar dalam persen sari yang larut dalam etanol 96 dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan diudara Ditjen POM, 1995.
3.5.6 Penetapan kadar abu total
Sebanyak 2 g serbuk yang telah digerus dan ditimbang seksama dimasukkan dalam krus platina atau krus silikat yang telah dipijar dan ditara,
kemudian diratakan. Krus dipijar perlahan-lahan sampai arang habis, pemijaran dilakukan pada suhu 600°C selama 3 jam. Kemudian didinginkan dan
ditimbang sampai diperoleh bobot tetap. Kadar abu dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan diudara Ditjen POM, 1995.
3.5.7 Penetapan kadar abu tidak larut asam
Abu yang telah diperoleh dalam penetapan abu dididihkan dengan 25 ml asam klorida encer selama 5 menit, bagian yang tidak larut dalam asam
dikumpulkan, disaring dengan kertas masir atau kertas saring bebas abu, cuci dengan air panas, dipijarkan sampai bobot tetap, kemudian didinginkan dan
ditimbang. Kadar abu yang tidak larut dalam asam dihitung terhadap bobot yang dikeringkan di udara Ditjen POM, 1995.
3.6 Pemeriksaan Skrining Fitokimia Serbuk Simplisia 3.6.1 Pemeriksaan alkaloid
Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 0,5 g kemudian ditambahkan 1 ml asam klorida 2 N dan 9 ml air suling, dipanaskan di atas penangas air selama 2
menit, didinginkan lalu disaring. Filtrat yang diperoleh dipakai untuk tes alkaloid. Diambil 3 tabung
reaksi, lalu kedalamnya dimasukkan 0,5 filtrat. Pada masing-masing reaksi:
Universitas Sumatera Utara
a. Ditambahkan 2 tetes larutan pereksi Mayer akan terbentuk endapan
berwarna putih atau kuning b.
Ditambahkan 2 tetes larutan pereksi Bouchardat akan terbentuk endapan berwarna coklat-hitam
c. Ditambahkan 2 tetes larutan pereksi Dragendorff akan terbentuk endapan
berwarna merah atau jingga Alkaloid dinyatakan positif jika terjadi endapan atau paling sedikit dua
atau tiga dari percobaan di atas Ditjen POM, 1995.
3.6.2 Pemeriksaan flavonoid
Larutan Percobaan: Sebanyak 0,5 g sampel disari dengan 10 ml metanol lalu direfluks
selama 10 menit, disaring panas-panas melalui kertas saring berlipat, filtrat diencerkan dengan 10 ml air suling. Setelah dingin ditambah 5 ml eter minyak
tanah, dikocok hati-hati, didiamkan. Lapisan metanol diambil, diuapkan pada temperatur 40
o
C. Sisa dilarutkan dalam 5 ml etil asetat, disaring. Cara Percobaan:
a. Satu ml larutan percobaan diuapkan hingga kering, sisanya dilarutkan
dalam 1-2 ml etanol 96, ditambahkan 0,5 g serbuk seng dan 2 ml asam klorida 2N, didiamkan selama satu menit. Ditambahkan 10 ml asam klorida
pekat, jika dalam waktu 2-5 menit terjadi warna merah intensif menunjukkan adanya flavonoid glikosida-3-flavonol.
b. Satu ml larutan percobaan diuapkan hingga kering, sisanya dilarutkan
dalam 1 ml etanol 96, ditambahkan 0,1 g magnesium dan 10 ml asam
Universitas Sumatera Utara
klorida pekat, terjadi warna merah jingga sampai merah ungu menunjukkan adanya flavonoid Ditjen POM, 1995.
3.6.3 Pemeriksaan tanin
Sebanyak 0,5 g sampel disari dengan 10 ml air suling, disaring lalu filtratnya diencerkan dengan air suling sampai tidak berwarna. Diambil 2 ml
larutan lalu ditambahkan 1 sampai 2 tetes pereaksi besi III klorida. Terjadi warna biru atau hijau kehitaman menunjukkan adanya tanin Farnsworth,
1966.
3.6.4 Pemeriksaan glikosida
Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 3 g kemudian disari dengan 30 ml campuran 7 bagian volume etanol 96 dan 3 bagian volume air suling,
selanjutnya ditambahkan 10 ml HCl 2 N, direfluks selama 10 menit, didinginkan dan disaring. Pada 30 ml filtrat ditambahkan 25 ml air suling dan
25 ml timbal II asetat 0,4 M, dikocok, didiamkan selama 5 menit lalu disaring. Filtrat disari sebanyak 3 kali, tiap kali dengan 20 ml campuran 3
bagian volume kloroform dan 2 bagian volume isopropanol. Diambil lapisan air kemudian ditambahkan 2 ml air dan 5 tetes pereaksi Molisch, ditambahkan
hati-hati 2 ml asam sulfat pekat terbentuk cincin warna ungu pada batas kedua cairan menunjukkan adanya ikatan gula Ditjen POM, 1995.
