BAB III METODOLOGI PENELITIAN
3.1 Waktu dan tempat penelitian
Penelitian dilakukan di Laboratorium Penelitian Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara pada bulan Oktober sampai November 2009.
3.2 Alat-alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah satu unit alat KCKT Shimadzu yang terdiri dari Vacum degasser, pompa, detektor UVVis, printer,
kolom shimpac VP-ODS 4,6 mm x 25 cm, wadah fase gerak, penyuntik mikroliter 100 µl, neraca analitik Mettler Toledo, membran filter PTFE 0,5 µ m dan 0,2 µ m,
cellulose nitrat membran filter 0,45 µ m, Spektrofotometer IR Shimadzu IR Prestige- 21.
3.3 Bahan-bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian yaitu Asetonitril BDH, metanol p.a Merck, akuabidestilata PT. Ikapharmindo putramas, Sulfadoksin dan
Pirimetamin BPFI Badan POM RI, Sulfadoksin baku pabrik Nanhu Farms Chongshu Jiangshu China, Pirimetamin baku pabrik Hesni Town, Changshu,
Jiangshu, China dan serbuk KBr Kyoto Japan. 3.4 Pengambilan sampel
Pengambilan sampel secara purposif yaitu tanpa membandingkan antara satu tempat dengan tempat yang lain, karena tempat pengambilan sampel dianggap
Universitas Sumatera Utara
homogen. Sampel yang digunakan adalah tablet Fansidar PT. Rhoce, tablet generik Ifars, tablet Suldox PT. Actavis.
3.5 Prosedur penelitian 3.5.1 Uji Identifikasi Sulfadoksin dan Pirimetamin baku pabrik PT. Ifars
secara spektrofotometri Inframerah
Dicampur 1 mg serbuk Sulfadoksin dengan 100 mg serbuk KBr dalam lumpang digerus hinggga halus dan homogen, campuran tersebut diletakkan pada
sampel pan, kemudian dipasangkan pada DRS 8000 dan dianalisa pada bilangan gelombang 4000 – 500 cm
-1
. Spektrum Inframerah yang diperoleh dibandingkan dengan literatur.
Baku Pirimetamin juga di analisa dengan perlakuan yang sama seperti Sulfadoksin.
3.5.2 Penentuan Kualitatif dan Kuantitatif Sulfadoksin dan Pirimetamin menggunakan KCKT
3.5.2.1 Pembuatan fase gerak Asetonitril–Asam asetat glasial dalam air 1
Asetonitril 500 ml disaring dengan menggunakan membran filter PTFE 0,5 µ m.
Sebanyak 10 ml asam asetat glasial diencerkan dengan akuabidestilata dalam labu tentukur 1000 ml, kocok. Kemudian diencerkan sampai garis tanda dan disaring
Universitas Sumatera Utara
dengan menggunakan celllulosa nitrat membran filter 0,45 µ m. Masing-masing diawaudarakan selama 20 menit.
3.5.2.2 Pembuatan pelarut
Dicampur 100 ml asetonitril dan 400 ml larutan campuran asam asetat glasial dalam air 1. Kemudian pelarut disaring menggunakan membran filter PTFE 0,5
µ m dan diawaudarakan selama 20 menit.
3.5.2.3 Pembuatan Larutan Induk Baku Sulfadoksin dan Pirimetamin BPFI
Sejumlah 50 mg Baku Pembanding Sulfadoksin ditimbang seksama, dimasukkan kedalam labu tentukur 50 ml, ditambah asetonitril 35 ml aduk hingga
larut, lalu dicukupkan sampai garis tanda dengan pelarut dan dikocok hingga homogen, maka diperoleh larutan dengan konsentrasi 1000 mcgml LIB.
Sejumlah 25 mg Baku Pembanding Pirimetamin ditimbang seksama, dimasukkan kedalam labu tentukur 100 ml, ditambah asetonitril 35 ml aduk hingga
larut, lalu dicukupkan sampai garis tanda dengan pelarut dan dikocok hingga homogen, maka diperoleh larutan dengan konsentrasi 250 mcgml LIB.
3.5.2.4 Penyiapan alat Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Masing-masing unit diatur, kolom yang digunakan Shimpac VP-ODS 4,6 mm x 25 cm, detektor UVVis, dengan laju alir 2 mlmenit, sensitifitas 1.000 AUFS
dan dideteksi pada panjang gelombang 254 nm. Setelah alat KCKT dihidupkan, maka pompa dijalankan dan fase gerak
dibiarkan mengalir selama 30 menit sampai diperoleh garis alas yang datar, menandakan sistem tersebut telah stabil.
