3
II. BAHAN DAN METODE
2.1. Waktu dan Lokasi Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Agustus sampai September tahun 2011. Sampel ikan berasal dari 3 lokasi yaitu Jawa Jawa Barat, Sumatera
Jambi, dan Kalimantan Kalimantan Tengah. Analisa genetik ikan dilakukan di Laboratorium Genetik Ikan, Balai Riset Perikanan Budidaya Air Tawar, Sempur,
Bogor, sedangkan pengukuran karakter morfometrik dilakukan di Instalasi Riset Plasma Nutfah, Cijeruk, Bogor.
2.2. Materi Uji
Sampel ikan betok berasal dari 3 lokasi, yaitu dari Kalimantan Tengah Pulang Pisau, Jawa Barat Tasikmalaya, dan Sumatera Jambi, masing masing
10 ekor. Kondisi lingkungan di lokasi sampling adalah perairan rawa Kalimantan Tengah dan kolam budidaya air tawar Jawa Barat dan Sumatera. Sampel ikan
diambil siripnya dan dilarutkan dalam larutan alkohol 70-90 untuk mengawetkan sirip ikan, selanjutnya dilakukan analisis DNA dengan teknik PCR.
Untuk pengukuran karakter morfometrik, diambil masing masing 10 ekor dari populasi dan dihitung panjang yang mencakup seluruh bagian luar tubuh.
Gambar 1. Ikan betok Anabas testudineus Sumber : Dokumentasi pribadi, 2011
4
2.3. Metode Kerja
Profil genotip ikan dianalisis menggunakan metode RAPD yang diawali dengan proses ekstraksi DNA genom, amplifikasi DNA menggunakan teknik PCR
dan elektroforesis. Sedangkan profil fenotip ikan betok dianalisis menggunakan metode pengukuran karakter morfometrik.
2.3.1. Ekstraksi DNA
Sampel ikan berupa sirip dorsal ditimbang sebanyak 5-10 mg dan dimasukan ke dalam tabung eppendorf 1,5 ml, kemudian dilisis dengan
menambahkan TNES urea sebanyak 500 µl dan protein kinase 10 µl. Setelah itu dikocok menggunakan alat vortex dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam
atau sampai sirip hancur. Selanjutnya ditambahkan larutan phenolchloroform isoamilalkohol PCL dengan perbandingan 25:24:1 sebanyak 1000 µl dan
disentrifuse dengan menggunakan kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit. Supernatan lalu dipindahkan ke tabung baru dan ditambahkan etanol 90
sebanyak 1000 µl dan Na asetat sebanyak 10 µl lalu disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit. Supernatan dibuang dan pellet dikering anginkan
sampai etanol menguap. DNA dilarutkan dengan menambahkan rehydration solution
sebanyak 100 µl.
2.3.2. Amplifikasi DNA dengan teknik PCR
Sebelum amplifikasi DNA, maka dilakukan terlebih dahulu seleksi primer untuk mendapatkan jenis primer yang sesuai. Amplifikasi DNA dilakukan
menggunakan metode PCR dengan komposisi bahan 1 unit dry taq produk Promega, 2 µl DNA template, 2 µl primer dan 21 µl air dengan volume total
sebanyak 25 µl. Lalu dimasukkan ke dalam mesin PCR dengan 35 siklus, yaitu denaturasi awal pada 94°C selama 2 menit, denaturasi 94°C selama 1 menit.
annealing 36°C selama 1 menit, elongasi 72°C selama 2 menit 30 detik, elongasi
akhir 72°C selama 7 menit dan penstabilan suhu 4°C selama 3 menit.
5 Tabel 1. Sekuen primer RAPD yang diuji
No Primer
Sekuen Nukleotida 5’Æ3’ 1
OPA-02 TGCCGAGCTG
2
OPC-02 GTGAGGCGTC
3 OPC-05
GATGACCGCC Keterangan :
T = deoksi Timidin 5’- monofosfat G = deoksi Guanosin 5’- monofosfat
C = deoksi Sitidin 5’- monofosfat A = deoksi Adenosin 5’- monofosfat
2.3.3. Elektroforesis
Untuk mengetahui keberhasilan amplifikasi primer yang digunakan, campuran 9 µl hasil PCR dengan 2 µl loading die dielektroforesis pada gel
agarose 2 wv dalam larutan TBE dan tegangan 100 volt selama 30 menit. Kemudian, gel direndam agar pita DNA nya dapat terlihat pada cahaya ultraviolet.
