yang disebabkan oleh variasi suhu dan komposisi pelarut. Oleh karena itu, luas puncak dianggap merupakan parameter yang lebih akurat untuk pengukuran
kuantitatif Ditjen POM, 1995.
3.4 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi KCKT
Kromatografi cair kinerja tinggi KCKT merupakan sistem pemisahan dengan kecepatan dan efisiensi yang tinggi. Hal ini karena didukung oleh kemajuan
dalam teknologi kolom, sistem pompa tekanan tinggi, dan detektor yang sangat sensitif dan beragam. KCKT mampu menganalisa berbagai cuplikan secara kualitatif
maupun kuantitatif, baik dalam komponen tunggal maupun campuran Ditjen POM, 1995.
KCKT merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah bidang antara
lain; farmasi, lingkungan dan industri-industri makanan. Kegunaan umum KCKT adalah untuk pemisahan sejumlah senyawa organik,
anorganik, maupun senyawa biologis, analisis ketidakmurnian impurities dan analisis senyawa-senyawa yang tidak mudah menguap nonvolatil. KCKT paling
sering digunakan untuk: menetapkan kadar senyawa-senyawa tertentu seperti asam- asam amino, asam-asam nukleat dan protein-protein dalam cairan fisiologis,
menentukan kadar senyawa-senyawa aktif obat dan lain-lain.
Kelebihan KCKT antara lain:
− Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran
− Resolusinya baik
Universitas Sumatera Utara
− Mudah melaksanakannya
− Kecepatan analisis dan kepekaannya tinggi
− Dapat dihindari terjadinya dekomposisikerusakan bahan yang dianalisis
− Dapat digunakan bermacam-macam detektor
− Kolom dapat digunakan kembali
− Mudah melakukan rekoveri cuplikan
− Tekniknya tidak begitu tergantung pada keahlian operator dan reprodusibilitasnya
lebih baik −
Instrumennya memungkinan untuk bekerja secara automatis dan kuantitatif −
Waktu analisis umumnya singkat −
Kromatografi cair preparatif memungkinkan dalam skala besar - Ideal untuk molekul besar dan ion.
Keterbatasan metode KCKT adalah untuk identifikasi senyawa, kecuali jika KCKT dihubungkan dengan spektrometer massa MS. Keterbatasan lainnya adalah
jika sampelnya sangat kompleks, maka resolusi yang baik sulit diperoleh Munson, 1991.
3.4.1 Cara Kerja KCKT
Kromatografi merupakan teknik yang mana solut atau zat-zat terlarut terpisah oleh perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan solut-solut ini melewati suatu kolom
kromatografi. Pemisahan solut-solut ini diatur oleh distribusi dalam fase gerak dan fase diam. Penggunaan kromatografi cair membutuhkan penggabungan secara tepat
dari berbagai macam kondisi operasional seperti jenis kolom, fase gerak, panjang dan
Universitas Sumatera Utara
diameter kolom, kecepatan alir fase gerak, suhu kolom, dan ukuran sampel Rohman, 2007.
3.4.2 Komponen KCKT
Gambar 2. Bagan alat KCKT
3.4.2.1 Wadah Fase Gerak
Wadah fase gerak harus bersih dan lembam inert. Wadah pelarut kosong ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini
biasanya dapat meampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut.Fase gerak sebelum digunakan harus dilakukan degassingpenghilangan gas yang ada pada fase
gerak, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama dipompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis. Rohman, 2007
3.4.2.2 Pompa
Pompa yang cocok digunakan untuk KCKT adalah pompa yang mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni pompa harus inert terhadap fase
gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, Teflon,
pompa
injektor kolom
oven detektor
Wadah
Data processor
Universitas Sumatera Utara
dan batu nilam. Pompa yang dgunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 ml
menit.
3.4.2.3 Injektor
Cuplikan harus dimasukkan kedalam pangkal kolom kepala kolom, diusahakan agas sesedikit mungkin terjadi gangguan pada kemasan kolom.
Ada tiga jenis dasar injektor, yaitu: a.
Hentikan aliranstop flow: aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir, sistem tertutup, dan aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan
karena difusi di dalam aliran kecil dan resolusi tidak dipengaruhi. b.
Septum: injektor-injektor langsung ke aliran fase gerak umumnya sama dengan yang digunakan pada kromatografi gas. Injektor ini dapat digunakan pada kinerja
sampai 60-70 atmosfir. Tetapi septum ini tidak tahan dengan semua pelarut- pelarut kromatografi cair. Disamping itu, partikel kecil dari septum yang
terkoyak akibat jarum injektor dapat menyebabkan penyumbatan. c.
