Penetapan Kadar Sulfadoksin Dan Pirimetamin Dalam Sediaan Tablet Secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

(1)

PENETAPAN KADAR SULFADOKSIN DAN PIRIMETAMIN

DALAM SEDIAAN TABLET SECARA

KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

SKRIPSI

OLEH:

RIZKA RAMADHANI

NIM: 071524060

PROGRAM SARJANA EKSTENSI

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

MEDAN

(2)

PENETAPAN KADAR SULFADOKSIN DAN PIRIMETAMIN

DALAM SEDIAAN TABLET SECARA

KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

SKRIPSI

Diajukan untuk melengkapi salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi pada Fakultas Farmasi

Universitas Sumatera Utara

OLEH:

RIZKA RAMADHANI

NIM: 071524060

PROGRAM SARJANA EKSTENSI

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

MEDAN

(3)

PENGESAHAN SKRIPSI

PENETAPAN KADAR SULFADOKSIN DAN PIRIMETAMIN

DALAM SEDIAAN TABLET SECARA

KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

OLEH:

RIZKA RAMADHANI

NIM: 071524060

Dipertahankan di hadapan Panitia Penguji Fakultas Farmasi

USU

Pada tanggal : Maret 2010

Pembimbing I, Panitia penguji,

(Dra. Salbiah M.Si., Apt.) Prof. Dr. Rer. Nat. Effendy De Lux Putra, SU., Apt. NIP. 194810031987012001 NIP. 195306191983031001

Pembimbing II, Drs. Syafruddin, MS., Apt. NIP. 194811111976031003

(Drs. Fathur Rahman Harun, M.Si., Apt.) Dra. Muclisyam, Msi., Apt. NIP. 195201041980031002 NIP. 195006221980021001

Medan, Maret 2010 Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara

Dekan,

(Prof. Dr. Sumadio Hadisahputra, Apt.) NIP. 195311281983031002

(4)

PENETAPAN KADAR SULFADOKSIN DAN PIRIMETAMIN DALAM SEDIAAN TABLET SECARA

KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI Abstrak

Campuran Sulfadoksin dan Pirimetamin merupakan salah satu jenis kombinasi dalam sediaan tablet yang berkhasiat untuk pengobatan penyakit malaria. Pirimetamin efektif digunakan pada P. Malariae dan kombinasinya dengan Sulfadoksin dapat meningkatkan efektifitas Pirimetamin.

United States Pharmacopoeia 30 (2007) merekomendasikan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi pada penetapan kadar campuran Sulfadoksin dan Pirimetamin dalam sediaan tablet dengan metode baku dalam, menggunakan fase gerak asetonitril dan asam asetat glasial dalam air 1% (1:4). Pada penelitian ini telah dicoba menggunakan metode baku luar dengan memodifikasi berbagai perbandingan fase gerak asetonitril dan asam asetat glasial dalam air 1%. Metode baku luar lebih praktis bila dibandingkan dengan baku dalam.

Bahan baku Sulfadoksin dan Pirimetamin sebelum digunakan terlebih dahulu diidentifikasi menggunakan spektrofotometer FTIR, sedangkan terhadap sampel dilakukan identifikasi secara KCKT. Dari hasil uji identifikasi menunjukkan bahwa bahan baku dan sampel yang ditentukan adalah Sulfadoksin dan Pirimetamin.

Hasil uji linieritas dari kurva kalibrasi diperoleh koefisien korelasi, untuk Sulfadoksin 0,9996 dan untuk Pirimetamin 0,9997 dengan masing-masing persamaan regresi Y=30931,2X + 317656 dan Y=19319,1X + 37454,2. Dari hasil uji validasi metode yang digunakan memberikan hasil akurasi dan presisi yang dapat diterima dengan persen perolehan kembali untuk Sulfadoksin = 103,13% (RSD=2,093%) dan Pirimetamin = 93,17% (RSD=1,66%).

Hasil penetapan kadar dari tiga sampel dengan nama dagang dan generik, terdapat satu sampel nama dagang yang tidak memenuhi persyaratan tablet menurut USP 30 (2007), yaitu tidak kurang dari 90,0% dan tidak lebih dari 110,0% dari jumlah yang tertera pada etiket.

(5)

DETERMINATION DEGREE OF SULFADOXIN AND PYRIMETHAMIN IN TABLETS USING HIGH PERFORMANCE LIQUID

CHROMATOGRAPHY Abstract

Sulfadoxin and Pyrimethamin is a kind of combination tablet that have function for malaria treatment. Pyrimethamin is efectife to use P. Malariae and that combination with Sulfadoxin can improve the Pyrimethamin effectiviness.

United States Pharmacopoeia 30th edition 2007 to recommendate High Performance Liquid Chromatography in determination amount of combination Sulfadoxin and Pyrimethamin in tablet by internal standard method and using acetonitril-glasial acetic acid in water 1 % (1:4) mobile phase. In this research have tried external standard method and modification of mobile phase.External standard method is more practical when compared with the internal standard.

Before using the Sulfadoxin and Pyrimethamin raw meterial they have identified with spectrophotometer FTIR, while for the sample is identified by HPLC. From that identification test showed that raw material and samples are Sulfadoxin and Pyrimethamin.

Linearity test obtained correlation coefficien 0,9996 and 0,9997 with regression equation Y=30931,2X + 317656 and Y=19319,1X + 37454,2 for Sulfadoxin and Pyrimethamin respectively. From the validation method it was giving good accuracy and precision with percent recovery for Sulfadoxin 103,13% (RSD = 2,03%) and Pyrimethamin 93,17% (RSD = 1,66%).

The results of the three samples determination with trade and generic name, there is one sample with trade name did meet the requirements of USP 30th edition 2007, which is not less than 90,0% and not more than 110% of the labeled amount.

(6)

DAFTAR ISI

Halaman

JUDUL ... i

LEMBAR PENGESAHAN ... ii

ABSTRAK ... iii

ABSTRACT ... iv

DAFTAR ISI ... v

DAFTAR TABEL ... vii

DAFTAR GAMBAR ... viii

DAFTAR LAMPIRAN ... ix

BAB I PENDAHULUAN ... 1

1.1 Latar Belakang ... 1

1.2 Perumusan Masalah ... 2

1.3 Hipotesis ... 3

1.4 Tujuan ... 3

BAB II METODOLOGI PENELITIAN ... 4

2.1 Waktu dan Tempat Penelitian ... 4

2.2 Alat - alat ... 4

2.3 Bahan - bahan ... 4

2.4 Pengambilan Sampel ... 4

2.5 Prosedur penelitian ... 5

2.5.1 Uji identifikasi Sulfadoksin dan Pirimetamin baku pabrik (PT. Ifars) secara spektrofotometer IR ... 5

2.5.2 Penentuan kualitatif dan kuantitatif Sulfadoksin dan Pirimetamin menggunakan KCKT ... 5

2.5.2.1 Pembuatan fase gerak asetonitril-asam asetat Glasial dalam air 1% ... .. 5

(7)

2.5.2.3 Pembuatan larutan induk baku Suladoksin dan

Pirimetamin BPFI ... 6

2.5.2.4 Penyiapan alat Kromatografi Cair Kinerja Tinggi . 6

2.5.2.5 Penentuan perbandingan fase gerak ... 6

2.5.2.6 Uji kualitatif Sulfadoksin dan Pirimetamin menggunakan KCKT ... 7

2.5.2.6.1 Menentukan waktu tambat Sulfadoksin dan Pirimetamin BPFI... 7

2.5.2.6.2 Identifikasi sampel ... 7

2.5.2.7 Penentuan kuantitatif Sulfadoksin dan Pirimetamin Menggunakan KCKT ... 8

2.5.2.7.1 Pembuatan kurva kalibrasi Sulfadoksin BPFI ... 8

2.5.2.7.2 Pembuatan kurva kalibrasi Pirimetamin . 8

2.5.2.7.3 Penetapan kadar sampel ... 8

2.5.3 Penetuan Uji validasi dengan parameter akurasi dan Presisi ... 9

2.5.3.1 Uji akurasi dengan persen perolehan kembali ... 10

2.5.3.2 Uji Presisi ... 10

2.5.3.3 Penentuan Batas Deteksi (LOD) dan Batas Kuantitasi (LOQ) ... 10

2.5.3.4 Analisis data secara statistik ... 11

BAB III HASIL DAN PEMBAHASAN ... 12

BAB IV KESIMPULAN DAN SARAN... 24

4.1 Kesimpulan ... 24

4.2 Saran ... 24

DAFTAR PUSTAKA ... 25

(8)

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 1 Hasil optimasi fase gerak dengan parameter waktu tambat

Resolusi, tailing factor dan teoritical plate ... 16 Tabel 2 Data hasil penetapan kadar Sulfadoksin dan Pirimetamin

dalam sediaan tablet ... 21 Tabel 3 Data hasil perolehan kembali Sulfadoksin dan Pirimetamin

dengan metode penambahan bahan baku

(9)

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1 Spektrum Inframerah dari baku pabrik (PT. Ifars) Sulfadoksin .. 12

Gambar 2 Spektrum Inframerah baku pabrik Pirimetamin (PT. Ifars) ... 13

Gambar 3 Kromatogram hasil penyuntikkan larutan BPFI dengan Konsentrasi 500 mcg/ml Sulfadoksin dan 25 mcg/ml Pirimetamin, menggunakan perbandingan fase gerak Asetonitril-asam asetat glasial dalam air 1% (20:80) ... 15

Gambar 4 Kromatogram hasil penyuntikkan larutan BPFI dengan Konsentrasi 500 mcg/ml Sulfadoksin dan 25 mcg/ml Pirimetamin, menggunakan perbandingan fase gerak Asetonitril-asam asetat glasial dalam air 1%(30:70) ... 15

Gambar 5 Kromatogram hasil penyuntikkan larutan BPFI dengan Konsentrasi 500 mcg/ml Sulfadoksin dan 25 mcg/ml Pirimetamin, menggunakan perbandingan fase gerak Asetonitril-asam asetat glasial dalam air 1%(40:60) ... 16

Gambar 6 Kromatogram hasil penyuntikkan larutan BPFI Pirimetamin 25 mcg/ml dengan perbandingan asetonotril-asam asetat glasial dalam air 1% (40:60) ... 17

Gambar 7 Kromatogram hasil penyuntikan larutan BPFI Sulfadoksin 25 mcg/ml dengan perbandingan asetonotril-asam asetat glasial dalam air 1% (40:60) ... 18

Gambar 8 Kurva kalibrasi larutan Sulfadoksin BPFI versus luas puncak ... 19

Gambar 9 Kurva kalibrasi larutan Pirimetamin BPFI versusu luas puncak . 20

Gambar 10 Alat KCKT (Shimadzu) ... 26

Gambar 11 Syringe 100 μl (SGE)... 26

Gambar 12 Sonifikator (Branson 1510) ... 27

Gambar 13 Pompa vakum dan Penyaring fase gerak ... 27

Gambar 14 Spektrum Inframerah Sulfadoksin ... 28

(10)

