Ekstraksi DNA Amplifikasi DNA dengan teknik PCR Elektroforesis

4

2.3. Metode Kerja

Profil genotip ikan dianalisis menggunakan metode RAPD yang diawali dengan proses ekstraksi DNA genom, amplifikasi DNA menggunakan teknik PCR dan elektroforesis. Sedangkan profil fenotip ikan betok dianalisis menggunakan metode pengukuran karakter morfometrik.

2.3.1. Ekstraksi DNA

Sampel ikan berupa sirip dorsal ditimbang sebanyak 5-10 mg dan dimasukan ke dalam tabung eppendorf 1,5 ml, kemudian dilisis dengan menambahkan TNES urea sebanyak 500 µl dan protein kinase 10 µl. Setelah itu dikocok menggunakan alat vortex dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam atau sampai sirip hancur. Selanjutnya ditambahkan larutan phenolchloroform isoamilalkohol PCL dengan perbandingan 25:24:1 sebanyak 1000 µl dan disentrifuse dengan menggunakan kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit. Supernatan lalu dipindahkan ke tabung baru dan ditambahkan etanol 90 sebanyak 1000 µl dan Na asetat sebanyak 10 µl lalu disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit. Supernatan dibuang dan pellet dikering anginkan sampai etanol menguap. DNA dilarutkan dengan menambahkan rehydration solution sebanyak 100 µl.

2.3.2. Amplifikasi DNA dengan teknik PCR

Sebelum amplifikasi DNA, maka dilakukan terlebih dahulu seleksi primer untuk mendapatkan jenis primer yang sesuai. Amplifikasi DNA dilakukan menggunakan metode PCR dengan komposisi bahan 1 unit dry taq produk Promega, 2 µl DNA template, 2 µl primer dan 21 µl air dengan volume total sebanyak 25 µl. Lalu dimasukkan ke dalam mesin PCR dengan 35 siklus, yaitu denaturasi awal pada 94°C selama 2 menit, denaturasi 94°C selama 1 menit. annealing 36°C selama 1 menit, elongasi 72°C selama 2 menit 30 detik, elongasi akhir 72°C selama 7 menit dan penstabilan suhu 4°C selama 3 menit. 5 Tabel 1. Sekuen primer RAPD yang diuji No Primer Sekuen Nukleotida 5’Æ3’ 1 OPA-02 TGCCGAGCTG 2 OPC-02 GTGAGGCGTC 3 OPC-05 GATGACCGCC Keterangan : T = deoksi Timidin 5’- monofosfat G = deoksi Guanosin 5’- monofosfat C = deoksi Sitidin 5’- monofosfat A = deoksi Adenosin 5’- monofosfat

2.3.3. Elektroforesis

Untuk mengetahui keberhasilan amplifikasi primer yang digunakan, campuran 9 µl hasil PCR dengan 2 µl loading die dielektroforesis pada gel agarose 2 wv dalam larutan TBE dan tegangan 100 volt selama 30 menit. Kemudian, gel direndam agar pita DNA nya dapat terlihat pada cahaya ultraviolet. Selanjutnya, digunakan kamera untuk keperluan dokumentasi. Gene ruler 100bp DNA loader digunakan sebagai standar untuk menentukan ukuran fragmen hasil amplifikasi.

2.3.4. Karakterisasi fenotip morfometrik