Adaptasi Hewan Coba Tahap Induksi STZ Tahap Nekropsi Pemotongan Jaringan

h. Tahap Pewarnaan

Cover glass, staining jar, mikroskop shimadzu T025A, spatula kaca, timer, xylol, hematoksilin, eosin, balsam Canada, dan H 2 SO 4.

i. Tahap Foto Jaringan

Kotak preparat, kamera preparat, komputer lab, DVD foto, mikroskop Olympus BX41

j. Untuk semua tahap histoteknik

Tisu dan tisu berpori

3.4.2. Adaptasi Hewan Coba

Setelah hewan tiba di laboratorium animal house, hewan coba diadaptasikan selama 14 hari dengan diberi makan dan minum ad libitum. Bedding dan kandang diganti dengan yang baru setiap 3 hari. 26

3.4.3. Tahap Induksi STZ

Pada hari ke-15 tikus dipuasakan selama 10 jam sebelum dilakukan penginduksian STZ 48-60 mgkgBB secara intraperitoneal. Kemudian dilakukan pengukuran kadar glukosa darah pada hari ke-5 setelah penginduksin STZ hari ke-21. Tikus yang digunakan pada percobaan ini yang memiliki kadar glukosa darah 200 mgdL. 26

3.4.4. Tahap Nekropsi

Siapkan alat dan bahan yang diperlukan. Kemudian ambil plastik yang sudah ditulis nama atau kode tikus dan organ. Tuangkan formalin- PBS 10 ke dalam plastik sekitar 20x volume jaringan sampel. Tikus dianastesi dengan cara dimasukkan ke dalam toples berisi kapas yang diberikan eter. Tunggu hingga tikus hilang kesadaran dengan cara memberikan rangsang nyeri pada telapak kaki tikus, bila tidak memberi respon maka efek anastesi sudah bekerja. Proses pembedahan dilakukan pada bagian abdominothoracal dan dilakukan nekropsi organ hepar, pankreas, ginjal. Organ dipotong dengan ketebalan 3-5 mm dan dimasukan ke dalam plastik yang berisi formalin-PBS 10. 28

3.4.5. Tahap Pemrosesan Jaringan

3.4.5.1. Dehidrasi

Proses dehidrasi menggunakan alkohol dengan variasi konsentrasi 50, 70, 80, 90. Pengenceran alkohol dilakukan dengan cara penghitungan sebagai berikut: 1. Pengenceran alkohol 50 = 500 ml alkohol 95 + 450 ml aquades 2. Pengenceran alkohol 70 = 700 ml alkohol 95 + 250 ml aquades 3. Pengenceran alkohol 80 = 800 ml akohol 95 + 150 ml aquades 4. Pengenceran alkohol 90 = 900 ml alkohol 95 + 50 ml aquades Setiap konsentrasi larutan alkohol tersebut ditempatkan pada 3 buah pot plastik masing-masing setinggi 23 pot plastik. Setiap pot dengan konsentrasi alkohol yang sama diberi label I, II, III untuk menandakan urutan proses dehidrasi. 21,28 Tahap dehidrasi dimulai dengan memasukkan potongan hepar, ginjal dan pankreas ke dalam pot plastik berlabel I, II, lalu III. Potongan organ direndam selama 15 menit secara berurutan ke dalam larutan alkohol 50, 70, 80, 90 dan 95. 21

3.4.5.2. Clearing

Tahapan Clearing bertujuan untuk mengeluarkan alkohol dari jaringan, karena alkohol dan parafin tidak dapat menyatu, sehingga larutan yang akan dimasukkan ke dalam jaringan dapat berikatan dengan parafin. Pada tahapan ini digunakan larutan toluol:alkohol 1:1 dan toluol murni. 21 Pertama, potongan organ dimasukan ke dalam larutan toluol:alkohol 1:1 dan direndam selama 25 menit. Kemudian potongan organ tersebut dipindahkan dan direndam kedalam toluol murni selama 60 menit hingga menjadi bening. Perendaman dalam toluol murni diperpanjang sampai potongan menjadi bening. Waktu perendaman dalam toluol murni paling lama selama 120 menit, karena akan menyebabkan pengerasan pada jaringan sehingga sulit untuk dilakukan pemotongan. 21

3.4.5.3. Embedding

Tahap embedding bertujuan untuk mengeluarkan cairan pada saat proses clearing dan menggantinya dengan parafin karena cairan saat proses clearing dapat mengkristal di dalam jaringan dan menyebabkan jaringan mudah robek saat tahap pemotongan. 21 Pertama, buat larutan toluol : parafin 50 ml : 50 ml. Kemudian bungkus organ menggunakan tissue berpori lalu rendam dalam larutan tersebut dan diamkan pada suhu ruangan selama 24 jam. Setelah itu cairkan parafin dengan suhu diantara 56-62 o C dan diberi label I, II, III dan IV. Masukkan potongan organ ke dalam larutan parafin secara berurutan, masing-masingnya selama 15 menit. 21

3.4.5.3. Blocking

Tahapan ini merupakan proses pembuatan blok preparat agar organ dapat dipotong dengan mikrotom. Cairkan parafin lalu tuangkan sedikit ke dalam cetakan blok. Masukan potongan organ secara perlahan dan kemudian tuangkan kembali parafin hingga merendam organ. 21

3.4.6. Pemotongan Jaringan

Proses ini merupakan pemotongan jaringan dengan menggunakan mikrotom. Pertama, rekatkan blok parafin diatas blok kayu dengan cara memanaskan salah satu sisi blok parafin hingga sedikit mencair kemudian langsung tempelkan. Letakan blok parafin dan balok kayu tersebut pada holder pemegang di mikrotom dan kencangkan. Lakukan pemotongan jaringan ini dengan ketebalan 6 µm. Jika diperlukan sudut kemiringan pisau mikrotom diatur pada sudut 20-30 derajat. 21 Setelah blok parafin berhasil dipotong, dengan kuas dan rendam potongan tersebut dalam waterbath dengan suhu air 37-40 o C hingga potongan terlihat meregang. Kemudian oleskan putih telur yang dicampur dengan gliserin pada kaca objek secukupnya. Lalu ambil potongan tersebut menggunakan kaca objek ke dalam waterbath. Letakan kaca objek tersebut pada hotplate dengan suhu 40-45 o C hingga kering. Setelah kering dan potongan melekat dengan kuat pada kaca objek, angkat dari hotplate dan potongan siap untuk diwarnai. 21

3.4.7. Tahapan Pewarnaan HE