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1 Gambar alat KCKT dan Syringe ... 26 Lampiran 2 Gambar Alat ultrasonic cleaner dan penyaring ... 27 Lampiran 3 Spektrum Inframerah Sulfadoksin pada literatur

Pharmaceutical Sub stance (UV/IR) ... 28 Lampiran 4 Spektrum Inframerah Pirimetamin pada literatur

Pharmaceutical Sub stance (UV/IR) ... 29 Lampiran 5 Perhitungan persamaan regresi dari kurva kalibrasi

Sulfadoksin ... 30 Lampiran 6 Perhitungan Batas Deteksi (LOD) dan Batas Kuantitasi (LOQ)

Sulfadoksin ... 31 Lampiran 7 Perhitungan persamaan regresi dari kurva kalibrasi

Pirimetamin ... 32 Lampiran 8 Perhitungan Batas Deteksi (LOD) dan Batas Kuantitasi (LOQ)

Pirimetamin ... 33 Lampiran 9 Contoh perhitungan kadar kombinasi Sulfadoksin dan

Pirimetamin dari tablet Fansidar (PT. Roche) ... 34 Lampiran 10 Kromatogram hasil dari penyuntikkan dari larutan tablet

Fansifar (PT. Roche) ... 35 Lampiran 11 Analisis data statistik untuk mencari kadar sebenarnya

dari penyuntikan larutan tablet Fansidar (PT. Rhoce) ... 38 Lampiran 12 Kromatogram hasil penyuntikkan dari larutan tablet

Sulfadoksin-Pirimetamin Generik (PT. Ifars) ... 40 Lampiran 13 Analisis data statistik untuk mencari kadar sebenarnya

Dari penyuntikan larutan tablet Sulfadoksin-Pirimetamin

Generik (PT. Ifars) ... 43 Lampiran 14 Kromatogram hasil penyuntikkan dari larutan tablet

Suldox (PT. Actavis)... 45 Lampiran 15 Analisis data statistik untuk mencari kadar sebenarnya

Dari penyuntikan larutan tablet Suldox (PT Actavis) ... 48 Lampiran 16 Hasil pengolahan data dari tablet Fansidar, Generik dan

Suldox ... 52 Lampiran 17 Kromatogram hasil penyuntikkan dari larutan tablet Fansidar

(PT. Roche ) dan bahan baku, persen perolehan kembali

(11)

Lampiran 18 Contoh perhitungan persen perolehan kembali ... 58

Lampiran 19 Perhitungan berat sampel dari lampiran 18 setelah penimbangan ... 60

Lampiran 20 Analisis data statistik persen perolehan kembali pada tablet Fansidar (PT. Roche) ... 62

Lampiran 21 Data hasil perolehan kembali Sulfadoksin dan Pirimetamin Pada tablet Fansidar (PT. Roche) ... 63

Lampiran 22 Contoh perhitungan % Recovery dengan metode penambahan Bahan baku (Standard Adition Method) dari tablet Fansidar ... 64

Lampiran 23 Sertifikat pengujian Sulfadoksin BPFI ... 65

Lampiran 24 Sertifikat pengujian Pirimetamin BPFI ... 66

Lampiran 25 Sertifikat bahan baku Sulfadoksin dari PT. Ifars... 67

Lampiran 26 Sertifikat bahan baku Pirimetamin dari PT. Ifars ... 68

(12)

PENETAPAN KADAR SULFADOKSIN DAN PIRIMETAMIN DALAM SEDIAAN TABLET SECARA

KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI Abstrak

(13)

DETERMINATION DEGREE OF SULFADOXIN AND PYRIMETHAMIN IN TABLETS USING HIGH PERFORMANCE LIQUID

CHROMATOGRAPHY Abstract

(14)

BAB I PENDAHULUAN 1.1Latar Belakang

Malaria adalah penyakit menular yang disebabkan oleh parasit (protozoa) dari genus plasmodium yang dapat ditularkan melalui gigitan nyamuk anopeles. Biasanya malaria menyerang penduduk yang tinggal didaerah endemis atau orang-orang yang berpergian ke daerah yang angka penularannya tinggi. Kegiatan pemberantasan penyakit ini sudah dilakukan sejak lama, adanya parasit malaria yang resisten terhadap obat-obatan, menambah sulit pemberantasan penyakit ini (Prabowo, 2008).

Tablet Fansidar merupakan salah satu obat kombinasi Sulfadoksin dan Pirimetamin dengan pemberian peroral, Pirimetamin bekerja dengan menghambat enzim dihidrofolat reduktase plasmodium, penghambatan ini menyebabkan protozoa kekurangan tetrahidrofolat, suatu kofaktor yang diperlukan dalam biosintesis purin dan pirimidin. Pirimethamin efektif digunakan pada P. Malariae yang dikombinasikan dengan Sulfadoksin sehingga dapat meningkatkan efektivitas dari Pirimetamin (Harvey, 2001).

Menurut Undang-undang No. 36 tahun 2009 pasal 105 ayat 1 tentang kesehatan bahwa obat dan bahan obat harus memenuhi standar Farmakope dan buku standar lain. Salah satu parameter obat tersebut dikatakan memenuhi standar apabila kadar zat berkhasiat yang terkandung didalamnya memenuhi persyaratan Farmakope Indonesia dan buku standar lainnya.

Menurut USP edisi 30 (2007) penetapan kadar tablet kombinasi Sulfadoksin dan Pirimetamin dapat dilakukan secara KCKT dengan metode baku dalam (Internal

(15)

standar) menggunakan kolom VP-ODS (3,9 mm x 30 cm) dengan perbandingan fase

gerak Asetonitril-Asam asetat glasial dalam air 1% (1:4), dengan laju alir 2 ml/menit dan dideteksi pada panjang gelombang 254 nm,.

Dalam penelitian ini dilakukan penetapan kadar dengan metode yang berbeda yaitu metode baku luar (Eksternal standar), menggunakan kolom VP-ODS (4,6 mm x 25 cm), fase gerak Asetonitril dan Asam asetat glasial dalam air 1% dengan berbagai perbandingan.

Metode baku luar (Eksternal standar) lebih praktis dibanding dengan metode baku dalam (Internal standar). Pemilihan metoda KCKT ini karena memiliki banyak keuntungan antara lain cepat, resolusi baik, mudah melaksanakannya, detektor yang sensitif dan beragam sehingga mampu menganalisa berbagai cuplikan secara kualitatif dan kuantitatif (Rohman, 2007).

Untuk menguji keabsahan dari metode yang digunakan dilakukan uji akurasi dengan parameter persen recovery dan uji presisi dengan relatif standar deviasi (RSD).

1.2Perumusan Masalah

- Apakah metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi dengan baku luar (Eksternal standard) dapat diterapkan pada penetapan kadar Sulfadoksin dan Pirimetamin dalam sediaan tablet dengan uji validasi metode yang memenuhi syarat.

- Apakah kadar Sulfadoksin dan Pirimetamin dalam sediaan tablet di pasaran memenuhi persyaratan kadar menurut The United States Pharmacopeia 30

(16)

1.3Hipotesa

- Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi dengan baku luar (Eksternal

standard) dapat diterapkan pada penetapan kadar Sulfadoksin dan

Pirimetamin dalam sediaan tablet dengan uji validasi metode yang memenuhi syarat.

- Kombinasi Sulfadoksin dan Pirimetamin dalam sediaan tablet yang beredar di pasaran memenuhi persyaratan kadar menurut The United States Pharmecopeia 30 (2007) yaitu tidak kurang dari 90,0% dan tidak lebih dari 110,0%.

1.4Tujuan Penelitian

- Menentukan kadar Sulfadoksin dan Pirimetamin dalam sediaan tablet secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi menggunakan baku luar (Eksternal

standard) dengan uji validasi metode yang memenuhi syarat.

- Mengetahui kadar kombinasi Sulfadoksin dan Pirimetamin dalam sediaan tablet yang beredar di pasaran memenuhi persyaratan kadar menurut The United States Pharmacopoeia 30 (2007) yaitu tidak kurang dari 90,0% dan tidak lebih dari 110,0%.

(17)

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

Tablet adalah sediaan padat kompak, dibuat secara kempa cetak, dalam bentuk tabung pipih atau siskuler, kedua permukaannya rata atau cembung, mengandung satu jenis obat atau lebih dengan atau tanpa bahan tambahan (Depkes RI,1979). Sedangkan menurut Farmakope Indonesia (1995) tablet adalah sediaan padat mengandung bahan obat dengan atau tanpa bahan pengisi.

1. Sulfadoksin

Rumus struktur :

Gambar 1. struktur Sulfadoxin

Nama Kimia : N1-(5,6-Dimetoksi-4-pirimidinil)sulfanilamida Rumus Molekul : C12H14N4O4S

Berat Molekul : 310,33 (Depkes RI, 1995) Pemerian : Serbuk kristal putih

(18)

Kelarutan : Sangat sukar larut dalam air, sukar larut dalam etanol dan metanol, praktis tidak larut dalam eter.

2. Pirimetamin

Rumus Struktur :

Gambar 2. Struktur Pirimetamin

Nama Kimia : 2,4-Diamino-5-(p-klorofenil)-6-etilpirimidina

Rumus Molekul : C12H13ClN4

Berat Molekul : 248,71 (Depkes RI, 1995) Pemerian : Serbuk kristal putih. Log P : 2,7 (octanol/water) pKa : 7,3

Kelarutan : Praktis tidak larut dalam air, larut dalam 200 bagian etanol, dalam 125 bagian kloroform dan larut dalam asam mineral.

(19)

3 Kromatografi

Kromatografi adalah suatu terminologi umum yang digunakan untuk bermacam- macam teknik pemisahan yang didasarkan atas partisi cuplikan diantara suatu fase gerak yang bisa berupa gas ataupun cairan dan fase diam yang juga bisa berupa cairan atau padatan.

Kromatografi dapat dibedakan atas berbagai macam tergantung pada pengelompokannya. Berdasarkan pada mekanisme pemisahannya, kromatografi dibedakan menjadi :

a) Kromatografi adsorbsi b) Kromatografi partisi c) Kromatografi pasangan ion d) Kromatografi penukar ion

e) Kromatografi eksklusi ukuran, dan f) Kromatografi afinitas

3.1 Penggunaan Kromatografi

1. Pemakaian untuk tujuan kualitatif mengungkapkan ada atau tidak adanya senyawa tertentu dalam cuplikan

2. Pemakaian untuk tujuan kuantitatif menunjukkan banyaknya masing-masing komponen campuran

3. Pemakaian untuk tujuan preparatif untuk memperoleh komponen campuran dalam jumlah memadai dalam keadaan murni.

(20)

Selama pemisahan kromatografi, solut individual akan membentuk profil konsentrasi yang simetris atau dikenal juga dengan profil Gaussian dalam arah aliran fase gerak. Profil dikenal juga dengan punak atau pita, secara perlahan - lahan akan melebar dan sering juga membentuk profil yang asimetrik karena solut – solut melanjutkan migrasinya ke fase diam.

