UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
memperoleh komponen campuran dalam jumlah memadai dalam keadaan murni.
Selama pemisahan kromatografi, solut individual akan membentuk profil konsentrasi yanng simetris atau dikenal juga dengan profil Gaussian
dalam arah aliran fase gerak. Profil dikenal juga dengan puncak atau pita, secara perlahan-lahan akan melebar dan sering juga membentuk profil yang
asimetrik karena solut-solut melanjutkan migrasinya ke fase diam Gandjar dan Rohman, 2007.
2.6.1 Kromatografi Lapis Tipis
Kromatografi lapis tipis KLT merupakan salah satu metode pilihan kromatografi secara fisikokimia. Kromatografi lapis tipis
merupakan bentuk kromatografi planar. Berbeda dengan kromatografi kolom yang mana fase diamnya dikemas di dalamnya, pada
kromatografi lapis tipis fase diamnya berupa lapisan yang seragam pada permukaan bidang datar yang didukung oleh lempeng kaca atau plat
aluminium. Kromatografi lapis tipis ini dapat dikatakan sebagai bentuk terbuka dari kromatografi kolom Gandjar dan Rohman, 2007.
Fase diam yang biasa digunakan dalam kromatografi lapis tipis adalah silika dan serbuk selulosa. Lempeng KLT telah tersedia di
pasaran dan telah ditambah dengan reagen fluoresen untuk memfasilitasi deteksi bercak solut. Selain itu lempeng KLT juga telah
ditambahkan dengan agen pengikat seperti kalsium sulfat. Sedangkan fase gerak yang digunakan harus memiliki kemurnian yang sangat
tinggi. Hal ini dikarenakan kromatografi lapis tipis merupakan teknik yang sensitif Gandjar dan Rohman, 2007.
Fase gerak pada kromatografi lapis tipis dapat dipilih menggunakan sistem yang paling sederhana ialah campuran 2 pelarut
organik karena daya elusi campuran kedua pelarut ini dapat sudah diatur sehingga pemisahan dapat terjadi secara optimal Gandjar dan
Rohman, 2007.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Pemisahan pada kromatografi lapis tipis akan optimal jika sampel ditotolkan dengan ukuran bercak sekecil dan sesempit mungkin.
Penotolan sampel yang tidak tepat akan menyebabkan bercak yang menyebar dan puncak ganda. Untuk memperoleh reprodusibilitas,
volume sampel yang ditotolkan paling sedikit 0,5 µL. Jika volume sampel yang akan ditotolkan lebih besar dari 2-10 µL maka penotolan
harus dilakukan secara bertahap dengan dilakukan pengeringan antar totolan. Setelah sampel ditotolkan pada lempeng KLT, tahap
selanjutnya adalah mengembangkan sampel tersebut dalam suatu bejana kromatografi yang sebelumnya telah dijenuhkan dengan fase gerak
Gandjar dan Rohman, 2007. Selama proses pengembangan, bejana kromatografi harus
tertutup rapat. Jumlah volume fase gerak harus mampu mengelusi lempeng sampai ketinggian lempeng yang telah ditentukan. Setelah
lempeng terelusi, dilakukan deteksi bercak. Gandjar dan Rohman, 2007.
Gambar 2.2 Skema alat dan proses pemisahan KLT
Bercak pemisahan pada KLT umumnya merupakan bercak yang tidak berwarna. Untuk penentuannya dapat dilakukan secara kimia,
fisika, maupun biologi. Cara kimia yang biasa digunakan adalah dengan mereaksikan bercak dengan suatu pereaksi melalui cara penyemprotan
sehingga bercak menjadi jelas. Cara fisika yang dapat digunakan untuk menampakkan bercak adalah dengan fluoresensi sinar ultraviolet.
Chamber
Plat KLT Spot sampel
Pelarut Solvent Garis pensil
Penutup chamber
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Fluoresensi sinar ultraviolet terutama untuk senyawa yang dapat berfluoresensi, membuat bercak akan terlihat jelas. Jika senyawa tidak
dapat berfluoresensi maka bahan penyerapnya akan diberi indikator yang berfluoresensi, dengan demikian bercak akan kelihatan hitam
sedang latar belakangnya akan terlihat berfluoresensi Gandjar dan Rohman, 2007.
Kromatografi lapis tipis digunakan secara luas untuk analisis solut-solut organik terutama dalam bidang biokimia, farmasi, klinis,
forensik, baik untuk analisis kualitatif atau untuk analisis kuantitatif. Penggunaan umum kromatografi lapis tipis adalah untuk menentukan
banyaknya komponen dalam campuran, identifikasi senyawa, memantau berjalannya suatu reaksi, menentukan efektifitas pemurnian,
menentukan kondisi yang sesuai untuk kromatografi kolom, serta untuk memantau kromatografi kolom, melakukan screening sampel untuk
obat Gandjar dan Rohman, 2007. Harga Rf dihitung dengan menggunakan perbandingan
sebagaimana persamaan sebagai berikut:
Harga maksimum Rf adalah 1, sampel bermigrasi dengan kecepatan sama dengan fase gerak. Harga minimum Rf adalah 0, dan ini teramati
jika sampel tertahan pada posisi titik awal di permukaan fase diam Gandjar dan Rohman, 2007.
2.7 SPEKTROFOTOMETRI