Selanjutnya, digunakan kamera untuk keperluan dokumentasi. Gene ruler 100bp DNA loader
digunakan sebagai standar untuk menentukan ukuran fragmen hasil amplifikasi.
2.3.4. Karakterisasi fenotip morfometrik
Ikan betok yang berasal dari Kalimantan Tengah, Jawa Barat, dan Jambi diambil dari akuarium masing masing 10 ekor. Metode karakteristik morfometrik
dilakukan dengan cara mengukur jarak titik-titik tanda yang akan dibuat pada kerangka tubuh Gambar 2. Skema dan 21 karakteristik morfometrik ikan betok
dapat dilihat pada Gambar 2 dan Tabel 2 Brzesky and Doyle, 1988
Gambar 2. Ikan betok beserta skema karakteristik morfometriknya
6 Tabel 2. Karakteristik morfometrik
No Kode Deskripsi Jarak
1 A1-2
Bawah mulut-ujung bagian atas insang 2
A1-3 Bawah mulut-operkulum
3 A1-4
Bawah mulut-awal sirip punggung 4
A1-5 Bawah mulut-awal sirip perut
5 A2-3
Ujung atas insang-operkulum 6
A2-4 Ujung atas insang-awal sirip punggung
7 A2-5
Ujung atas insang-awal sirip perut 8
A3-4 Operkulum-awal sirip punggung
9 A3-5
Operkulum-awal sirip perut 10
A4-5 Awal sirip punggung-awal sirip perut
11 B5-6
Awal sirip perut-awal sirip anal 12
B5-7 Awal sirip perut-akhir sirip anal
13 B6-4
Awal sirip anal-awal sirip punggung 14
B10-4 Akhir sirip punggung-awal sirip punggung
15 B10-6
Akhir sirip punggung-awal sirip anal 16
C7-8 Awal sirip ekor bawah-awal sirip ekor atas
17 C7-9
Awal sirip ekor bawah-akhir sirip ekor atas 18
C8-9 Akhir sirip ekor bawah-akhir sirip ekor atas
19 C10-7
Akhir sirip punggung-awal sirip ekor bawah 20
C10-8 Akhir sirip punggung-akhir sirip ekor bawah
21 C10-9
Awal sirip punggung-awal sirip ekor atas Keterangan :
A = bagian kepala 1-2, dst = jarak antar titik karakter
B = bagian seluruh tubuh C = bagian ekor
7
2.4. Analisis Data
Keragaman genetik yang meliputi tingkat polimorfisme, heterozigositas, uji perbandingan Fst dianalisa dengan descriptive statistics Miller, 1997, exact test
for population differentiation Raymond Rousset, 1995 dalam Miller, 1997
dengan menggunakan program TFPGA Tools for Population Genetic Analyses. Kekerabatan antar populasi berdasarkan jarak genetik yang disertai dengan
dendrogram dianalisis menggunakan UPGMA Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean
Wright 1978 modifikasi Rogers 1972 dalam Miller 1997 dari software TFGPA. Sedangkan untuk analisis data karakter morfometrik
dianalisis menggunakan microsoft excel, dan program SPSS versi 18 Statistical Product and Service Solution
8
III. HASIL DAN PEMBAHASAN
3.1. Hasil 3.1.1. Profil RAPD
Keragaman profil penanda DNA meliputi jumlah dan ukuran fragmen DNA. Hasil amplifikasi dengan menggunakan primer OPA-02, OPC-02, OPC-05
selengkapnya disajikan pada Tabel 3. Amplifikasi DNA pada 3 populasi dapat dilihat pada Gambar 3-5. Profil DNA teramplifikasi dengan primer OPA-02,
OPC-02, OPC-05 selengkapnya disajikan pada Lampiran 1.
Gambar 3. Amplifikasi OPA-02 pada ikan betok Jawa, Sumatera, dan Kalimantan
1 2
1 3
2 3
1 2
3 M
3000 bp
1000 bp
500 bp
Jawa Sumatera
Kalimantan
4 4
6 5
4 6
5 M
5 6
Jawa Gambar 4. Amplifikasi OPC-02 pada ikan betok Jawa, Sumatera, dan Kalimantan.
500 bp
1000 bp
3000 bp
Sumatera Kalimantan
Kategori