3.3 Puncak asimetris

Profil konsentrasi solut yang bermigrasi akan simetris jika rasio distribusi solut (D) konstan selama dikisaran konsentrasi keseluruhan puncak, sebagaimana ditunjukkan oleh isoterm sorpsi yang linear yang merupakan plot konsentrasi solut dalam fase diam (Cs) terhadap konsentrasi solut dalam fase gerak(Cm). Meskipun demikian, kurva isot erm akan berubah menjadi 2 jenis puncak asimetris yakni membentuk puncak yang berekor (tailing) dan adanya puncak pendahulu (fronting) jika ada perubahan rasio distribusi solut yang lebih besar.

Untuk kromatografi yang melibatkan kolom, kuantifikasi dapat dilakukan dengan luas puncak atau tinggi puncak. Tinggi puncak atau luas puncak berbanding langsung dengan banyaknya solut yang dikromatografi, jika dilakukan pada kisaran detektor yang linier.

1. Metode tinggi puncak

Metode yang paling sederhana untuk pengukuran kuantitatif adalah dengan tinggi puncak. Tinggi puncak diukur sebagai jarak dari garis dasar ke puncak maksimum seperti puncak 1, 2, dan 3 pada gambar 3. Penyimpangan garis dasar diimbangi dengan interpolasi garis dasar antara awal dan akhir puncak.

(21)

Gambar 1. Pengukuran tinggi puncak

Metode tinggi puncak hanya digunakan jika perubahan tinggi puncak linier dengan konsentrasi analit. Kesalahan akan terjadi jika metode ini digunakan pada puncak yang mengalami penyimpangan (asimetris) atau jika kolom mengalami kelebihan muatan.

2. Metode luas puncak

Prosedur penentuan luas puncak serupa dengan tinggi puncak. Suatu teknik untuk mengukur luas puncak adalah dengan mengukur luas puncak sebagai hasil kali tinggi puncak dan lebar pada setengah tinggi (W1/2). Teknik ini hanya dapat digunakan untuk kromatografi yang simetris atau yang mempunyai bentuk serupa (Johnson, 1991).

Saat ini integrator elektronik telah banyak digunakan untuk mengukur luas puncak pada kromatografi cair kinerja tinggi dan pada kromatografi gas. Integrator digital mengukur luas puncak dan mengubahnya dalam bentuk angka (Rohman, 2007).

Baik tinggi puncak maupun luasnya dapat dihubungkan dengan konsentrasi. Tinggi puncak mudah diukur, akan tetapi sangat dipengaruhi perubahan waktu retensi

(22)

yang disebabkan oleh variasi suhu dan komposisi pelarut. Oleh karena itu, luas puncak dianggap merupakan parameter yang lebih akurat untuk pengukuran kuantitatif (Ditjen POM, 1995).

3.4 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) merupakan sistem pemisahan dengan kecepatan dan efisiensi yang tinggi. Hal ini karena didukung oleh kemajuan dalam teknologi kolom, sistem pompa tekanan tinggi, dan detektor yang sangat sensitif dan beragam. KCKT mampu menganalisa berbagai cuplikan secara kualitatif maupun kuantitatif, baik dalam komponen tunggal maupun campuran (Ditjen POM, 1995).

KCKT merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah bidang antara lain; farmasi, lingkungan dan industri-industri makanan.

Kegunaan umum KCKT adalah untuk pemisahan sejumlah senyawa organik, anorganik, maupun senyawa biologis, analisis ketidakmurnian (impurities) dan analisis senyawa-senyawa yang tidak mudah menguap (nonvolatil). KCKT paling sering digunakan untuk: menetapkan kadar senyawa-senyawa tertentu seperti asam-asam amino, asam-asam-asam-asam nukleat dan protein-protein dalam cairan fisiologis, menentukan kadar senyawa-senyawa aktif obat dan lain-lain.

Kelebihan KCKT antara lain:

−Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran −Resolusinya baik

(23)

−Mudah melaksanakannya

−Kecepatan analisis dan kepekaannya tinggi

−Dapat dihindari terjadinya dekomposisi/kerusakan bahan yang dianalisis −Dapat digunakan bermacam-macam detektor

−Kolom dapat digunakan kembali −Mudah melakukan rekoveri cuplikan

−Tekniknya tidak begitu tergantung pada keahlian operator dan reprodusibilitasnya lebih baik

−Instrumennya memungkinan untuk bekerja secara automatis dan kuantitatif −Waktu analisis umumnya singkat

−Kromatografi cair preparatif memungkinkan dalam skala besar - Ideal untuk molekul besar dan ion.

Keterbatasan metode KCKT adalah untuk identifikasi senyawa, kecuali jika KCKT dihubungkan dengan spektrometer massa (MS). Keterbatasan lainnya adalah jika sampelnya sangat kompleks, maka resolusi yang baik sulit diperoleh (Munson, 1991).

3.4.1 Cara Kerja KCKT

Kromatografi merupakan teknik yang mana solut atau zat-zat terlarut terpisah oleh perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan solut-solut ini melewati suatu kolom kromatografi. Pemisahan solut-solut ini diatur oleh distribusi dalam fase gerak dan fase diam. Penggunaan kromatografi cair membutuhkan penggabungan secara tepat dari berbagai macam kondisi operasional seperti jenis kolom, fase gerak, panjang dan

(24)

diameter kolom, kecepatan alir fase gerak, suhu kolom, dan ukuran sampel (Rohman, 2007).

3.4.2 Komponen KCKT

Gambar 2. Bagan alat KCKT

3.4.2.1 Wadah Fase Gerak

Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut kosong ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini biasanya dapat meampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut.Fase gerak sebelum digunakan harus dilakukan degassing(penghilangan gas) yang ada pada fase gerak, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama dipompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis. (Rohman, 2007)

3.4.2.2 Pompa

Pompa yang cocok digunakan untuk KCKT adalah pompa yang mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni pompa harus inert terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, Teflon,

pompa

injektor

kolom oven

detektor

Wadah

(25)

dan batu nilam. Pompa yang dgunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 ml/ menit.

3.4.2.3 Injektor

Cuplikan harus dimasukkan kedalam pangkal kolom (kepala kolom), diusahakan agas sesedikit mungkin terjadi gangguan pada kemasan kolom.

Ada tiga jenis dasar injektor, yaitu:

a. Hentikan aliran/stop flow: aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir, sistem tertutup, dan aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan karena difusi di dalam aliran kecil dan resolusi tidak dipengaruhi.

b. Septum: injektor-injektor langsung ke aliran fase gerak umumnya sama dengan yang digunakan pada kromatografi gas. Injektor ini dapat digunakan pada kinerja sampai 60-70 atmosfir. Tetapi septum ini tidak tahan dengan semua pelarut-pelarut kromatografi cair. Disamping itu, partikel kecil dari septum yang terkoyak (akibat jarum injektor) dapat menyebabkan penyumbatan.

c. Katup putaran (loop valve): ditunjukkan secara skematik dalam Gambar 5, tipe injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume lebih besar daripada 10 µl dan sekarang digunakan dengan cara otomatis (dengan adaptor khusus, volume-volume lebih kecil dapat diinjeksikan secara manual). Pada posisi LOAD, sampel loop (cuplikan dalam putaran) diisi pada tekanan atmosfir. Bila katup difungsikan, maka cuplikan di dalam putaran akan bergerak ke dalam kolom.

(26)

Gambar 3. Tipe injektor katup putaran 3.4.2.4 Kolom

Kolom adalah jantung kromatografi. Berhasil atau gagalnya suatu analisis tergantung pada pemilihan kolom dan kondisi percobaan yang sesuai. Kolom dapat dibagi menjadi dua kelompok:

1. Kolom analitik: diameter khas adalah 2-6 mm. Panjang kolom tergantung pada jenis kemasan. Untuk kemasan pelikel biasanya panjang kolom 50-100 cm. Untuk kemasan mikropartikel berpori, umumnya 10-30 cm. Dewasa ini ada yang 5 cm. 2. Kolom preparatif: umumnya memiliki diameter 6 mm atau lebih besar dan

panjang kolom 25-100 cm.

Kolom umumnya dibuat dari stainless steel dan biasanya dioperasikan pada temperatur kamar, tetapi bisa juga digunakan temperatur lebih tinggi, terutama untuk kromatografi penukar ion dan kromatografi eksklusi. Kemasan kolom tergantung pada mode KCKT yang digunakan.

3.4.2.5 Detektor

Suatu detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen cuplikan dalam aliran yang keluar dari kolom. Detektor-detektor yang baik memiliki

(27)

sensitifitas yang tinggi, gangguan (noise) yang rendah, kisar respons linier yang luas, dan memberi tanggapan/respon untuk semua tipe senyawa. Suatu kepekaan yang rendah terhadap aliran dan fluktuasi temperatur sangat diinginkan, tetapi tidak selalu dapat diperoleh.

Detektor yang paling banyak digunakan dalam kromatografi cair modern kecepatan tinggi adalah detektor spektrofotometer UV 254 nm. Bermacam-macam detektor dengan variasi panjang gelombang UV-Vis sekarang menjadi populer karena mereka dapat digunakan untuk mendeteksi senyawa-senyawa dalam rentang yang luas. Detektor indeks refraksi juga secara luas digunakan, terutama dalam kromatografi eksklusi, tetapi umumnya kurang sensitif dari pada detektor spektrofotometer UV. Detektor lainnya, antara lain: detektor fluometer, detektor ionisasi nyala, detektor elektrokimia dan lain-lain juga telah digunakan.

3.4.2.6 Pengolahan Data

Komponen yang terelusi mengalir ke detektor dan dicatat sebagai puncak-puncak yang secara keseluruhan disebut sebagai kromatogram.

Gambar 4. Kromatogram W

W1/2

H1/2 H

(28)

Guna kromatogram: 1. Kualitatif

Waktu retensi selalu konstan dalam setiap kondisi kromatografi yang sama dapat digunakan untuk identifikasi.

2. Kuantitatif

Luas puncak proporsional dengan jumlah sampel yang diinjeksikan dan dapat digunakan untuk menghitung konsentrasi.

3. Kromatogram dapat digunakan untuk mengevaluasi efisiensi pemisahan dan kinerja kolom (kapasitas ‘k’, selektifitas ‘α’, jumlah pelat teoritis ‘N’, jarak setara dengan pelat teoritis ‘HETP’ dan resolusi ‘R’).

3.4.2.7 Fase Gerak

Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel (Johnson & Stevenson, 1991).

Dalam kromatografi cair komposisi pelarut atau fase gerak adalah satu variabel yang mempengaruhi pemisahan. Terdapat keragaman yang luas dari fase gerak yang digunakan dalam semua mode KCKT, tetapi ada beberapa sifat-sifat yang diinginkan yang mana umumnya harus dipenuhi oleh semua fase gerak.

Fase gerak harus:

• Murni; tidak ada pencemar/kontaminan • Tidak bereaksi dengan pengemas

(29)

• Sesuai dengan detektor • Melarutkan cuplikan

• Mempunyai viskositas rendah

• Mudah rekoveri cuplikan, bila diinginkan

• Tersedia diperdagangan dengan harga yang pantas

Umumnya, pelarut-pelarut dibuang setelah digunakan karena prosedur pemurnian kembali membosankan dan mahal. Dari semua persyaratan di atas, 4 persyaratan pertama adalah yang paling penting.

