3. METODE Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Mei-November 2013 di laboratorium Biak Sel dan Jaringan Tanaman, Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI
Cibinong Bogor.
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain embrio somatik J. curcas kultivar Dompu yang telah diinisiasi dari eksplan hipokotil embrio buah dewasa
yang diambil dari kebun percobaan PT Indocement Tunggal Tbk, Cibinong dari penelitian sebelumnya Al-Hafiizh, et al., 2012. Media kultur yang digunakan
adalah media MS Murashige dan Skoog, 1962; Lampiran 1, zat pengatur tumbuh 2,4-Dichloro-phenoxyacetic-acid 2,4-D, Kinetin, isopentenyl-amino-
purine 2-iP, 6-Benzyl-amino-purine BAP, Indole-3-acetic-acid IAA, Indole- 3-butyric-acid IBA, Polyethylene-glycol PEG dan sukrosa. Alat yang
digunakan adalah peralatan kultur jaringan diantaranya: laminar air flow cabinet, autoclave, shaker, timbangan analitik, pH meter, erlenmeyer, pipet, pisau skalpel,
lampu spiritus, alkohol, dan hand sprayer.
Analisis Data
Data kuantitatif dianalisis dengan menggunakan Analysis of Variance ANOVA untuk mengetahui pengaruh antar perlakuan. Perlakuan yang berbeda
nyata kemudian di uji lanjut dengan menggunakan Duncan’s Multiple Range Test
DMRT dengan tingat kepercayaan 1 dan 5. Model statistik percobaan acak lengkap dengan dua faktor menurut Mattjik dan
Sumertajaya 2006, yaitu: Y
ijk
= μ + α
i
+ β
j
+ αβ
ij
+ ε
ijk
Dimana, i = 1,2…,r; j=1,2…,r; k=1,2…r
Y
ijk
= Nilai pengamatan pada faktor pertama taraf ke-1 faktor kedua taraf ke-j dan ulangan ke-k
μ = Rataan umum α
i
= Pengaruh utama Faktor pertama β
j
= Pengaruh utama Faktor kedua αβ
ij
= Pengaruh interaksi faktor pertama ke-i dan faktor kedua ke-j ε
ijk
= Pengaruh galat untuk pengamatan taraf ke i,j,k
Pelaksanaan Percobaan Percobaan I. Proliferasi Embrio Somatik
Penelitian ini
bertujuan untuk
mengetahui perlakuan
sukrosa dikombinasikan dengan 2,4-D terhadap proliferasi embrio somatik J. curcas.
Media dasar yang digunakan adalah media MS Murashige dan Skoog, 1962; Lampiran 1. Rancangan percobaan adalah Rancangan Acak Lengkap RAL
faktorial dengan dua faktor. Faktor pertama adalah konsentrasi sukrosa dengan 4 taraf yaitu: 20, 30, 40 dan 50 gl sedangkan faktor kedua adalah konsentrasi zat
pengatur tumbuh 2,4-D dengan 5 taraf yaitu: 0.0; 0.5; 1.0; 1.5; dan 2.0 mgl.
Setiap perlakuan terdiri dari 5 cawan petri sebagai ulangan, setiap cawan petri diisi dengan 5 clump embrio somatik pada fase globular dengan diameter 0.4-0.5
cm dengan berat 0.025-0.030 g, sehingga jumlah satuan percobaan sebanyak 500 satuan percobaan. Peubah yang diamati adalah diameter clump embrio, skor
jumlah embrio, warna embrio, ukuran embrio dan morfologi embrio. Pengamatan diameter clump embrio dan skor jumlah embrio dilakukan seminggu sekali pada
umur 0-8 minggu setelah kultur. Skor jumlah embrio 1: Sangat sedikit jumlah embrio kurang dari 20; 2: sedikit jumlah embrio 21-40, 3: Sedang jumlah
embrio 41-60, 4: Banyak jumlah embrio 61-80, 5: Sangat banyak jumlah embrio lebih besar dari 80. Pengamatan warna embrio, ukuran embrio dan
morfologi embrio dilakukan pada umur 8 minggu setelah kultur. Embrio berukuran kecil ukuran diameter: 0-0.5 mm, sedang ukuran diameter: 0.5-2 mm,
besar ukuran diameter: lebih dari 2 mm.