3.5.2.5 Penentuan perbandingan fase gerak
Universitas Sumatera Utara
Dipipet 5 ml Larutan Induk Baku Sulfadoksin dan 1 ml Larutan Induk Baku
Pirimetamin masukkan dalam labu tentukur 10 ml, dicukupkan dengan pelarut hingga garis tanda, kocok sehingga diperoleh larutan Sulfadoksin dengan konsentrasi 500
mcgml dan Pirimetamin dengan konsentrasi 25 mcgml, disaring dengan membran filter PTFE 0,2 µl dan diawaudarakan selama 5 menit, kemudian diinjeksikan ke
dalam sistem KCKT dengan volum penyuntikan 20 µ l, menggunakan fase gerak asetonitril - asam asetat glasial dalam air 1 dengan perbandingan 20:80, 30:70,
40:60, laju alir 2 mlmenit dan dideteksi pada panjang gelombang 254 nm. Kemudian dipilih perbandingan fase gerak yang memberikan data yang terbaik.
3.5.2.6 Uji Kualitatif Sulfadoksin dan Pirimetamin menggunakan KCKT 3.5.2.6.1 Menentukan waktu tambat Sulfadoksin dan Pirimetamin BPFI
Larutan Induk Baku Sulfadoksin dipipet 5 ml masukkan dalam labu 10 ml, dicukupkan dengan pelarut sampai garis tanda, dikocok. Maka diperoleh larutan
Sulfadoksin dengan konsentrasi 500 mcgml. Larutan Induk baku Pirimetamin dipipet 1 ml masukkan dalam labu 10 ml,
dicukupkan dengan pelarut samapi garis tanda, dikocok. Maka diperoleh larutan Pirimetamin dengan konsentrasi 25 mcgml.
Masing-masing larutan disaring dengan membran filter PTFE 0,2 µ l dan diawaudarakan selama 5 menit, diinjeksikan ke dalam sistem KCKT sebanyak 20 µ l,
dengan laju alir 2 mlmenit, menggunakan perbandingan fase gerak yang telah dipilih, kemudian dicatat masing-masing waktu tambatnya.
3.5.2.6.2 Identifikasi sampel
Universitas Sumatera Utara
Masing-masing larutan sampel Sulfadoksin dan Pirimetamin dalam sediaan tablet dengan konsentrasi Sulfadoksin 500 mcgml dan Pirimetamin 25 mcgml,
disuntikkan kesistem KCKT dengan volume penyuntikan 20 µ l pada kondisi kromatogafi yang sama dengan BPFI. Kemudian waktu tambat masing-masing tablet
dibandingkan dengan waktu tambat Sulfadoksin dan Pirimetamin BPFI. Apabila waktu tambat sampel hampir sama dengan waktu tambat BPFI, maka sampel tablet
mengandung Sulfadoksin dan Pirimetamin.
3.5.2.7 Penentuan Kuantitatif Sulfadoksin dan Pirimetamin menggunakan KCKT
3.5.2.7.1 Pembuatan Kurva Kalibrasi Sulfadoksin BPFI
Larutan Induk Baku Sulfadoksin dipipet sebanyak 3 ml, 4 ml, 5 ml, 6 ml dan 7 ml, dimasukkan dalam labu tentukur 10 ml, diencerkan dengan pelarut hingga garis
tanda, kocok. Maka diperoleh konsentrasi 300 mcgml, 400 mcgml, 500 mcgml, 600 mcgml, 700 mcgml. Kemudian masing-masing larutan disaring dengan membran
filter PTFE 0,2 µ m dan diawaudarakan selama 5 menit, diinjeksikan kesistem KCKT sebanyak 20 µ l, dengan laju alir 2 mlmenit dan dideteksi pada panjang gelombang
254 nm. Selanjutnya dari luas area yang diperoleh dibuat kurva kalibrasi, dihitung persamaan regresi dan faktor korelasinya.
3.5.2.7.2 Pembuatan Kurva Kalibrasi Pirimetamin BPFI
Larutan Induk Baku Pirimetamin dipipet sebanyak 1 ml, 2 ml, 3 ml, 4 ml dan 5 ml, dimasukkan dalam labu tentukur 25 ml, diencerkan dengan fase gerak sampai
Universitas Sumatera Utara
garis tanda, kocok. Maka diperoleh konsentrasi 10 mcgml, 20 mcgml, 30 mcgml, 40 mcgml, 50 mcgml. Kemudian masing-masing larutan disaring dengan membran
filter PTFE 0,2 µ m dan diawaudarakan selama 5 menit, diinjeksikan kesistem KCKT sebanyak 20 µ l, dengan laju alir 2 mlmenit dan dideteksi pada panjang gelombang
254 nm. Selanjutnya dari luas area yang diperoleh dibuat kurva kalibrasi, dihitung persamaan regresi dan faktor korelasinya.