Gelembung udara (degassing) yang ada harus dihilangkan dari pelarut, karena udara yang terlarut keluar melewati detektor dapat menghasilkan banyak noise sehingga data tidak dapat digunakan (Putra, 2007).

Elusi Gradien dan Isokratik

Elusi pada KCKT dapat dibagi menjadi dua sistem yaitu:

1. Sistem elusi isokratik. Pada sistem ini, elusi dilakukan dengan satu macam atau lebih fase gerak dengan perbandingan tetap (komposisi fase gerak tetap selama elusi).

2. Sistem elusi gradien. Pada sistem ini, elusi dilakukan dengan campuran fase gerak yang perbandingannya berubah-ubah dalam waktu tertentu (komposisi fase gerak berubah-ubah selama elusi).

Elusi gradien didefinisikan sebagai penambahan kekuatan fase gerak selama suatu analisis kromatografi berlangsung. Digunakan untuk meningkatkan resolusi campuran yang kompleks terutama jika sampel mempunyai kisaran polaritas yang

(30)

luas. Pengaruh yang menguntungkan dari elusi gradien adalah memperpendek waktu analisis senyawa-senyawa yang secara kuat ditahan di dalam kolom (Putra, 2007). Tipe kromatografi

a. Kromatografi fase normal

Kromatografi fase normal (fase diam lebih polar daripada fase gerak), kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut. Fase gerak ini biasanya tidak polar. Dietil eter, benzen, hidrokarbon lurus seperti pentana, heksana, heptana maupun iso-oktana sering digunakan. Halida alifatis seperti dikloro metana, dikloroetana, butilklorida dan kloroform juga digunakan. Umumnya gas terlarut tidak menimbulkan masalah pada fase normal. Tekanan rendah diperlukan untuk menjaga kecepatan aliran yang memadai, karena pelarut ini kebanyakan kurang kental (Munson, 1991).

Fase diam yang digunakan dapat dilihat pada gambar dibawah ini:

Gambar 5. Jenis-jenis fase diam untuk tipe kromatografi fase normal b. Kromatografi fase terbalik

(31)

Kromatografi fase terbalik (fase diam kurang polar daripada fase gerak), kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut. Kandungan utama fase gerak fase terbalik adalah air. Pelarut yang dapat campur dengan air seperti metanol, etanol, asetonitril, dioksan, tetrahirofuran dan dimetilformamida ditambahkan untuk mengatur kepolaran fase gerak. Dapat ditambahkan pula asam, basa, dapar dan/atau surfaktan. Mutu air harus tinggi baik air destilasi maupun awamineral.

Fase diam yang digunakan dapat dilihat pada gambar dibawah ini :

Gambar 6. Jenis-jenis fase diam untuk tipe kromatografi fase terbalik Adsorpsi solut oleh fase diam atau adsorben sangat tergantung pada:

1. Struktur kimia solut atau adanya gugus aktif tertentu yang berinteraksi dengan adsorben.

2. Ukuran partikel adsorben. Semakin kecil ukuran partikel adsorben, maka luas permukaannya semakin luas sehingga interaksinya dengan solut juga semakin luas.

(32)

Validasi

Validasi adalah suatu tindakan terhadap parameter tertentu pada prosedur penetapan yang dipakai untuk membuktikan bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya (WHO, 1992).

Validasi metode menurut United States Pharmacopeia (USP) dilakukan untuk menjamin bahwa metode analisis akurat, spesifik, reprodusibel dan tahan pada kisaran analit yang akan dianalisis. Suatu metode analis harus divalidasi untuk verifikasi bahwa parameter-parameter kinerjanya cukup mampu untuk mengatasi masalah dalam analisis. Parameter analisis yang ditentukan pada validasi adalah akurasi, presisi, batas deteksi, batas kuantitasi, spesifikasi, linieritas dan rentang, kekasaran (Ruggedness) dan ketahanan (Robutness).

Presisi merupakan ukuran keterulangan metode analisis dan biasanya diekspresikan sebagai relatif standar deviasi (RSD) dari sejumlah sampel yang berbeda secara signifikan secara statistik.

Batas deteksi (limit of detection, LOD) didefinisikan sebagai konsentrasi analit terendah dalam sampel yang masih dapat terdeteksi.

Batas kuantitasi (limit of quantitation, LOQ) didefinisikan sebagai konsentrasi analit terendah dalam sampel yang dapat ditentukan dengan presisi dan akurasi yang dapat diterima pada kondisi operasional metode yang digunakan.

Linieritas merupakan kemampuan suatu metode untuk memperoleh hasil-hasil uji yang secara langsung proporsional dengan konsentrasi analit pada kisaran yang diberikan (Rohman, 2007).

(33)

BAB III

METODOLOGI PENELITIAN 3.1 Waktu dan tempat penelitian

Penelitian dilakukan di Laboratorium Penelitian Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara pada bulan Oktober sampai November 2009.

3.2 Alat-alat

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah satu unit alat KCKT (Shimadzu) yang terdiri dari Vacum degasser, pompa, detektor UV/Vis, printer, kolom shimpac VP-ODS (4,6 mm x 25 cm), wadah fase gerak, penyuntik mikroliter (100 µl), neraca analitik (Mettler Toledo), membran filter PTFE 0,5 µ m dan 0,2 µ m,

cellulose nitrat membran filter 0,45 µ m, Spektrofotometer IR (Shimadzu IR

Prestige-21).

3.3 Bahan-bahan

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian yaitu Asetonitril (BDH), metanol p.a (Merck), akuabidestilata (PT. Ikapharmindo putramas), Sulfadoksin dan Pirimetamin BPFI (Badan POM RI), Sulfadoksin baku pabrik (Nanhu Farms Chongshu Jiangshu China), Pirimetamin baku pabrik (Hesni Town, Changshu, Jiangshu, China) dan serbuk KBr (Kyoto Japan).

3.4 Pengambilan sampel

Pengambilan sampel secara purposif yaitu tanpa membandingkan antara satu tempat dengan tempat yang lain, karena tempat pengambilan sampel dianggap

(34)

homogen. Sampel yang digunakan adalah tablet Fansidar (PT. Rhoce), tablet generik (Ifars), tablet Suldox (PT. Actavis).

3.5 Prosedur penelitian

3.5.1 Uji Identifikasi Sulfadoksin dan Pirimetamin baku pabrik (PT. Ifars) secara spektrofotometri Inframerah

Dicampur 1 mg serbuk Sulfadoksin dengan 100 mg serbuk KBr dalam lumpang digerus hinggga halus dan homogen, campuran tersebut diletakkan pada sampel pan, kemudian dipasangkan pada DRS 8000 dan dianalisa pada bilangan gelombang 4000 – 500 cm-1. Spektrum Inframerah yang diperoleh dibandingkan dengan literatur.

Baku Pirimetamin juga di analisa dengan perlakuan yang sama seperti Sulfadoksin.

3.5.2 Penentuan Kualitatif dan Kuantitatif Sulfadoksin dan Pirimetamin menggunakan KCKT

3.5.2.1 Pembuatan fase gerak Asetonitril–Asam asetat glasial dalam air (1%)

Asetonitril 500 ml disaring dengan menggunakan membran filter PTFE 0,5 µ m.

Sebanyak 10 ml asam asetat glasial diencerkan dengan akuabidestilata dalam labu tentukur 1000 ml, kocok. Kemudian diencerkan sampai garis tanda dan disaring

(35)

dengan menggunakan celllulosa nitrat membran filter 0,45 µ m. Masing-masing diawaudarakan selama 20 menit.

3.5.2.2 Pembuatan pelarut

Dicampur 100 ml asetonitril dan 400 ml larutan campuran asam asetat glasial dalam air (1%). Kemudian pelarut disaring menggunakan membran filter PTFE 0,5 µ m dan diawaudarakan selama 20 menit.

3.5.2.3 Pembuatan Larutan Induk Baku Sulfadoksin dan Pirimetamin BPFI Sejumlah 50 mg Baku Pembanding Sulfadoksin ditimbang seksama, dimasukkan kedalam labu tentukur 50 ml, ditambah asetonitril 35 ml aduk hingga larut, lalu dicukupkan sampai garis tanda dengan pelarut dan dikocok hingga homogen, maka diperoleh larutan dengan konsentrasi 1000 mcg/ml (LIB).

Sejumlah 25 mg Baku Pembanding Pirimetamin ditimbang seksama, dimasukkan kedalam labu tentukur 100 ml, ditambah asetonitril 35 ml aduk hingga larut, lalu dicukupkan sampai garis tanda dengan pelarut dan dikocok hingga homogen, maka diperoleh larutan dengan konsentrasi 250 mcg/ml (LIB).

3.5.2.4 Penyiapan alat Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Masing-masing unit diatur, kolom yang digunakan Shimpac VP-ODS (4,6 mm x 25 cm), detektor UV/Vis, dengan laju alir 2 ml/menit, sensitifitas 1.000 AUFS dan dideteksi pada panjang gelombang 254 nm.

Setelah alat KCKT dihidupkan, maka pompa dijalankan dan fase gerak dibiarkan mengalir selama 30 menit sampai diperoleh garis alas yang datar, menandakan sistem tersebut telah stabil.

(36)

Dipipet 5 ml Larutan Induk Baku Sulfadoksin dan 1 ml Larutan Induk Baku Pirimetamin masukkan dalam labu tentukur 10 ml, dicukupkan dengan pelarut hingga garis tanda, kocok sehingga diperoleh larutan Sulfadoksin dengan konsentrasi 500 mcg/ml dan Pirimetamin dengan konsentrasi 25 mcg/ml, disaring dengan membran filter PTFE 0,2 µl dan diawaudarakan selama 5 menit, kemudian diinjeksikan ke dalam sistem KCKT dengan volum penyuntikan 20 µ l, menggunakan fase gerak asetonitril - asam asetat glasial dalam air (1%) dengan perbandingan (20:80), (30:70), (40:60), laju alir 2 ml/menit dan dideteksi pada panjang gelombang 254 nm. Kemudian dipilih perbandingan fase gerak yang memberikan data yang terbaik.

3.5.2.6 Uji Kualitatif Sulfadoksin dan Pirimetamin menggunakan KCKT 3.5.2.6.1 Menentukan waktu tambat Sulfadoksin dan Pirimetamin BPFI

Larutan Induk Baku Sulfadoksin dipipet 5 ml masukkan dalam labu 10 ml, dicukupkan dengan pelarut sampai garis tanda, dikocok. Maka diperoleh larutan Sulfadoksin dengan konsentrasi 500 mcg/ml.

Larutan Induk baku Pirimetamin dipipet 1 ml masukkan dalam labu 10 ml, dicukupkan dengan pelarut samapi garis tanda, dikocok. Maka diperoleh larutan Pirimetamin dengan konsentrasi 25 mcg/ml.