Percobaan II. Perkecambahan Embrio Somatik
Tahap penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh perlakuan sukrosa yang dikombinasikan dengan PEG terhadap perkecambahan embrio
somatik J. curcas. Pada tahap ini, embrio somatik hasil proliferasi dikulturkan pada media padat sesuai perlakuan.
Media dasar yang digunakan adalah media MS Murashige dan Skoog, 1962; Lampiran 1. Rancangan yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap
RAL dengan dua faktor. Faktor pertama adalah konsentrasi sukrosa dengan 4 taraf yaitu: 20, 30, 40, dan 50 gl media sedangkan faktor kedua adalah
konsentrasi PEG dengan 5 taraf yaitu: 0.0; 2.5; 5.0; 10.0; dan 15.0. Setiap perlakuan terdiri dari 5 cawan petri sebagai ulangan dimana setiap cawan petri
diisi dengan 5 clump embrio somatik pada fase globular dengan diameter 0.4-0.5 cm dengan berat 0.025-0.030 g, sehingga jumlah satuan percobaan sebanyak 500
satuan percobaan. Peubah yang diamati adalah diameter clump embrio, jumlah embrio berkecambahclump, persentase kecambah normal, persentase clump
berkecambah, warna embrio, serta struktur dan morfologi. Pengamatan jumlah embrio berkecambahclump dilakukan seminggu sekali pada umur 0-8 minggu
setelah kultur. Pengamatan diameter clump embrio, persentase kecambah normal, persentase clump berkecambah, warna embrio, serta morfologi kecambah
dilakukan pada umur 8 minggu setelah kultur.
Percobaan III. Optimasi Pertumbuhan Planlet Hasil Regenerasi Embrio Somatik
Tujuan tahap penelitian ini adalah untuk mengetahui pengaruh Kinetin, 2- iP dan BAP pada konsentrasi yang berbeda terhadap pertumbuhan planlet J.
curcas yang berasal dari embrio somatik. Media dasar yang digunakan adalah media MS Murashige dan Skoog,
1962; Lampiran 1. Rancangan yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap RAL dengan dua faktor. Faktor pertama adalah jenis zat pengatur tumbuh yang
digunakan Kinetin, 2-iP dan BAP sedangkan faktor kedua adalah konsentrasi zat pengatur tumbuh dengan 4 taraf yaitu: 0.0; 0.5; 1.0; dan 2.0 mgl. Setiap
perlakuan terdiri dari 5 botol sebagai ulangan, setiap botol berisi 3 planlet sehingga jumlah satuan percobaannya sebanyak 180 satuan percobaan. Planlet
berasal dari embrio yang dikulturkan pada media MS tanpa penambahan zat
pengatur tumbuh selama 8 minggu hingga membentuk kecambah. Kecambah embrio kemudian disubkultur ke media MS hingga umur 2 minggu. Planlet yang
telah membentuk tunas dengan 2-3 daun dan tinggi 1-1.5 cm serta telah memiliki calon akar kemudian dikulturkan pada media sesuai dengan perlakuan. Peubah
yang diamati adalah jumlah daun, tinggi tanaman, jumlah buku, jumlah akar, bobot basah serta morfologi planlet. Pengamatan jumlah daun dan tinggi tanaman
dilakukan seminggu sekali pada umur 0-8 minggu setelah kultur. Pengamatan jumlah buku, jumlah akar, bobot basah serta morfologi planlet dilakukan pada
umur 8 minggu setelah kultur.
Percobaan IV. Induksi Pengakaran Planlet dan Aklimatisasi
Tujuan dari penelitian tahap ini adalah untuk mengetahui pengaruh media dasar ½MS dan MS yang dikombinasikan dengan konsentrasi Indole-3-Acetic
Acid IAA dan Indole-3-butyric acid IBA terhadap pengakaran planlet J. curcas yang berasal dari embrio somatik.