3.5.2.7.3 Penetapan kadar sampel
Ditimbang 20 tablet yang mengandung Sulfadoksin dan Pirimetamin kemudian digerus, ditimbang sejumlah serbuk tablet setara dengan 500 mg
Sulfadoksin dan 25 mg Pirimetamin sebanyak 6 kali perlakuan. Masing-masing dimasukkan kedalam labu tentukur 50 ml, dilarutkan dengan 35 ml acetonitril,
diencerkan dengan pelarut sampai garis tanda, kocok. Maka diperoleh larutan dengan konsentrasi 10000 mcgml Sulfadoksin dan 500 mcgml Pirimetamin, kemudian
saring dengan kertas saring, 10 filtrat pertama dibuang. Dari keenam larutan masing-masing dipipet 0,5 ml dimasukkan kedalam labu tentukur 10 ml, diencerkan
dengan pelarut sampai garis tanda, kocok. Maka diperoleh larutan dengan konsentrasi 500 mcgml Sulfadoksin dan 25 mcgml Pirimetamin. Masing-masing larutan tersebut
disaring dengan membran filter PTFE 0,2 µ l dan diawaudarakan selama 5 menit, kemudian diinjeksikan ke sistem KCKT sebanyak 20 µl, dengan laju alir 2 mlmenit
dan dideteksi pada panjang gelombang 254 nm. Kadar dapat dihitung dengan mensubtitusikan luas area sampel pada Y dari
persamaan regresi : Y = aX + b.
Universitas Sumatera Utara
3.5.3 Penentuan Uji Validasi dengan Parameter Akurasi dan Presisi 3.5.3.1 Uji akurasi dengan persen perolehan kembali Recovery
Uji akurasi dengan parameter persen perolehan kembali Recovery dilakukan secara Standard Addition Method dengan membuat 3 konsentrasi analit
Sulfadoksin-Pirimetamin dan baku pembanding dengan rentang spesifik 80, 100, 120, setiap rentang mengandung 70 analit sampel dan 30 bahan baku, pada
perlakuan yang sama dengan perlakuan sampel. Menurut WHO 1992 persen perolehan kembali dapat dihitung dengan
rumus: Perolehan kembali
100 x
C B
A −
=
Keterangan : A = Konsentrasi sampel yang diperoleh setelah penambahan bahan baku
B = Konsentrasi sampel sebelum penambahan bahan baku C = Konsentrasi baku yang ditambahkan
3.5.3.2 Uji Presisi
Uji presisi ditentukan dengan parameter Relatif Standar Deviasi RSD dengan rumus:
100 x
X SD
RSD =
Keterangan: RSD = Standar Deviasi Relatif
SD = Standar deviasi
Universitas Sumatera Utara
X = Kadar rata-rata sampel Rohman, 2007
3.5.3.3 Penentuan Batas Deteksi LOD dan Batas Kuantitasi LOQ
Untuk menentukan batas deteksi LOD dan batas kuantitasi LOQ digunakan rumus:
2
2
− −
= n
Yi Y
SB
Slope SB
x LOD
3 =
Slope SB
x LOQ
10 =
Keterangan: SB
= Simpangan baku LOD = Batas Deteksi
LOQ = Batas Kuantitasi WHO, 1992
3.5.3.4 Analisis Data Secara Statistik
Untuk menghitung Standar Deviasi SD digunakan rumus:
1 −
− =
∑
n X
X SD
Keterangan : SD
= Standar deviasi X
= Kadar sampel X
= Kadar rata-rata sampel n
= Jumlah perlakuan Harmita, 2004
Universitas Sumatera Utara
Kadar dapat dihitung dengan persamaan garis regresi dan untuk menentukan data diterima atau ditolak digunakan rumus:
t hitung n
SD X
X −
=
Dengan dasar penolakan apabila t hitung ≥ t tabel
Untuk mencari kadar sebenarnya dengan α = 0,01, dk = n - 1, dapat digunakan rumus:
n SD
x t
X
dk 2
1 1
α
µ
−
± =
Keterangan: μ = Kadar sebenarnya
X = Kadar sampel n = Jumlah perlakuan
t = Suatu harga tergantung pada derajad kebebasan dan tinggkat kepercayaan dk= Derajad kebebasan.
Wibisono, 2005
Universitas Sumatera Utara
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
Kategori