3 Bakteri uji yang digunakan dalam penelitian ini ialah E. coli Gram negatif
dan S. epidermidis Gram positif. Perbandingan kedua bakteri tersebut dapat dilihat pada Tabel 1 Pelczar dan Chan 1998.
Tabel 1 Perbandingan 2 jenis bakteri uji E. coli
S. epidermidis Golongan
Gram negatif Gram positif
Bentuk Beragam
Kokus Ukuran
0.5-3 μm
0.5-1.5 μm
Penyakit yang ditimbulkan
Radang usus, meningitis, pneumonia, peritonitis,
dan infeksi luka Infeksi saluran kemih,
infeksi luka, infeksi sistem saraf pusat
Tempat hidup Dalam usus manusia dan
hewan, vertebrata lain Kulit manusia
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan mengidentifikasi senyawa aktif antibakteri dari daun belawan putih yang tumbuh di hutan gambut dan kerangas Kalimantan Tengah.
2.2 Metode Alat dan Bahan
Alat analitis yang digunakan adalah spektrofotometer ultraviolet Shimadzu 1240, spektrofotometer inframerah Shimadzu IRPrestige-21, dan spektrometer
resonansi magnetik inti RMI JEOL ECA 500. Bahan yang digunakan ialah sampel daun belawan putih yang diperoleh dari
hutan gambut Hampangen, Kalimantan Tengah. Bakteri yang digunakan adalah biakan bakteri S. epidermidis dari Laboratorium Mikrobiologi Fakultas
Kedokteran Universitas Indonesia dan E. coli dari Laboratorium Mikrobiologi Pusat Penelitian Biologi -LIPI.
Prosedur Penelitian Penyiapan Sampel dan Ekstraksi.
Sampel berupa daun diidentifikasi di Herbarium Bogoriense, Pusat Penelitian Biologi-LIPI. Sampel yang dikoleksi dari
lapangan dikeringanginkan dan digiling dengan grinder sehingga menjadi serbuk.
Sampel 350 g dimaserasi menggunakan pelarut metanol 3 L. Ekstrak metanol kemudian dipartisi dengan 4 pelarut secara bertingkat Lampiran 2.
Pelarut tersebut dibedakan berdasarkan kepolarannya, yaitu n-heksana nonpolar, kloroform semipolar, etil asetat semipolar, dan metanol polar. Setiap jenis
4 ekstrak selanjutnya dipekatkan dengan penguap putar pada suhu 35
o
C. Ekstrak pekat yang diperoleh dikeringkan dengan gas N
2
. Ekstrak ditimbang untuk menentukan rendemen ekstrak, yakni bobot ekstrak dibagi dengan bobot contoh
dikalikan 100 . Ekstrak yang diperoleh digunakan untuk uji aktivitas antibakteri. Uji Aktivitas Antibakteri dengan Metode Bioautografi Hamburger dan
Cordell 1987.
Aktivitas antibakteri dari setiap ekstrak yang telah diperoleh diuji dengan metode bioautografi. Uji ini dilakukan dengan menyiapkan pelat KLT
yang sudah ditotol sebanyak 100 �g masing-masing ekstrak, selanjutnya
dicelupkan pada media brain heart infusion BHI yang mengandung inokulan bakteri sebanyak 10
6
cfumL. Pelat KLT tersebut dipindahkan ke cawan petri steril, yang di dalamnya telah diberi kapas steril yang dibasahi akuades steril, dan
diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 18 jam. Pelat KLT selanjutnya disemprot dengan iodo-nitro tetrazolium INT. Aktivitas antibakteri dari ekstrak uji diamati
dengan mengukur diameter zona bening yang terbentuk di sekeliling spot pada pelat KLT. Besar kecilnya diameter zona hambat menunjukkan tinggi rendahnya
kemampuan ekstrak tumbuhan dalam menghambat pertumbuhan mikrob uji. Ekstrak dengan diameter hambat tertinggi selanjutnya dimurnikan dan ditentukan
strukur senyawa aktifnya.
