PRODUKSI EMBRIO DOMBA IN VITRO MENGGUNAKAN OOSIT DARI OVARIUM DENGAN STATUS REPRODUKSI

4. PRODUKSI EMBRIO DOMBA IN VITRO MENGGUNAKAN OOSIT DARI OVARIUM DENGAN STATUS REPRODUKSI

BERBEDA ABSTRACT The aim of the present study was to investigate whether the reproductive status influenced the number of follicles, oocytes quality, nuclear maturation, fertilization and cleavage rates for ovine in vitro embryo production. The pairs of ovary were classified into four groups: 1 ovaries with Corpus Luteum CL and Dominant Follicle DF, 2 ovaries with CL, without DF, 3 ovaries with DF, without CL, 4 ovaries without both CL and DF. Oocytes were collected by slicing method in Phosphate Buffer Saline PBS medium supplemented with 5 Fetal Bovine Serum FBS and 100 IUml penicillin streptomycin. Oocytes were matured in Tissue Culture Medium TCM-199 supplemented with 10 Fetal Bovine Serum FBS, 10 IUml Follicle Stimulating Hormone FSH, 10 IUml Luteinizing Hormone LH, 1 ìgml Estradiol and 100 IUml penicillin- streptomycin. Oocytes were matured in 5 CO 2 incubator, 38 C for 24 h. Matured oocytes were fertilized 18 h in CR1aa supplemented with 0.6 BSA, 2.5 mM caffeine benzoate and 20 µ gml heparin. Zygotes were cultured in CR1aa supplemented with 10 FBS, 5 µ gml insulin and 100 IUml penicillin- streptomycin. Result of the experiments showed that there was no significant different P0.05 in the number of follicles were found from all groups of ovaries. The number of oocytes with good quality from pairs of ovary with CL and DF was 7.94 ± 2.59, significantly different P0.05 with pairs of ovary with DF without CL 4.40 ± 1.50. The maturation rate of oocytes with good quality were 75.51 from pairs of ovary with CL and DF and significantly different P0.05 with pairs of ovary with DF without CL 42.86. Fertilization and cleavage rates were similar P0.05 from all groups of ovaries. In conclusion, the reproductive status has significant effect in the number of good quality oocytes and on nuclear maturation rate, but not in fertilization and cleavage rate. ABSTRAK Penelitian dilakukan untuk mengetahui pengaruh status reproduksi ovarium yang ditandai dengan keberadaan corpus luteum CL dan folikel dominan FD terhadap jumlah folikel, kualitas oosit, tingkat pematangan inti, tingkat fertilisasi dan kemampuan pembelahan sel serta perkembangan embrio domba in vitro. Pasangan ovarium dari rumah potong hewan RPH dipisahkan menjadi empat kelompok, yaitu: 1 ovarium dengan CL dan FD, 2 ovarium dengan CL tanpa FD, 3 ovarium dengan FD tanpa CL dan 4 ovarium tanpa CL dan FD. Oosit dikoleksi dengan teknik pencacahan dalam medium Phosphate Buffer Saline PBS yang disuplementasi dengan Fetal Bovine Serum FBS 5 dan penicilin streptomycin 100 IUml. Oosit dimatangkan selama 24 jam, 38 ° C dalam inkubator CO 2 5, menggunakan medium TCM -199 yang disuplementasi dengan Fetal Bovine Serum FBS 10, Follicle Stimulating Hormone FSH 10 IUml, Luteinizing Hormone LH 10 IUml, Estradiol 1 µ gml dan penicilin streptomycin 100 IUml. Fertilisasi oosit dilakukan selama 18 jam dalam inkubator CO 2 5 menggunakan medium CR1aa yang disuplementasi dengan Bovine Serum Albumin BSA 0.6, caffeine benzoate 2.5 mM dan heparin 20 µ gml. Selanjutnya oosit dikultur dalam medium CR1aa yang disuplementasi dengan FBS 10, insulin 5 µ gml dan 100 IUml penicilin streptomycin. Hasil penelitian menunjukkan bahwa jumlah folikel tertinggi diperoleh dari kelompok ovarium dengan CL saja sebanyak 15.88 ± 10.68. Tidak terdapat perbedaan yang nyata P0.05 antara jumlah folikel dari masing-masing kelompok ovarium. Jumlah oosit dengan kualitas baik yang terkoleksi dari kelompok ovarium dengan CL dan FD sebesar 7.94 ± 2.59 berbeda nyata P0.05 dengan kelompok ovarium dengan FD tanpa CL 4.40 ± 1.50. Tingkat pematangan inti oosit dengan kualitas baik dari kelompok ovarium dengan CL dan FD 75.51 lebih tinggi P0.05 daripada kelompok ovarium