3.6.5 Pemeriksaan saponin
Sebanyak 0,5 g sampel dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan 10 ml air suling panas, didinginkan kemudian dikocok kuat-kuat
selama 10 detik, timbul busa yang mantap tidak kurang dari 10 menit setinggi
Universitas Sumatera Utara
1-10 cm. Ditambahkan 1 tetes larutan asam klorida 2 N, bila buih tidak hilang menunjukkan adanya saponin Ditjen POM, 1995.
3.6.6 Pemeriksaan steroid-triterpenoid
Sebanyak 1 g sampel dimaserasi dengan 20 ml eter selama 2 jam, lalu disaring. Filtrat diuapkan dalam cawan penguap. Pada sisa dalam cawan
penguap ditambahkan 2 tetes asam asetat anhidrat dan 1 tetes asam sulfat pekat. Timbul warna ungu atau merah kemudian berubah menjadi hijau biru
menunjukkan adanya steroid-triterpenoid Harborne, 1987.
3.7 Pembuatan Ekstrak Etanol Rimpang Lengkuas Merah EERLM Pembuatan ekstrak etanol rimpang lengkuas merah dilakukan secara
maserasi dengan menggunakan pelarut etanol 96. Menurut Ditjen POM, 1979 caranya:
Sebanyak 958,84 g 10 bagian serbuk simplisia dimasukkan kedalam bejana, dituangi dengan 7,2 liter 75 bagian etanol, ditutup, dibiarkan selama 5
hari terlindung dari cahaya sambil sesekali diaduk, diserkai. Ampas dicuci dengan etanol secukupnya hingga diperoleh 9,6 liter 100 bagian. Pindahkan
kedalam bejana tertutup, dibiarkan ditempat sejuk terlindung dari cahaya selama 2 hari. Saring. Pemekatan ekstrak dilakukan dengan alat rotary
evaporator pada suhu 40
o
C sampai diperoleh ekstrak kental.
3.8 Pengujian Efek Antimutagenik
Pengujian efek antimutagenik meliputi penyiapan hewan percobaan, penyiapan suspensi CMC 1, penyiapan suspensi ekstrak rimpang lengkuas
merah, penyiapan makanan hewan berupa pelet, penyiapan serum darah sapi,
Universitas Sumatera Utara
pengujian pada mencit, pembuatan preparat apusan sumsum tulang femur dan pengamatan apusan pada mikroskop.
3.8.1 Penyiapan hewan percobaan
Hewan yang digunakan adalah mencit dengan berat 25-35 g dibagi 5 kelompok, setiap kelompok terdiri dari 5 ekor mencit. Sebelum digunakan
sebagai hewan percobaan, semua mencit dipelihara terlebih dahulu selama kurang lebih satu minggu untuk menyesuaikan lingkungan, mengontrol
kesehatan dan berat badan serta menyeragamkan makanannya Kusmardi dan Enif, 2007.
3.8.2 Penyiapan suspensi CMC 1
Pembuatan suspensi CMC 1 bv dilakukan dengan cara sebagai berikut: sebanyak 1 g CMC ditaburkan ke dalam lumpang yang berisi air suling
panas sebanyak 20 ml. Didiamkan selama 15 menit hingga diperoleh masa yang transparan, digerus hingga berbentuk gel dan diencerkan dengan sedikit
air, kemudian dituang ke dalam labu tentukur 100 ml, ditambah air suling sampai batas tanda.
3.8.3 Penyiapan suspensi ekstrak Etanol Rimpang Lengkuas Merah EERLM
Pembuatan suspensi EERLM dilakukan dengan cara berikut: sebanyak 3 g EERLM dimasukkan kedalam lumpang. Ditambahakn CMC 1, kemudian
digerus sampai homgen. Dituangkan kedalam labu tentukur 100 ml, dan dicukupkan sampai batas tanda. Maka diperoleh suspensi EERLM 3.
Universitas Sumatera Utara
3.8.4 Penyiapan larutan monosodium glutamat MSG 20
Pembuatan larutan MSG dilakukan dengan cara sebagai berikut: ditimbang 20 g MSG kemudian dimasukkan kedalam labu tentukur 100 ml.
Dilarutkan dengan aquadest sampai batas tanda.
3.8.5 Pembuatan serum darah sapi SDS
Serum diperoleh dari darah sapi segar. Darah ditampung langsung menggunakan vakum tube saat penyembelihan hewan. Vakum tube ditutup
dan didiamkan lebih kurang 30 menit, kemudian disentrifuge dengan kecepatan 2000 rpm selama 15 menit. Diambil cairan yang berwarna bening
kekuning-kuningan bagian atas yang merupakan serumnya.
3.8.6 Pengujian aktivitas antimutagenik pada mencit penelitian
Pengujian aktivitas antimutagenik dilakukan dengan cara uji
mikronukleus dengan modifikasi. Hewan percobaan dikelompokkan menjadi 5
kelompok, masing-masing terdiri dari 5 ekor hewan percobaan. Kelompok tersebut adalah:
Kelompok I: Kontrol normal, diberikan suspensi CMC 5 mgmencit secara oral, selama 21 hari.