Ekstrak tanaman ditotolkan pada pelat KLT aluminum jenis silika sel G
60
F
254
dari Merck. Setelah kering, pelat langsung dielusi dalam bejana kromatografi yang telah dijenuhkan oleh uap eluen pengembang. Eluen yang
digunakan: heksana, etil asetat, aseton, kloroform, etanol, dan metanol. Spot yang dihasilkan dari setiap eluen diamati di bawah lampu UV pada panjang gelombang
254 dan 366 nm. Eluen yang menghasilkan pemisahan ekstrak paling baik dipilih sebagai eluen untuk analisis KLT.
Setelah didapatkan spot yang terpisah dengan baik, analisis dilanjutkan dengan bioautografi, yang bertujuan mendeteksi bercak atau komponen zat aktif
dari ekstrak yang diduga memiliki aktivitas sebagai antibakteri dengan mengamati zona bening yang terbentuk. Caranya ialah pelat KLT yang berisi spot ekstrak
kasar antibakteri di-overlay dengan suspensi bakteri dan diinkubasi selama 18 jam pada suhu 37
o
C. Untuk mendeteksi ada atau tidaknya aktivitas antibakteri, pelat KLT yang telah diinkubasi dengan bakteri disemprot dengan larutan INT dan
diinkubasi kembali selama 1 jam. Aktivitas antibakteri dari spot pada KLT ditandai dengan terbentuknya zona jernih.
Isolasi dan Pemurnian Senyawa Aktif. Isolasi dan pemurnian senyawa aktif
dilakukan dengan tujuan mencari kemungkinan adanya senyawa tunggal yang memiliki daya hambat yang lebih baik dibandingkan ekstrak kasarnya. Isolasi dan
pemurnian senyawa aktif dilakukan pada kolom silika gel eluen pelarut organik: n-heksana, kloroform, etil asetat, dan metanol dengan berbagai perbandingan dan
Sephadex LH-20 eluen kloroform-metanol 1:1.
Penentuan Konsentrasi Hambat Minimum KHM Andrews 2001. KHM
ditentukan dengan metode dilusi menggunakan mikrotiter 96-well. Ekstrak dibuat dengan membuat larutan induk 512
μgmL dalam DMSO 30 kemudian diencerkan sehingga diperoleh konsentrasi 128, 64, 32, 16, 8, 4, 2, dan 1
μgmL. Kontrol negatif yang digunakan ialah media Mueller-Hinton broth MHB dan
5 pelarut DMSO 30 , media MHB dan inokulan bakteri, sedangkan kontrol
positifnya ialah kloramfenikol. Sebanyak 100 μL media MHB dimasukkan dalam
mikrotiter 96-well. Selanjutnya, setiap ekstrak sebanyak 100 μL ditambahkan ke
dalam sumur yang sudah terisi media MHB. Ke dalam setiap sumur ditambahkan 100
μL bakteri uji dan diinkubasi pada 37
o
C selama 24 jam. Setelah diinkubasi, diamati timbulnya kekeruhan. Konsentrasi terkecil dari antibakteri yang tidak
menimbulkan kekeruhan pada sumur merupakan nilai KHM. Identifikasi Struktur Kimia Senyawa Aktif.
Identifikasi struktur kimia dari senyawa aktif yang diperoleh ditentukan menggunakan spektrofotometer
ultraviolet, spektrofotometer inframerah, dan spektrometer resonansi magnetik inti. Spektrofotometer UV digunakan untuk menentukan serapan maksimum
senyawa aktif, spektrofotometer inframerah untuk penentuan gugus fungsi dari senyawa aktif, sedangkan strukturnya ditentukan dengan spektrometer resonansi
magnetik inti.
2.3 Hasil dan Pembahasan Rendemen Ekstrak Daun Belawan Putih