Katup putaran loop valve: ditunjukkan secara skematik dalam Gambar 5, tipe injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume lebih besar daripada
10 µl dan sekarang digunakan dengan cara otomatis dengan adaptor khusus, volume-volume lebih kecil dapat diinjeksikan secara manual. Pada posisi LOAD,
sampel loop cuplikan dalam putaran diisi pada tekanan atmosfir. Bila katup difungsikan, maka cuplikan di dalam putaran akan bergerak ke dalam kolom.
Universitas Sumatera Utara
Gambar 3. Tipe injektor katup putaran 3.4.2.4 Kolom
Kolom adalah jantung kromatografi. Berhasil atau gagalnya suatu analisis tergantung pada pemilihan kolom dan kondisi percobaan yang sesuai. Kolom dapat
dibagi menjadi dua kelompok: 1.
Kolom analitik: diameter khas adalah 2-6 mm. Panjang kolom tergantung pada jenis kemasan. Untuk kemasan pelikel biasanya panjang kolom 50-100 cm. Untuk
kemasan mikropartikel berpori, umumnya 10-30 cm. Dewasa ini ada yang 5 cm. 2.
Kolom preparatif: umumnya memiliki diameter 6 mm atau lebih besar dan panjang kolom 25-100 cm.
Kolom umumnya dibuat dari stainless steel dan biasanya dioperasikan pada temperatur kamar, tetapi bisa juga digunakan temperatur lebih tinggi, terutama untuk
kromatografi penukar ion dan kromatografi eksklusi. Kemasan kolom tergantung pada mode KCKT yang digunakan.
3.4.2.5 Detektor
Suatu detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen cuplikan dalam aliran yang keluar dari kolom. Detektor-detektor yang baik memiliki
Universitas Sumatera Utara
sensitifitas yang tinggi, gangguan noise yang rendah, kisar respons linier yang luas, dan memberi tanggapanrespon untuk semua tipe senyawa. Suatu kepekaan yang
rendah terhadap aliran dan fluktuasi temperatur sangat diinginkan, tetapi tidak selalu dapat diperoleh.
Detektor yang paling banyak digunakan dalam kromatografi cair modern kecepatan tinggi adalah detektor spektrofotometer UV 254 nm. Bermacam-macam
detektor dengan variasi panjang gelombang UV-Vis sekarang menjadi populer karena mereka dapat digunakan untuk mendeteksi senyawa-senyawa dalam rentang yang
luas. Detektor indeks refraksi juga secara luas digunakan, terutama dalam kromatografi eksklusi, tetapi umumnya kurang sensitif dari pada detektor
spektrofotometer UV. Detektor lainnya, antara lain: detektor fluometer, detektor ionisasi nyala, detektor elektrokimia dan lain-lain juga telah digunakan.
3.4.2.6 Pengolahan Data
Komponen yang terelusi mengalir ke detektor dan dicatat sebagai puncak- puncak yang secara keseluruhan disebut sebagai kromatogram.
Gambar 4. Kromatogram W
W
12
H
12
H Rt
Area
Universitas Sumatera Utara
Guna kromatogram:
1. Kualitatif
Waktu retensi selalu konstan dalam setiap kondisi kromatografi yang sama dapat digunakan untuk identifikasi.
2. Kuantitatif
Luas puncak proporsional dengan jumlah sampel yang diinjeksikan dan dapat digunakan untuk menghitung konsentrasi.
3. Kromatogram dapat digunakan untuk mengevaluasi efisiensi pemisahan dan kinerja kolom kapasitas ‘k’, selektifitas ‘
α’, jumlah pelat teoritis ‘N’, jarak setara dengan pelat teoritis ‘HETP’ dan resolusi ‘R’.
3.4.2.7 Fase Gerak
Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya
elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel Johnson Stevenson, 1991.
Dalam kromatografi cair komposisi pelarut atau fase gerak adalah satu variabel yang mempengaruhi pemisahan. Terdapat keragaman yang luas dari fase
gerak yang digunakan dalam semua mode KCKT, tetapi ada beberapa sifat-sifat yang diinginkan yang mana umumnya harus dipenuhi oleh semua fase gerak.
Fase gerak harus:
•
Murni; tidak ada pencemarkontaminan
•
Tidak bereaksi dengan pengemas
Universitas Sumatera Utara
•
Sesuai dengan detektor
•
Melarutkan cuplikan
•
Mempunyai viskositas rendah
•
Mudah rekoveri cuplikan, bila diinginkan
•
Tersedia diperdagangan dengan harga yang pantas
Umumnya, pelarut-pelarut dibuang setelah digunakan karena prosedur pemurnian kembali membosankan dan mahal. Dari semua persyaratan di atas, 4
persyaratan pertama adalah yang paling penting. Gelembung udara degassing yang ada harus dihilangkan dari pelarut, karena
udara yang terlarut keluar melewati detektor dapat menghasilkan banyak noise sehingga data tidak dapat digunakan Putra, 2007.