Masing-masing larutan disaring dengan membran filter PTFE 0,2 µ l dan diawaudarakan selama 5 menit, diinjeksikan ke dalam sistem KCKT sebanyak 20 µ l, dengan laju alir 2 ml/menit, menggunakan perbandingan fase gerak yang telah dipilih, kemudian dicatat masing-masing waktu tambatnya.

(37)

Masing-masing larutan sampel Sulfadoksin dan Pirimetamin dalam sediaan tablet dengan konsentrasi Sulfadoksin 500 mcg/ml dan Pirimetamin 25 mcg/ml, disuntikkan kesistem KCKT dengan volume penyuntikan 20 µ l pada kondisi kromatogafi yang sama dengan BPFI. Kemudian waktu tambat masing-masing tablet dibandingkan dengan waktu tambat Sulfadoksin dan Pirimetamin BPFI. Apabila waktu tambat sampel hampir sama dengan waktu tambat BPFI, maka sampel tablet mengandung Sulfadoksin dan Pirimetamin.

3.5.2.7 Penentuan Kuantitatif Sulfadoksin dan Pirimetamin menggunakan KCKT

3.5.2.7.1 Pembuatan Kurva Kalibrasi Sulfadoksin BPFI

Larutan Induk Baku Sulfadoksin dipipet sebanyak 3 ml, 4 ml, 5 ml, 6 ml dan 7 ml, dimasukkan dalam labu tentukur 10 ml, diencerkan dengan pelarut hingga garis tanda, kocok. Maka diperoleh konsentrasi 300 mcg/ml, 400 mcg/ml, 500 mcg/ml, 600 mcg/ml, 700 mcg/ml. Kemudian masing-masing larutan disaring dengan membran filter PTFE 0,2 µ m dan diawaudarakan selama 5 menit, diinjeksikan kesistem KCKT sebanyak 20 µ l, dengan laju alir 2 ml/menit dan dideteksi pada panjang gelombang 254 nm. Selanjutnya dari luas area yang diperoleh dibuat kurva kalibrasi, dihitung persamaan regresi dan faktor korelasinya.

3.5.2.7.2 Pembuatan Kurva Kalibrasi Pirimetamin BPFI

(38)

garis tanda, kocok. Maka diperoleh konsentrasi 10 mcg/ml, 20 mcg/ml, 30 mcg/ml, 40 mcg/ml, 50 mcg/ml. Kemudian masing-masing larutan disaring dengan membran filter PTFE 0,2 µ m dan diawaudarakan selama 5 menit, diinjeksikan kesistem KCKT sebanyak 20 µ l, dengan laju alir 2 ml/menit dan dideteksi pada panjang gelombang 254 nm. Selanjutnya dari luas area yang diperoleh dibuat kurva kalibrasi, dihitung persamaan regresi dan faktor korelasinya.

3.5.2.7.3 Penetapan kadar sampel

Ditimbang 20 tablet yang mengandung Sulfadoksin dan Pirimetamin kemudian digerus, ditimbang sejumlah serbuk tablet setara dengan 500 mg Sulfadoksin dan 25 mg Pirimetamin (sebanyak 6 kali perlakuan). Masing-masing dimasukkan kedalam labu tentukur 50 ml, dilarutkan dengan 35 ml acetonitril, diencerkan dengan pelarut sampai garis tanda, kocok. Maka diperoleh larutan dengan konsentrasi 10000 mcg/ml Sulfadoksin dan 500 mcg/ml Pirimetamin, kemudian saring dengan kertas saring, 10 % filtrat pertama dibuang. Dari keenam larutan masing-masing dipipet 0,5 ml dimasukkan kedalam labu tentukur 10 ml, diencerkan dengan pelarut sampai garis tanda, kocok. Maka diperoleh larutan dengan konsentrasi 500 mcg/ml Sulfadoksin dan 25 mcg/ml Pirimetamin. Masing-masing larutan tersebut disaring dengan membran filter PTFE 0,2 µ l dan diawaudarakan selama 5 menit, kemudian diinjeksikan ke sistem KCKT sebanyak 20 µl, dengan laju alir 2 ml/menit dan dideteksi pada panjang gelombang 254 nm.

Kadar dapat dihitung dengan mensubtitusikan luas area sampel pada Y dari persamaan regresi :

(39)

3.5.3 Penentuan Uji Validasi dengan Parameter Akurasi dan Presisi 3.5.3.1 Uji akurasi dengan persen perolehan kembali (% Recovery)

Uji akurasi dengan parameter persen perolehan kembali (% Recovery) dilakukan secara Standard Addition Method dengan membuat 3 konsentrasi analit Sulfadoksin-Pirimetamin dan baku pembanding dengan rentang spesifik 80%, 100%, 120%, setiap rentang mengandung 70% analit sampel dan 30% bahan baku, pada perlakuan yang sama dengan perlakuan sampel.

Menurut WHO (1992) persen perolehan kembali dapat dihitung dengan rumus:

% Perolehan kembali x100%

C B A−

= Keterangan :

A = Konsentrasi sampel yang diperoleh setelah penambahan bahan baku B = Konsentrasi sampel sebelum penambahan bahan baku

C = Konsentrasi baku yang ditambahkan 3.5.3.2 Uji Presisi

Uji presisi ditentukan dengan parameter Relatif Standar Deviasi (RSD) dengan rumus:

% 100

x X SD RSD= Keterangan:

RSD = Standar Deviasi Relatif (%) SD = Standar deviasi

(40)

X = Kadar rata-rata sampel (Rohman, 2007)

3.5.3.3 Penentuan Batas Deteksi (LOD) dan Batas Kuantitasi (LOQ)

Untuk menentukan batas deteksi (LOD) dan batas kuantitasi (LOQ) digunakan rumus: 2 ) ( 2 − − = n Yi Y SB Slope SB x LOD=3

Slope SB x LOQ=10

Keterangan:

SB = Simpangan baku LOD = Batas Deteksi

LOQ = Batas Kuantitasi (WHO, 1992) 3.5.3.4 Analisis Data Secara Statistik

Untuk menghitung Standar Deviasi (SD) digunakan rumus:

1 ) ( − − =

∑

n X X SD Keterangan :

SD = Standar deviasi X = Kadar sampel

X = Kadar rata-rata sampel

(41)

Kadar dapat dihitung dengan persamaan garis regresi dan untuk menentukan data diterima atau ditolak digunakan rumus:

t hitung

n SD

X X

/ − =

Dengan dasar penolakan apabila t hitung ≥ t tabel

Untuk mencari kadar sebenarnya dengan α = 0,01, dk = n - 1, dapat digunakan rumus:

n SD x t

X (1 1/2α)dk

µ= ± −

Keterangan:

μ = Kadar sebenarnya X = Kadar sampel n = Jumlah perlakuan

t = Suatu harga tergantung pada derajad kebebasan dan tinggkat kepercayaan dk= Derajad kebebasan. (Wibisono, 2005)

(42)

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Uji Identifikasi menggunakan Inframerah

Baku Sulfadoksin dan Pirimetamin yang diperoleh dari PT. Ifars sebelum digunakan sebagai pembanding terlebih dahulu diidentifikasi menggunakan Spektrofotometer IR pada rentang bilangan gelombang 4000 – 500 cm-1.

Spektrum Inframerah baku Sulfadoksin dan Pirimetamin dapat dilihat pada Gambar 1 dan 2 di bawah ini:

Peak (cm-1)

(43)

Gambar 1. Spektrum Inframerah dari baku pabrik Sulfadoksin (PT. Ifars)

Peak (cm-1)

810.1

833.2 5

1085.9 2

1573.9 1

1625.9 9

1645.2 8

3130.4 7

3305.9 9

3468.0 1

Gambar 2. Spektrum Inframerah baku pabrik Pirimetamin (PT. Ifars)

Dari hasil spektrum Sulfadoksin dan Pirimetamin diperoleh bentuk spektrum yang hampir sama dengan spektrum pembanding yang terdapat pada library (dapat dilihat pada Lampiran 3 dan 4). Bilangan gelombang pada daerah sidik jari juga hampir sama dengan bilangan gelombang yang terdapat pada literatur yaitu untuk

(44)

Sulfadoksin pada bilangan gelombang 1596, 1583, 1315, 1161, 1091, 1305 cm-1. Sedangkan untuk Pirimetamin pada bilangan gelombang 1640, 1628, 1575, 1075, 835, 805 cm-1 (Clarke’s, 2005).

Pada daerah gugus fungsi dari spektrum Sulfadoksin terlihat beberapa peak, yaitu pada bilangan gelombang 3464,15 - 3375,43 cm-1 menunjukkan gugus amin primer dan pada bilangan gelombang 3238,48 cm-1 menunjukan gugus amin sekunder. Sedangkan pada daerah gugus fungsi spektrum Pirimetamin terlihat beberapa peak, yaitu pada bilangan gelombang 3468,01 - 3305,99 cm-1 menunjukkan gugus amin primerdan pada bilangan gelombang 3100 cm-1 menunjukkan stretching ═C─H aromatis. Dari data spektrum yang diperoleh, dapat diambil kesimpulan bahwa baku yang diidentifikasi adalah Sulfadoksin dan Pirimetamin.

4.2 Uji Kualitatif dan Kuantitatif Sulfadoksin-Pirimetamin menggunakan KCKT

4.2.1 Penentuan perbandingan fase gerak

Pada kromatografi fase terbalik, fase diamnya kurang polar dari pada fase gerak, kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut. Pemisahan dua zat tergantung dari perbedaan polaritas solut yang dipisahkan. Besarnya polaritas dari suatu zat meningkat dengan bertambahnya gugus fungsional dan harga pKa serta berkurang dengan bertambahnya berat molekul (Adnan, 1997). Dari rumus bangun Pirimetamin mempunyai BM rendah, harga log P dan pKa lebih tinggi bila dibandingkan dengan Sulfadoksin, dengan demikian dapat disimpulkan bahwa Pirimetamin lebih polar dari Sulfadoksin.

(45)

Menurut Munson tahun 1991, zat terlarut yang kuat berinteraksi dengan fase gerak akan terelusi lebih cepat. Hal ini berarti interaksi Pirimetamin dengan fase diam lebih singkat dibanding interaksi Sulfadoksin dengan fase diam. Sehingga waktu tambat Pirimetamin lebih cepat dibanding Sulfadoksin.

Untuk mendapatkan kondisi fase gerak yang optimum dilakukan dengan menyuntikkan campuran Sulfadoksin dan Pirimetamin masing-masing dengan konsentrasi 500 mcg/ml dan 25 mcg/ml, diinjeksikan ke dalam sistem KCKT dan divariasikan perbandingan fase gerak asetonitril dan asam asetat asetat glasial dalam air 1%, yaitu (20:80), (30:70), (40:60). Hasil kromatogram dapat dilihat pada Gambar 3, 4 dan 5.