dengan FD tanpa CL 42.86. Tidak ada perbedaan nyata P0.05 pada tingkat fertilisasi dan pembelahan serta perkembangan embrio dari keempat kelompok pasangan ovarium. Dari hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa status repr oduksi ovarium mempengaruhi jumlah oosit dengan kualitas baik dan tingkat pematangan inti oosit domba in vitro, namun tidak pada tingkat fertilisasi dan pembelahan embrio. PENDAHULUAN Banyak faktor yang mempengaruhi keberhasilan proses produksi embrio secara in vitro. Kondisi kultur, jenis medium, penambahan serum betina estrus, cairan folikel, fetal bovine serum FBS, penambahan hormon estradiol dan gonadotrophin, maupun menggunakan co-culture dengan sel granulosa atau sel oviduct sangat mempengaruhi keberhasilan fertilisasi dan perkembangan embrio pada tahap selanjutnya Machatkova et al. 1996. Keberhasilan proses produksi embrio secara in vitro juga sangat tergantung dari sumber oosit yang digunakan. Oosit tumbuh dalam lingkungan folikel yang berada pada ovarium dan mengikuti suatu siklus pertumbuhan tertentu. Pada sapi dan domba dapat terjadi beberapa kali gelombang folikel dalam satu siklus estrus. Umumnya pada domba terjadi dua hingga tiga kali gelombang folikel yang masing-masing dapat menghasilkan lebih dari satu folikel dominan FD Souza et al. 1998; Evans et al. 2002. Keberadaan folikel dominan akan menurunkan konsentrasi FSH Gonzalez-Bulnes et al. 2004 dan menyebabkan terjadinya tekanan terhadap pertumbuhan folikel lain yang tumbuh pada gelombang yang bersamaan sehingga akan mengalami regresi Varishaga et al. 1998. Selanjutnya folikel dominan akan mengalami ovulasi. Sisa folikel dominan yang telah ovulasi akan membentuk corpus luteum CL. Corpus luteum terdiri dari sel-sel yang akan menghasilkan hormon progesteron dan berguna dalam proses implantasi serta pemeliharaan kebuntingan. Keberadaan folikel dominan dan corpus luteum dalam ovarium akan memberikan pengaruh terhadap perkembangan folikel dan status ovarium. Untuk mengetahui pengaruh keberadaan CL dan FD pada pasangan ovarium perlu dilakukan penelitian dengan memisahkan setiap pasangan ovarium dari masing-masing individu. Oleh karena itu, penelitian ini dilakukan untuk mengetahui kemampuan oosit domba yang berasal dari ova rium individu dengan status reproduksi berbeda dalam proses produksi embrio domba in vitro. BAHAN DAN METODE Pematangan Oosit In Vitro Ovarium yang diperoleh dari rumah potong hewan RPH ditempatkan dalam medium transportasi NaCl fisiologis pada suhu 30 C dan dipisahkan dengan membedakan status reproduksi dari masing-masing pasangan ovarium. Pasangan ovarium dikelompokkan sebagai berikut: 1 ovarium dengan corpus luteum CL dan folikel dominan FD, 2 ovarium dengan CL tanpa FD, 3 ovarium dengan FD tanpa CL dan 4 ovarium tanpa CL dan FD Gambar 4.1. Gambar 4.1 Pengelompokkan ovarium berdasarkan status reproduksi individu. A. ovarium dengan CL dan FD, B. ovarium dengan CL tanpa FD, C. ovarium dengan FD tanpa CL dan D. ovarium tanpa CL dan FD. Ovarium tersebut dibawa ke laboratorium dalam waktu kurang dari tiga jam setelah pemotongan. Koleksi oosit dilakukan mengikuti metode Jaswandi et al. 2001 seperti halnya pada bab 3 hal 18. Selanjutnya oosit dimatangkan dalam medium TCM -199 Sigma, USA yang disuplementasi dengan FBS 10 , Follicle Stimulating Hormone FSH; Antrin ® , Denka Pharmaceutical Co., CL FD CL FD Kawasaki, Japan 10 IUml, Luteinizing Hormone LH; Chorulon ® , Intervet International B.V., Boxmer, Holland 10 IUml, Estradiol Oestradiol Benzoate ® , Intervet International B.V., Boxmer, Holland 1 ìgml dan penicillin-streptomycin Gibco, Grand Island, NY, USA 100 IUml. Pematangan oosit dilakukan dalam medium maturasi dalam bentuk drop masing-masing 50 µl untuk 10-15 oosit dan ditutup dengan mineral oil Sigma Chemical Co. St. Louis MO, USA dalam inkubator CO 2

5, 38 C selama 24 jam. Kapasitasi Spermatozoa dan Fertilisasi In Vitro