Media dasar yang digunakan adalah media MS Murashige dan Skoog, 1962; Lampiran 1. Rancangan yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap
RAL dengan dua faktor. Faktor pertama adalah media dasar ½MS dan MS sedangkan faktor kedua adalah zat pengatur tumbuh IAA dan IBA dengan
konsentrasi 0.0, 1.0 dan 2.0 mgl. Setiap perlakuan terdiri dari 4 ulangan. Jumlah satuan percobaan adalah sebanyak 40 satuan percobaan. Planlet berasal dari
embrio yang dikulturkan pada media MS tanpa penambahan zat pengatur tumbuh selama 8 minggu hingga membentuk kecambah. Kecambah embrio kemudian
dikulturkan pada media MS dengan penambahan 1 mgl 2-iP hingga umur 4 minggu. Bagian pangkal batang planlet yang membesar dan membentuk kalus
dipotong, kemudian planlet yang telah membentuk tunas dengan 2-3 daun dan tinggi 2-3 cm tersebut dikulturkan pada media sesuai dengan perlakuan. Peubah
yang diamati adalah tinggi tanaman, jumlah daun, jumlah akar, panjang akar, serta morfologi planlet warna, bentuk dan performa planlet. Pengamatan tinggi
tanaman, jumlah daun, jumlah akar dan panjang akar dilakukan seminggu sekali pada umur 0-8 minggu setelah kultur. Pengamatan morfologi planlet dilakukan
pada umur 8 minggu setelah kultur.
Aklimatisasi dilakukan setelah planlet berumur 10 minggu dan telah terbentuk akar. Planlet berasal dari embrio yang dikulturkan pada media MS tanpa
penambahan zat pengatur tumbuh selama 8 minggu hingga membentuk kecambah. Kecambah embrio kemudian dikulturkan pada media MS yang
mengandung 1 mgl 2-iP hingga umur 8 minggu. Bagian pangkal batang planlet yang membesar dan membentuk kalus dipotong kemudian dikulturkan pada media
½MS hingga membentuk akar umur 2 minggu. Setelah planlet siap untuk aklimatisasi, planlet kemudian dikeluarkan dari botol, kemudian akar planlet
dibersihkan dari media dengan menggunakan air hingga bersih. Untuk menghindari kontaminasi jamur, pangkal planlet dicelupkan dalam 3 gl fungisida
selama 1 menit. Planlet J. curcas kemudian ditanam pada pot berdiameter 10 cm berisi media tanam dengan komposisi tanah, pupuk kompos dan sekam bakar
dengan perbandingan: 1;1;1. Setelah planlet J. curcas ditanam, media tanam disiram dengan air hingga kapasitas lapang kemudian disungkup dengan plastik
transparan untuk mengurangi evapotranspirasi lalu ditempatkan di daerah yang tidak terkena matahari langsung.
4. HASIL DAN PEMBAHASAN Percobaan I. Optimasi Proliferasi Embrio Somatik
J. curcas
Pola perkembangan diameter clump embrio somatik J. curcas yang ditanam pada media MS dengan penambahan 20, 30, 40 dan 50 gl sukrosa yang
dikombinasikan dengan 0.0, 0.5, 1.0, 1.5 dan 2.0 mgl 2,4-D pada umur 1-8 minggu setelah kultur dapat dilihat pada Gambar 2. Pada perlakuan 20 gl sukrosa
pertumbuhan diameter kalus embrio somatik mulai terlihat pada umur 1 minggu. Diameter terus meningkat antara minggu ke 1-6 setelah kultur. Pada umur 6
minggu pertumbuhan diameter embrio dengan perlakuan 1.5 mgl 2,4-D terhenti dan tidak menunjukkan adanya peningkatan hingga umur 8 minggu. Pada
perlakuan tanpa penambahan 2,4-D pertumbuhan diameter embrio lambat, namun terdapat pertumbuhan hingga embrio berumur 8 minggu. Pada umur 6-8 minggu
diameter embrio pada perlakuan 1 mgl 2,4-D tidak berbeda dengan 0.5, 1.5 dan 2.0 mgl 2,4-D Gambar 2A.
Gambar 2. Pertumbuhan diameter clump embrio somatik J. curcas umur 0-8 minggu pada media MS dengan penambahan 2,4-D pada konsentrasi
0.0, 0.5, 1.0, 1.5 dan 2.0 mgl yang dikombinasikan dengan sukrosa. A 20 gl sukrosa, B 30 gl sukrosa, C 40 gl sukrosa dan D 50 gl sukrosa.