Gambar 3 Kromatogram hasil penyuntikan larutan BPFI dengan konsentrasi 500 mcg/ml Sulfadoksin dan 25 mcg/ml Pirimetamin, menggunakan

(46)

perbandingan fase gerak asetonitril-asam asetat glasial dalam air 1% (20:80)

Gambar 4. Kromatogram hasil penyuntikan larutan BPFI dengan konsentrasi 500 mcg/ml Sulfadoksin dan 25 mcg/ml Pirimetamin dengan menggunakan perbandingan fase gerak asetonitril-asam asetat glasial dalam air 1% (30:70)

(47)

Gambar 5. Kromatogram hasil penyuntikan larutan BPFI dengan konsentrasi 500 mcg/ml Sulfadoksin dan 25 mcg/ml Pirimetamin, menggunakan perbandingan fase gerak asetonitril - asam asetat glasial dalam air 1% (40:60)

Tabel 1. Hasil optimasi fase gerak dengan parameter data waktu tambat, resolusi, tailing dan theoretical plate

Perband. fase gerak

Waktu tambat Theoritical plate Tailing factor

Resolusi

S P S P S P

20 : 80 7,513 4,357

1974,11 4

1233,58

8 2,649 1,926 5,344 30 : 70 3,749 1,661 1583,16 2731,73 2,774 1,718 8,889

(48)

4 1

40 : 60 2,631 1,329

1549,06

0 884,796 2,466 0,841 5,841

Dari tabel diatas perbandingan fase gerak asetonitril-asam asetat glasial dalam air (1%) yang terbaik yaitu dengan perbandingan (40:60), karena waktu tambatnya dari kedua komponen relatif lebih singkat dan memberikan faktor tailing yang lebih kecil.

Setelah didapatkan perbandingan fase gerak yang terbaik selanjutnya dilakukan uji identifikasi.

4.2.2 Uji Kualitatif Sulfadoksin-Pirimetamin menggunakan KCKT

Hasil uji kualitatif Sulfadoksin dan Pirimetamin BPFI pada penyuntikan terpisah masing-masing dengan konsentrasi 500 mcg/ml dan 25 mcg/ml diperoleh kromatogram dengan waktu tambat Sulfadoksin 2,504 menit dan Pirimetamin 1,271 menit dapat dilihat pada Gambar 6 dan 7. Waktu tambat yang diperoleh dari pengujian BPFI dibandingkan dengan waktu tambat yang diperoleh sampel yang akan dianalisis.

(49)

Gambar 6. Kromatogram hasil penyuntikan larutan 25 mcg/ml Pirimetamin BPFI, dengan perbandingan asetonitril-asam asetat glasial dalam air 1% (40:60)

(50)

Gambar 7. Kromatogram hasil penyuntikan larutan 500 mcg/ml Sulfadoksin BPFI, dengan perbandingan asetonitril-asam asetat glasial dalam air 1% (40:60)

Hasil pengujian untuk sampel diperoleh waktu tambat yang hampir sama dengan Sulfadoksin-Pirimetamin BPFI. Waktu tambat rata-rata tablet Fansidar (PT. Roche) Sulfadoksin 2,542 menit dan Pirimetamin 1,285 menit. Tablet Generik (PT. Ifars) Sulfadoksin 2,548 menit dan Pirimetamin 1,311. Tablet Suldox (PT. Actavis) Sulfadoksin 2,544 dan Pirimetamin 1,293.

(51)

4.2.3 Penentuan linieritas kurva kalibrasi

Penentuan linieritas kurva kalibrasi Sulfadoksin BPFI ditentukan berdasarkan luas puncak, pada konsentrasi 300, 400, 500, 600, 700 mcg/ml, diperoleh hubungan yang linier dengan koefisien korelasi (r) = 0,9996 dan persamaan regresi Y = 30931,2 X + 317656.

(52)

Gambar 8. Kurva kalibrasi larutan Sulfadoksin BPFI konsentrasi versus luas puncak Penentuan linieritas kurva kalibrasi Pirimetamin BPFI ditentukan berdasarkan luas puncak, pada konsentrasi 10, 20, 30, 40, 50 mcg/ml, diperoleh hubungan yang linier dengan koefisien korelasi (r) = 0,9997 dan persamaan regresi Y = 19319,1 X + 37454,2.

(53)

Gambar 9. Kurva kalibrasi larutan Pirimetamin BPFI konsentrasi versus luas puncak.

(54)

Sesuai dengan teori yang dikemukakan oleh Snyder dan Kirland (1979) yaitu pengukuran kadar lebih baik dengan cara pengukuran luas puncak dibandingkan dengan pengukuran tinggi puncak. Maka dalam hal ini yang digunakan adalah nilai dari luas puncak.

Kadar dapat dihitung dengan mensubtitusikan luas puncak pada Y dari persamaan regresi Sulfadoksin Y = 30931,2 X + 317656 dan Pirimetamin Y = 19319,1 X + 37454,2.

Hasil perhitungan kadar setelah dilakukan uji statistik dapat dilihat pada Tabel 2.

Tabel 2. Kadar hasil penetapan kadar Sulfadoksin dan Pirimetamin dalam tablet

No Nama Sampel

Kadar tablet (%) Sulfadoksin Pirimetamin

Tablet Fansidar

99,66 ± 0,11 104,09 ± 0,13 500 mg Sulfadoksin dan 25 mg Pirimetamin

Tablet Generik

90,39 ± 0,17 99,99 ± 0,88 500 mg Sulfadoksin dan 25 mg Pirimetamin

Teblet Suldox

85,12 ± 0,22 96,26 ± 2,11 500 mg Sulfadoksin dan 25 mg Pirimetamin

Dari tabel diatas terlihat bahwa dari ketiga sampel yang diteliti terdapat satu tablet yang tidak memenuhi persyaratan yaitu Suldox (PT. Actavis). Kadar yang

(55)

diperoleh Sulfadoksin kurang dari 90%, sedangkan persyaratan kadar yang tertera dalam USP edisi 30 tahun 2007 adalah tablet Sulfadoksin-Pirimetamin tidak kurang dari 90,0% dan tidak lebih dari 110,0% dari jumlah yang tertera pada etiket.

4.4 Hasil uji validasi

Pada penelitian ini dilakukan uji validasi metode, dengan metode penambahan bahan baku (Standard Addition Method) terhadap sampel tablet Fansidar (PT. Roche). Uji ini meliputi uji akurasi dengan parameter persen perolehan kembali (% recovery) dan uji presisi dengan parameter RSD (Relatif Standar Deviasi), batas deteksi (LOD) dan batas kuantitasi (LOQ).

Uji akurasi dengan parameter persen perolehan kembali dilakukan dengan membuat 3 konsentrasi analit dengan rentang spesifik 80%, 100%, 120%, masing-masing dengan 3 replikasi dan setiap rentang spesifik mengandung 70% analit dan 30% bahan baku. Data hasil pengujian perolehan kembali tablet Fansidar dengan metode penambahan bahan baku (Standar Addition Method) dapat dilihat pada Tabel 3 di bawah ini.

Tabel 3. Data hasil perolehan kembali Sulfadoksin-Pirimetamin dengan metode penambahan bahan baku (Standard Addition Method)

No Rentang Spesifik (%)

Luas area % Recovery

S P S P

12899960 428949 105.79 91.49

2 12897714 427830 105.73 90.55

(56)

100

15908128 527126 103.39 92.56

5 15873431 529186 102.64 93.94

6 15899481 528702 103.20 93.62

120

18841766 628138 100.47 94.54

8 18872960 629466 101.03 95.28

9 18859348 628000 100.78 94.46

Kadar rata-rata (%) 103.13 93.17

Standar Deviasi (SD) 2.09 1.65

Relatif Standar Deviasi 2.03 1.66

Keterangan :

- S = Sulfadoksin - P = Pirimetamin

Dari tabel diatas diperoleh persen perolehan kembali Sulfadoksin 103,13% dengan standar deviasi (SD) 2,09%, sedangkan Pirimetamin 93,17% dengan standar deviasi 1,65%. Syarat persen perolehan kembali yang diizinkan terletak pada rentang 90 – 107 % (Harmita, 2004).

Dari hasil uji presisi dengan parameter Relatif Standar Deviasi (RSD) untuk Sulfadoksin 2,03% dan Pirimetamin 1,66%. Nilai RSD yang diizinkan adalah ≤ 2,5%.

Batas deteksi (LOD) dan batas kuantitasi (LOQ) yang diperoleh dari penelitian ini untuk Sulfadoksin sebasar 35,99 mcg/ml dan 119,95 mcg/ml, sedangkan untuk Pirimetamin sebesar 1,36 mcg/ml dan 4,55 mcg/ml.

(57)

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN 5.1 Kesimpulan

Penetapan kadar Sulfadoksin dan Pirimetamin dalam sediaan tablet dapat dilakukan secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) dengan metoda baku luar (Eksternal standar), menggunakan fase gerak asetonitril-asam asetat glasial dalam air 1% dengan perbandingan (40:60), laju alir 2 ml/menit, pada panjang gelombang 254 nm. Dari hasil uji validitas menunjukkan bahwa metode yang dilakukan memenuhi persyaratan validasi, meliputi uji akurasi dan presisi.

Hasil penetapan kadar tablet Sulfadoksin dan Pirimetamin dari tiga sampel dengan nama dagang dan generik, terdapat satu sampel dengan nama dagang yaitu Suldox yang tidak memenuhi persyaratan kadar yang tertera dalam USP edisi 30 tahun 2007, yaitu tidak kurang dari 90,0% dan tidak lebih dari 110,0% dari jumlah yang tertera pada etiket.

5.2 Saran

Disarankan agar dilakukan penelitian lebih lanjut menggunakan kolom fase normal.

(58)

DAFTAR PUSTAKA

Anonim. (2008). Pedoman Penulisan Skripsi. Fakultas Farmasi. Universitas Sumatera Utara.

Anonim. (2007). The United States Pharmacopeia 30th Edition. National Formulary. United States Pharmacopeia Convention. Hal. 3243.

Harmita. (2004). Petunjuk Pelaksanaan Validasi Metode dan Cara Perhitungannya.

Reviw Artikel. Majalah Ilmu Kefarmasian, Volume I (3). Hal.117-135.

Harvey, R.A, Mycek, M. J. (2001) Farmakologi Ulasan Bergambar. Edisi II. Editior Pamela C. Champe. Penerbit Widya Medika. Jakarta. Hal. 357.

Moffat, A.C. (2005). Clarke’S Analysis Of Drug And Poisons. Thirth edition. London: Pharmaceutical Press. Electronic version.

Munson, J. W. (1991). Analisis Farmasi Metode Modern. Penerbit Air langga Univercity Press. Surabaya. Hal. 46.

Prabowo, A. (2004). Malaria mencegah dan mengatasinya. Penerbit: Puspa Swara, Jakarta. Hal 2-5.

Rohman, A. (2007). Kimia Faramasi Analisis. Yogyakarta. Penerbit: Pustaka pelajar. Hal.18.

Snyder, L. And Kirkland, J. (1979). Introduction to Modern Liquid Chromatography. 2nd edition, By Jhon Wiley and Son. London. Page. 554.

WHO. (1992). The International Pharmacopoeia. Fourth Edition. Electronic Version Geneva: World Health Organization.