Kelompok II: Kontrol positif, diinduksi dengan MSG monosodium glutamat dengan dosis 5460 mgkg BB selama 14 hari secara
intraperitonial dan hari kelimabelas diberikan suspensi CMC 5 mgmencit secara oral selama tujuh hari.
Kelompok III: Perlakuan, diinduksi dengan MSG monosodium glutamat dengan dosis 5460 mgkg BB selama 14 hari secara
Universitas Sumatera Utara
intraperitonial dan hari kelimabelas diberikan suspensi EERLM dengan dosis 200 mgkg BB secara oral selama tujuh hari.
Kelompok IV : Perlakuan, diinduksi dengan MSG monosodium glutamat dengan dosis 5460 mgkg BB selama 14 hari secara
intraperitonial dan hari kelimabelas diberikan suspensi EERLM dengan dosis 400 mgkg BB secara oral selama tujuh hari.
Kelompok V : Perlakuan, diinduksi dengan MSG monosodium glutamat dengan dosis 5460 mgkg BB selama 14 hari secara
intraperitonial dan hari kelimabelas diberikan suspensi EERLM dengan dosis 800 mgkg BB secara oral selama tujuh hari.
Hari ke 22 pemberian EERLM, semua mencit penelitian dibunuh dengan cara dislokasi leher dan diambil sumsum tulang femurnya dengan cara
diaspirasi menggunakan spuit yang berisi SDS sebanyak 0,3 ml dan ditampung di dalam mikrotube.
3.8.7 Pembuatan preparat apusan sumsum tulang femur
Campuran sumsum tulang dan SDS dalam mikrotub diputar di- sintrifuge dengan kecepatan 1200 rpm selama 5 menit, kemudian
supernatannya dibuang. Endapannya disuspensikan kembali dengan dua tetes SDS, kemudian satu tetes suspensi sel diambil dan diletakkan ke atas objek
glas, dengan menggunakan objek glas yang lain, sel dihapuskan menjadi preparat apusan. Kemudian slide dikeringkan, difiksasi dengan metanol selama
10 menit. Kemudian diberikan pewarna giemsa dibiarkan 30 menit, dibuang
Universitas Sumatera Utara
zat warna dengan dibilas dengan air yang mengalir kemudian apusan dikeringkan Khrisna, 2000; Sofyan, 2005.
3.8.8 Pengamatan apusan
Data pengamatan masing-masing hewan harus dipresentasikan dalam bentuk tabel. Jumlah eritrosit polikromatik bermikronukleus maupun tidak
bermikronukleus dihitung paling tidak sebanyak 200 sel dalam penelitian ini dihitung 200 sel EPA, 1998. Pengamatan dilakukan menggunakan
mikroskop dengan perbesaran 10 × 100 dengan bantuan minyak immersi Khrisna, 2000; Sofyan, 2005.
3.9 Analisis Data
Data hasil penellitian dianalisis dengan menggunakan program SPSS 18. Data hasil penelitian ditentukan homogenitas dan normalitasnya untuk
menentukan analisis statistik yang digunakan. Data dianalisis dengan menggunakan uji ANOVA satu arah dengan nilai signifikansi, p 0,05
dianggap signifikan. Kemudian dilakukan uji lanjutan Post Hoc Tukey untuk mengetahui melihat perbedaan jumlah rata-rata kritis mikronukleus antar
kelompok perlakuan.
Universitas Sumatera Utara
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil Identifikasi Tumbuhan
Tumbuhan yang diteliti telah diidentifikasi di Herbarium Medanense MEDA, Universitas Sumatera Utara. Hasil identifikasi tumbuhan yaitu
Alpinia purpurata K.schum. Surat hasil identifikasi dapat dilihat pada Lampiran 1, halaman 51.
4.2 Hasil Karakterisasi Simplisia
Hasil pemeriksaan makroskopik, rimpang tumbuhan lengkuas merah dicirikan dengan rimpang yang agak kecil, irisan rimpang berwarna kuning
dengan tepi berwarna merah, berserat kasar, berbau aromatik, serta berasa sangat tajam. Diameter kira-kira 2 cm. Gambar dapat dilihat pada Lampiran 3,
halaman 53. Hasil pemeriksaan makroskopik simplisia rimpang tanaman lengkuas
merah adalah bentuk agak pipih, bagian luar berwarna coklat kemerahan, bagian dalam berwarna putih kecoklatan. Mempunyai ukuran yang lebih kecil
dari irisan rimpang, berkerut dan keras. Diameter kira-kira 1 cm. Gambar dapaat dilihat pada Lampiran 3, halaman 53.
Hasil pemeriksaan mikroskopik serbuk simplisia rimpang tanaman lengkuas merah adalah terdapat fragmen pati berbentuk lonjong atau bulat
telur, sel parenkim berisi tetesan minyak atsiri, jaringan gabus serat dan pembuluh kayu. Gambar pengamatan mikroskopik simplisia rimpang lengkuas
merah dapat dilihat pada Gambar 4.1
Universitas Sumatera Utara
Kategori