B
C D
A
Pada perlakuan 30 gl sukrosa pertumbuhan diameter kalus embrio somatik J. curcas meningkat mulai minggu ke 1 hingga minggu ke 6 setelah kultur. Pada
perlakuan 0.5 mgl 2,4-D pertumbuhan diameter embrio meningkat lebih tinggi pada umur 3-5 minggu tetapi pada umur 6-8 minggu diameter embrio tidak
berbeda dengan perlakuan 1.0, 1.5 dan 2.0 mgl 2,4-D. Diameter embrio pada umur 8 minggu hampir sama untuk seluruh perlakuan kecuali perlakuan tanpa 2,4-
D yang lebih rendah Gambar 2B.
Perlakuan 40 gl sukrosa, dengan penambahan 0-2 mgl 2,4-D pertumbuhan menghasilkan diameter embrio relatif sama pada umur 1-5 minggu. Pada umur 6-
8 minggu pertumbuhan diameter embrio pada perlakuan 1 mgl 2,4-D meningkat sehingga pada umur 8 minggu lebih tinggi dibandingkan dengan perlakuan
lainnya Gambar 2C.
Pada perlakuan 50 gl sukrosa pertumbuhan diameter embrio untuk seluruh perlakuan 2,4-D menunjukkan peningkatan pada umur 1-8 minggu setelah kultur.
Pada umur 1-2 minggu pertumbuhan diameter embrio lambat sedangkan pada umur 2-8 minggu pertumbuhan diameter embrio meningkat. Pada umur 8 minggu
diameter embrio tertinggi terdapat pada perlakuan tanpa 2,4-D kemudian diikuti perlakuan 1.0, 1.5, 2.0 dan 0.5 mgl 2,4-D Gambar 2 D.
Pada beberapa tanaman auksin 2,4-D lebih efektif dibandingkan dengan IAA atau IBA untuk meningkatkan proliferasi kultur embriogenik. Pada konsentrasi
rendah 2,4-D dapat memblok ekspresi gen-gen yang dibutuhkan untuk perubahan bentuk perkembangan tahap hati, kotiledon dan perkecambahan sehingga proses
proliferasi dapat terus berlangsung Sianipar et al., 2007. Hal ini serupa pada embrio J. curcas pada perlakuan 30 dan 40 gl sukrosa dimana pada perlakuan 1
mgl menghasilkan diameter embrio yang tinggi Gambar 2B dan 2C.
Pada perlakuan 50 gl sukrosa tanpa penambahan 2,4-D diperoleh diameter tertinggi pada embrio J. curcas umur 8 minggu Gambar 2D. Hal ini dapat terjadi
karena dalam proses pembelahan sel embrio somatik J. curcas sudah mendapatkan cukup stres dari tingginya konsentrasi sukrosa yang diberikan,
sehingga pada konsentrasi 50 gl sukrosa ini pemberian 2,4-D mengakibatkan pertumbuhan diameter kalus embrio somatik menurun. Selain berfungsi sebagai
sumber karbon, sukrosa juga berguna untuk mempertahankan tekanan osmotik pada media Purnamaningsih, 2002. Sukrosa memiliki pengaruh signifikan pada
tahap perkembangan embrio somatik. Konsentrasi sukrosa yang optimal dapat meningkatkan formasi embrio somatik pada tanaman Carica papaya Mora et al.,
2012.
Perkembangan jumlah embrio somatik J. curcas yang ditanam pada media MS dengan 20, 30, 40 dan 50 gl sukrosa yang dikombinasikan dengan 0.0, 0.5,
1.0, 1.5 dan 2.0 mgl 2,4-D mulai umur 1-8 minggu setelah kultur dapat dilihat pada Gambar 3. Pada perlakuan 20 gl sukrosa jumlah embrio somatik mulai
mengalami peningkatan pada umur 2 minggu. Mulai umur 2 minggu jumlah embrio meningkat sampai minggu ke-6. Pada perlakuan 1.0, 1.5 dan 2.0 mgl 2,4-
D jumlah embrio meningkat pada umur 1-4 minggu dan lebih cepat dibandingkan dengan perlakuan 0 dan 0.5 mgl 2,4-D. Pada umur 6-8 minggu jumlah embrio
tidak bertambah. Pada umur 8 minggu jumlah embrio somatik terendah terdapat pada perlakuan tanpa penambahan 2,4-D Gambar 3A.
Kategori