Wibisono, Y. (2005). Metode Statistik. Yogyakarta. Gajah mada. Univercity Press. Hal. 449-454.

(59)

(60)

Gambar 11. Syringe 100 µ l (SGE)

Lampiran 2. Gambar Sonifikator (Branson 1510) dan Penyaring

(61)

Gambar Penyaring

Gambar 13. Pompa Vakum (Gast DO A-PG04-BN) dan alat penyaring fase gerak.

(62)

Lampiran 3. Spektrum Inframerah Sulfadoksin pada literatur Pharmaceutical Sub stance (UV/IR)

(63)

(64)

Gambar 14. Spektrum Inframerah Sulfadoksin

Lampiran 4. Spektrum Inframerah Pirimetamin pada literatur Pharmaceutical Sub stance (UV/IR)

(65)

(66)

Lampiran 5. Perhitungan persamaan regresi dari kurva kalibrasi Sulfadoksin N

o X Y XY X² Y²

1 300 9,692,420.8 2,907,726,240 90,000 93,943,020,964,272.7 2 400 12,707,450.4 5,082,980,160 160,000 161,479,295,668,460.0 3 500 15,556,742.6 7,778,371,300 250,000 242,012,240,322,655.0

4 600 18,895,768.3

11,337,460,98

0 360,000 357,050,059,647,285.0

5 700 22,063,852.9

15,444,697,03

0 490,000 486,813,604,792,838.0

∑ 2,500 78,916,235.0

42,551,235,71 0 1,350,00 0 6,227,772,146,575,220. 0 b aX Y= +

( ) ( )( )

( )

X X n Y X XY n a Σ − Σ Σ Σ − Σ =

(

)

(

)

(

) (

)

2500 000 . 350 . 1 5 235 . 916 . 78 500 . 2 710 . 235 . 551 . 42 5 − − =

=30.931,18

aX Y b= −

=15.783.247−

(

30.931,18

)( )

500 =317.656

( ) ( )( )

( ) ( )

[

2 2

]

[

( )

]

Y Y n X X n Y X XY n r Σ − Σ Σ − Σ Σ Σ − Σ =

(

) (

)(

)

(

) (

)

[

]

[

(

) (

)

]

235 . 916 . 78 510 . 395 . 221 . 298 . 341 . 1 5 500 . 2 000 . 350 . 1 5 235 . 916 . 78 2500 710 . 235 . 551 . 42 5 − − − = r 9996344 , 0 = r

(67)

317656 2 , 30931 + = X Y

Lampiran 6. Perhitungan Batas Deteksi (LOD) dan Batas Kuantitasi (LOQ) Sulfadoksin

No Consentrasi

Luas

Puncak Yi Y – Yi ( Y - Yi )² X (mcg/ml) Y

1 300 9692420.8 9597016 95404.8 9102075863.04 2 400 12707450.4 12372480 334970.4 112205168876.16 3 500 15556742.6 15465600 91142.6 8306973534.76 4 600 18895768.3 18558720 337048.3 113601556532.89 5 700 22063852.9 21651840 412012.9 169754629766.41

∑ 412970404573.26

2 ) ( 2 − − =

∑

n Yi Y SB 2 5 ) 26 , 73 4129704045 ( − = SB 29 , 371021 = SB Slope SB x LOD=3

2 , 30931 29 , 371021 3 x LOD= 99 , 35 = LOD mcg/ml Slope SB x LOQ=10

(68)

2 , 30931 29 , 371021 10 x LOQ= 95 , 119 = LOQ mcg/ml

Lampiran 7. Perhitungan Persamaan Regresi dari kurva kalibrasi Pirimetamin

No X Y XY X² Y²

1 10 222.979,80 2.229.798 100 49.719.991.208,04 2 20 426.477,50 8.529.550 400 181.883.058.006,25 3 30 627.237,50 18.817.125 900 393.426.881.406,25 4 40 812.527,50 32.501.100 1.600 660.200.938.256,25 5 50 995.907,80 49.795.390 2.500 991.832.346.100,84

∑ 150 3.085.130,10 111.872.963 5.500 2.277.063.214.977,63

b aX Y= +

( ) ( )( )

( )

X X n Y X XY n a Σ − Σ Σ Σ − Σ =

(

)

(

)

(

) ( )

150 500 . 5 5 1 , 130 . 085 . 3 150 963 . 872 . 111 5 − − =

=19.319,1

aX Y b= −

=617.026,02−

(

19.319

)( )

30 =37454,2

( ) ( )( )

( ) ( )

[

2 2

]

[

( )

]

Y Y n X X n Y X XY n r Σ − Σ Σ − Σ Σ Σ − Σ =

(

) ( )(

)

(

) ( )

[

]

[

(

) (

)

]

1 , 130 . 085 . 3 63 , 977 . 214 . 063 . 277 . 2 5 150 500 . 5 5 1 , 130 . 085 . 3 150 963 . 872 . 111 5 − − − = r 9996899 , 0 = r

(69)

Jadi Persamaannya didapat : 2 , 37454 1 , 19319 + = X Y

Lampiran 8. Perhitungan Batas Deteksi (LOD) dan Batas Kuantitasi (LOQ) Pirimetamin

Consentrasi Luas Puncak

Yi Y - Yi ( Y - Yi )² X (mcg/ml) Y

1 10 222979.8 230645.2 -7665.4 58758357.16 2 20 426477.5 423836.2 2641.3 6976465.69 3 30 627237.5 617027.2 10210.3 104250226.09 4 40 812527.5 810218.2 2309.3 5332866.49 5 50 995907.8 1003409.2 -7501.4 56271001.96

∑ 231588917.39

2 ) ( 2 − − =

∑

n Yi Y SB 2 5 ) 39 . 231588917 ( 2 − = SB 14 , 8786 = SB Slope SB x LOD=3

1 , 19319 14 , 8786 3 x LOD= 36 , 1 =

LOD mcg/ml

Slope SB x LOQ=10

(70)

1 , 19319 14 , 8786 10 x LOQ= 55 , 4 = LOQ mcg/ml

Lampiran 9. Contoh perhitungan kadar kombinasi Sulfadoksin dan Pirimetamin dari tablet Fansidar (PT. Roche).

Sulfadoksin :

Persamaan regresi Y = 30931,2X + 317656 Luas Puncak = 15778574

X = 2 , 30931 317656 15778574−

X = 499,8325 mcg/ml

Kadar = 99,66% / 500 / 8325 , 499 x ml mcg ml mcg = 99,63% Pirimetamin :

Persamaan regresi Y = 19319,1X + 37454,2 Luas puncak = 535297

X = 1 , 19319 2 , 37454 535297−

(71)

Kadar = 100,97% /

/ 7695 , 25

x ml mcg

ml mcg

= 104,08%

Lampiran 10. Kromatogram hasil penyuntikkan dari larutan tablet Fansidar (PT. Rhoce)

(72)

(b)

(73)

(d)

(74)

(f)

a, b, c, d, e dan f berturut-turut kromatogram hasil penyuntikan 6 kali perlakuan dari larutan tablet Fansidar (PT. Rhoce) pada konsentrasi 500 mcg/ml Sulfadoksin dan 25 mcg/ml Pirimetamin yang dianalisa secara KCKT pada kolom VP-ODS (4,6 mm x 25 cm), dengan perbandingan fase gerak asetonitril-asam asetat glasial 1% (40:60), laju alir 2 ml/menit dan dideteksi pada panjang gelombang 254 nm.

(75)

Lampiran 11. Analisis data statistik untuk mencari kadar sebenarnya dari penyuntikkan larutan tablet Fansidar (PT. Roche)

Keterangan :

- S = Sulfadoksin - P = Pirimetamin Sulfadoksin 1 ) ( 2 − − =

∑

n X X SD 5 0229 , 0

= = 0,0677

Pirimetamin 1 ) ( 2 − − =

∑

n X X SD 5 0305 , 0

= = 0,0781

Pada interval kepercayaan 99% dengan nilai α = 0,01, dk = n – 1 = 6 – 1 = 5 Diperoleh t tabel = 4,0321

Dasar penolakan data apabila t hitung≥ t tabel

t hitung =

n SD X X / − Sulfadoksin : No

Luas area Kadar (%) (X-Xrata) (X-Xrata)²

S P S P S P S P

1 15778574 535297 99.63 104.08 -0.03 -0.01 0.0009 0.0002 2 15784363 535938 99.67 104.21 0.01 0.12 0.0001 0.0148 3 15794369 535525 99.73 104.13 0.07 0.04 0.0051 0.0013 4 15766039 534805 99.55 103.97 -0.11 -0.12 0.0123 0.0133 5 15785474 535207 99.67 104.06 0.01 -0.03 0.0002 0.0010 6 15793452 535335 99.73 104.09 0.07 0.00 0.0043 0.0000

(76)

t hitung data 1 = 6 / 0677 , 0 03 , 0 = 1,0854

t hitung data 2 =

6 / 0677 , 0 01 , 0 = 0,3618

t hitung data 3 =

6 / 0677 , 0 07 , 0 = 2,5327

t hitung data 4 =

6 / 0677 , 0 11 , 0 = 3,9799

t hitung data 5 =

6 / 0677 , 0 01 , 0 = 0,3618

t hitung data 6 =

6 / 0677 , 0 07 , 0 = 2,5327 Semua data diterima

Jadi kadar sebenarnya terletak antara : µ = X ± t(1-1/2α)dk x

n SD

= 99,66 ± 4,0321 x 6 0677 , 0

= 99,66% ± 0,11% Pirimetamin :

t hitung data 1 =

6 / 0781 , 0 01 , 0 = 0,3136

t hitung data 2 =

6 / 0781 , 0 12 , 0 = 3,7636

t hitung data 3 =

6 / 0781 , 0 04 , 0 = 1,2545

t hitung data 4 =

6 / 0781 , 0 12 , 0 = 3,7636

t hitung data 5 =

6 / 0781 , 0 03 , 0 = 0,9409

(77)

t hitung data 6 =

6 / 0781 , 0

00 , 0

= 0,0000 Semua data diterima

Jadi kadar sebenarnya terletak antara : µ = X ± t(1-1/2α)dk x

n SD

= 104,09 ± 4,0321 x 6 0781 , 0

= 104,09% ± 0,13%

Lampiran 12. Kromatogram hasil dari penyuntikkan larutan tablet Generik Sulfadoksin dan Pirimetamin (PT. Ifars)

(78)

(79)

(80)

(81)

(82)

(83)

(f)

A, b, c, d, e dan f berturut-turut kromatogram hasil penyuntikan 6 kali perlakuan dari larutan tablet Generik (PT. Ifars) pada konsentrasi 500 mcg/ml Sulfadoksin dan 25 mcg/ml Pirimetamin yang dianalisa secara KCKT pada kolom VP-ODS (4,6 mm x 25 cm), dengan perbandingan fase gerak asetonitril-asam asetat glasial 1% (40:60), laju alir 2 ml/menit dan dideteksi pada panjang gelombang 254 nm.