Elusi Gradien dan Isokratik
Elusi pada KCKT dapat dibagi menjadi dua sistem yaitu: 1.
Sistem elusi isokratik. Pada sistem ini, elusi dilakukan dengan satu macam atau lebih fase gerak dengan perbandingan tetap komposisi fase gerak tetap selama
elusi. 2.
Sistem elusi gradien. Pada sistem ini, elusi dilakukan dengan campuran fase gerak yang perbandingannya berubah-ubah dalam waktu tertentu komposisi fase gerak
berubah-ubah selama elusi. Elusi gradien didefinisikan sebagai penambahan kekuatan fase gerak selama
suatu analisis kromatografi berlangsung. Digunakan untuk meningkatkan resolusi campuran yang kompleks terutama jika sampel mempunyai kisaran polaritas yang
Universitas Sumatera Utara
luas. Pengaruh yang menguntungkan dari elusi gradien adalah memperpendek waktu analisis senyawa-senyawa yang secara kuat ditahan di dalam kolom Putra, 2007.
Tipe kromatografi
a. Kromatografi fase normal
Kromatografi fase normal fase diam lebih polar daripada fase gerak, kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut. Fase gerak
ini biasanya tidak polar. Dietil eter, benzen, hidrokarbon lurus seperti pentana, heksana, heptana maupun iso-oktana sering digunakan. Halida alifatis seperti
dikloro metana, dikloroetana, butilklorida dan kloroform juga digunakan. Umumnya gas terlarut tidak menimbulkan masalah pada fase normal. Tekanan
rendah diperlukan untuk menjaga kecepatan aliran yang memadai, karena pelarut ini kebanyakan kurang kental Munson, 1991.
Fase diam yang digunakan dapat dilihat pada gambar dibawah ini:
Gambar 5. Jenis-jenis fase diam untuk tipe kromatografi fase normal
b. Kromatografi fase terbalik
Universitas Sumatera Utara
Kromatografi fase terbalik fase diam kurang polar daripada fase gerak, kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut. Kandungan
utama fase gerak fase terbalik adalah air. Pelarut yang dapat campur dengan air seperti metanol, etanol, asetonitril, dioksan, tetrahirofuran dan dimetilformamida
ditambahkan untuk mengatur kepolaran fase gerak. Dapat ditambahkan pula asam, basa, dapar danatau surfaktan. Mutu air harus tinggi baik air destilasi
maupun awamineral. Fase diam yang digunakan dapat dilihat pada gambar dibawah ini :
Gambar 6. Jenis-jenis fase diam untuk tipe kromatografi fase terbalik
Adsorpsi solut oleh fase diam atau adsorben sangat tergantung pada: 1.
Struktur kimia solut atau adanya gugus aktif tertentu yang berinteraksi dengan adsorben.
2. Ukuran partikel adsorben. Semakin kecil ukuran partikel adsorben, maka luas
permukaannya semakin luas sehingga interaksinya dengan solut juga semakin luas.
3. Kelarutan solut dalam fase gerak. Solut yang makin mudah larut dalam fase gerak
akan semakin mudah lepas
Universitas Sumatera Utara
Validasi
Validasi adalah suatu tindakan terhadap parameter tertentu pada prosedur penetapan yang dipakai untuk membuktikan bahwa parameter tersebut memenuhi
persyaratan untuk penggunaannya WHO, 1992.
Validasi metode menurut United States Pharmacopeia USP dilakukan untuk
menjamin bahwa metode analisis akurat, spesifik, reprodusibel dan tahan pada kisaran analit yang akan dianalisis. Suatu metode analis harus divalidasi untuk
verifikasi bahwa parameter-parameter kinerjanya cukup mampu untuk mengatasi masalah dalam analisis. Parameter analisis yang ditentukan pada validasi adalah
akurasi, presisi, batas deteksi, batas kuantitasi, spesifikasi, linieritas dan rentang, kekasaran Ruggedness dan ketahanan Robutness.
Presisi merupakan ukuran keterulangan metode analisis dan biasanya diekspresikan sebagai relatif standar deviasi RSD dari sejumlah sampel yang
berbeda secara signifikan secara statistik. Batas deteksi limit of detection, LOD didefinisikan sebagai konsentrasi
analit terendah dalam sampel yang masih dapat terdeteksi. Batas kuantitasi limit of quantitation, LOQ didefinisikan sebagai konsentrasi
analit terendah dalam sampel yang dapat ditentukan dengan presisi dan akurasi yang dapat diterima pada kondisi operasional metode yang digunakan.
Linieritas merupakan kemampuan suatu metode untuk memperoleh hasil-hasil uji yang secara langsung proporsional dengan konsentrasi analit pada kisaran yang
diberikan Rohman, 2007.
Universitas Sumatera Utara
BAB III METODOLOGI PENELITIAN