Lampiran 13. Analisis data statistik untuk mencari kadar sebenarnya dari penyuntikkan larutan tablet Generik Sulfadoksin-Pirimetamin (PT. Ifars)

Sulfadoksin

1 )

( 2

− −

∑

n X X SD

5 0503 , 0

= = 0,1003

Luas area Kadar (%) (X-Xrata) (X-Xrata)²

S P S P S P S P

1 14328699 514395 90.29 99.71 -0.10 -0.28 0.0106 0.0795 2 14321122 512151 90.24 99.24 -0.15 -0.75 0.0231 0.5642 3 14355050 514873 90.46 99.81 0.07 -0.18 0.0044 0.0332 4 14356397 518657 90.47 100.60 0.08 0.61 0.0057 0.3709 5 14348885 515867 90.42 100.02 0.03 0.03 0.0007 0.0007 6 14356397 518657 90.47 100.60 0.08 0.61 0.0057 0.3709

(84)

Pirimetamin 1 ) ( 2 − − =

∑

n X X SD 5 4193 , 1

= = 0,5328

Pada interval kepercayaan 99% dengan nilai α = 0,01, dk = n – 1 = 6 – 1 = 5 Diperoleh t tabel = 4,0321

Dasar penolakan data apabila t hitung≥ t tabel t hitung =

n SD X X / − Sulfadoksin : t hitung data 1 =

6 / 1003 , 0 10 , 0 = 2,4422

t hitung data 2 =

6 / 1003 , 0 15 , 0 = 3,6632

t hitung data 3 =

6 / 1003 , 0 07 , 0 = 1,7095

t hitung data 4 =

6 / 1003 , 0 08 , 0 = 1,9537

t hitung data 5 =

6 / 1003 , 0 03 , 0 = 0,7326

t hitung data 6 =

6 / 1003 , 0 08 , 0 = 1,9537 Semua data diterima

Jadi kadar sebenarnya terletak antara : µ = X ± t_(1-1/2α)dk x

n SD

= 90,38 ± 4,0321 x 6 1003 , 0

= 90,39% ± 0,17% Pirimetamin :

t hitung data 1 =

6 / 5328 , 0 28 , 0 = 1,2873

(85)

t hitung data 2 = 6 / 5328 , 0 75 , 0 = 3,4480

t hitung data 3 =

6 / 5328 , 0 18 , 0 = 0,8275

t hitung data 4 =

6 / 5328 , 0 61 , 0 = 2,8044

t hitung data 5 =

6 / 5328 , 0 03 , 0 = 0,1379

t hitung data 6 =

6 / 5328 , 0 61 , 0 = 2,8044 Semua data diterima

Jadi kadar sebenarnya terletak antara : µ = X ± t(1-1/2α)dk x

n SD

= 99,99 ± 4,0321 x 6 5328 , 0

= 99,99% ± 0,88%

Lampiran 14. Kromatogram hasil penyuntikkan dari larutan tablet Suldox (PT. Actavis)

(86)

(87)

(88)

(89)

(90)

(91)

(f)

a, b, c, d, e dan f berturut-turut kromatogram hasil penyuntikan 6 kali perlakuan dari larutan tablet Suldox (PT. Actavis) pada konsentrasi 500 mcg/ml Sulfadoksin dan 25 mcg/ml Pirimetamin yang dianalisa secara KCKT pada kolom VP-ODS (4,6 mm x 25 cm), dengan perbandingan fase gerak asetonitril-asam asetat glasial 1% (40:60), laju alir 2 ml/menit dan dideteksi pada panjang gelombang 254 nm.

Lampiran 15. Analisis data statistik untuk mencari kadar sebenarnya dari penyuntikkan larutan tablet Suldox (PT. Actavis)

Sulfadoksin 1 ) ( 2 − − =

∑

n X X SD 5 1439 , 0

= = 0,1696

Pirimetamin 1 ) ( 2 − − =

∑

n X X SD 5 2996 , 4

= = 0,9273

Luas area Kadar (%) (X-Xrata) (X-Xrata)²

S P S P S P S P

1 13525040 497298 85.11 96.13 -0.01 -0.13 0.0001 0.0159 2 13482116 499251 84.83 96.54 -0.29 0.28 0.0832 0.0795 3 13534045 495144 85.17 95.68 0.05 -0.58 0.0021 0.3324 4 13548421 504797 85.26 97.70 0.14 1.44 0.0193 2.0778 5 13513371 491670 85.03 94.96 -0.09 -1.30 0.0076 1.6974 6 13554457 499388 85.30 96.57 0.18 0.31 0.0316 0.0965

(92)

Pada interval kepercayaan 99% dengan nilai α = 0,01, dk = n – 1 = 6 – 1 = 5 Diperoleh t tabel = 4,0321

Dasar penolakan data apabila t hitung≥ t tabel

t hitung =

n SD X X / − Sulfadoksin : t hitung data 1 =

6 / 1696 , 0 01 , 0 = 0,1444

t hitung data 2 =

6 / 1696 , 0 29 , 0 = 4,1884

t hitung data 3 =

6 / 1696 , 0 05 , 0 = 0,7221

t hitung data 4 =

6 / 1696 , 0 14 , 0 = 2,0219

t hitung data 5 =

6 / 1696 , 0 09 , 0 = 1,2998

t hitung data 6 =

6 / 1696 , 0 18 , 0 = 2,5997 Pirimetamin : t hitung data 1 =

6 / 9273 , 0 13 , 0 = 0,3434

t hitung data 2 =

6 / 9273 , 0 28 , 0 = 0,7396

t hitung data 3 =

6 / 9273 , 0 58 , 0 = 1,5321

t hitung data 4 =

6 / 9273 , 0 44 , 1 = 3,8038

(93)

t hitung data 5 = 6 / 9273 , 0 30 , 1 = 3,4339

t hitung data 6 =

6 / 9273 , 0 31 , 0 = 0,8189

Karena t hitung 2 dari Sulfadoksin < 4,0321, maka data ditolak, selanjutnya dilakukan pengujian terhadap data yang dianggap tidak menyimpang.

Luas area Kadar (%) (X-Xrata) (X-Xrata)²

S P S P S P S P

1 13525040 497298 85.11 96.13 -0.06 -0.08 0.0038 0.0058 2 13534045 495144 85.17 95.68 0.00 -0.53 0.0000 0.2773 3 13548421 504797 85.26 97.70 0.09 1.49 0.0079 2.2244 4 13513371 491670 85.03 94.96 -0.14 -1.25 0.0188 1.5696 5 13554457 499388 85.30 96.57 0.13 0.36 0.0163 0.1301

85.17 96.21 0.0468 4.2072

Sulfadoksin 1 ) ( 2 − − =

∑

n X X SD 4 0468 , 0

= = 0,1082

Pirimetamin 1 ) ( 2 − − =

∑

n X X SD 4 2072 , 4

= = 1,0256

Pada interval kepercayaan 99% dengan nilai α = 0,01, dk = n – 1 = 5 – 1 = 4 Diperoleh t tabel = 4,6040

Dasar penolakan data apabila t hitung≥ t tabel

t hitung =

n SD X X / −

(94)

Sulfadoksin : t hitung data 1 =

6 / 1082 , 0 06 , 0 = 1,3583

t hitung data 2 =

6 / 1082 , 0 0 = 0

t hitung data 3 =

6 / 1082 , 0 09 , 0 = 2,0375

t hitung data 4 =

6 / 1082 , 0 14 , 0 = 3,1694

t hitung data 5 =

6 / 1082 , 0 13 , 0 = 2,9430 Semua data diterima.

Jadi kadar sebenarnya terletak antara : µ = X ± t(1-1/2α)dk x

n SD

= 85,12 ± 4,6040 x 5 1082 , 0

= 85,12% ± 0,22%

Pirimetamin : t hitung data 1 =

6 / 0256 , 1 08 , 0 = 0,1911

t hitung data 2 =

6 / 0256 , 1 53 , 0 = 1,2658

t hitung data 3 =

6 / 0256 , 1 49 , 1 = 3,5586

t hitung data 4 =

6 / 0256 , 1 25 , 1 = 2,9854

t hitung data 5 =

6 / 0256 , 1 36 , 0 = 0,8598

(95)

Semua data diterima.

Jadi kadar sebenarnya terletak antara : µ = X ± t(1-1/2α)dk x

n SD

= 96,26 ± 4,6040 x 5 0256 , 1

(96)

Lampiran 16. Hasil pengolahan data dari sedian tablet Fansidar, Generik, dan Suldox

No Nama sampel Perlakuan

Luas area Kadar (%)

S P S P

1 Tablet Fansidar

1 15778574 535297 99.63 104.08 2 15784363 535938 99.67 104.21 3 15794369 535525 99.73 104.13 4 15766039 534805 99.55 103.97 5 15785474 535207 99.67 104.06 6 15793452 535335 99.73 104.09

2 Tablet Generik

1 14328699 514395 90.29 99.71 2 14321122 512151 90.24 99.24 3 14355050 514873 90.46 99.81 4 14356397 518657 90.47 100.60 5 14348885 515867 90.42 100.02 6 14356397 518657 90.47 100.60

3 Tablet Suldox

1 13525040 497298 85.11 96.13 2 13534045 495144 85.17 95.68 3 13548421 504797 85.26 97.70 4 13513371 491670 85.03 94.96 5 13554457 499388 85.30 96.57

(97)

Keterangan :

- S = Sulfadoksin - P = Pirimetamin

(98)

Lampiran 17. Kromatogram hasil penyuntikkan dari larutan tablet Fansidar (PT.Roche dan bahan baku, pada persen perolehan kembali pada rentang 80, 100 dan 120 %

(99)

(100)

(1)

(2)

(3)

(4)

(5)

(6)

Lampiran 28. Contoh perhitungan penimbangan sampel : Diketahui :

Berat 20 tablet : 13,960 gram = 13960 mg

Kandungan Sulfadoxin dalam tablet : 500 mg x 20 = 10.000 mg Kandungan Pyrimethamin dalam tablet : 25 mg x 20 = 500 mg

Timbang serbuk setara dengan 500 Sulfadoxin dan 25 Pyrimethamin, maka berat sampel yang ditimbang adalah :

Sulfadoxin :

Penimbangan sampel x mg

mg mg 500 000 . 10 13960 = mg 698 = Pyrimethamin :

Penimbangan sampel x mg

mg mg 25 500 13960 = mg 698 =

Sampel yang ditimbang seberat 698 mg, masukkan dalam labu tentukur 50 ml, larutkan dalam pelarutnya dan dicukupkan dengan fase gerak hingga garis tanda.

Kadar larutan uji : Sulfadoxin x mcg ml

ml mg / 000 . 10 1000 50 500 = =

Pyrimethamin x mcg ml ml mg / 500 1000 50 25 = =

kemudian disaring, 10% filtrat pertama dibuang. Filtrat dipipet 0,5 ml masukkan dalam labu tentukur 10 ml dan dicukupkan dengan fase gerak hingga garis tanda.

Kadar larutan uji : Sulfadoxin x mcg ml

ml mg / 500 000 . 10 10 5 , 0 = =

Pyrimethamin x mcg ml ml mg / 25 500 10 5 , 0 = =