4
4. Identifikasi Bakteri
a. Pewarnaan bakteri
Suspensi bakteri diambil sebanyak 1 ujung mata ose, diratakan pada gelas obyek yang telah dibebaslemakkan dengan dipanasi diatas nyala bunsen sampai kering, ditetesi
formalin 1 didiamkan 5 menit, dikeringkan lagi dan preparat siap dicat. Preparat yang telah siap dicat digenangi cat gram A 1–3 menit, kemudian digenangi cat gram B 0,5–1
menit, cat kemudian dibuang dan dicuci dengan air. Kemudian ditetesi cat gram C sampai warna cat dilunturkan, kemudian preparat digenangi cat gram D 1–2 menit, dicuci dan
dikeringkan dalam suhu kamar. Preparat diamati di bawah mikroskop dengan pembesaran 1000x dengan bantuan minyak imersi.
b. Uji biokimiawi
Bakteri Salmonella typhi yang telah dibiakkan ditanam pada media KIA, LIA, dan MIO. Diinkubasi pada suhu 37°C selama 18-24 jam. Analisis hasil dilakukan berdasarkan
karakteristik bakteri Salmonella typhi terhadap media tersebut.
5. Uji Aktivitas Antibakteri
a. Sterilisasi alat dan bahan
Alat gelas yaitu cawan petri, tabung reaksi, pipet volume, labu takar, tabung reaksi dicuci sampai bersih, dikeringkan, dibungkus kertas, kemudian dimasukkan dalam oven
pada 175°C selama 90-120 menit. Alat dan bahan yang tidak tahan pemanasan kering yaitu yellow tips, blue tips, pipet tetes, dan media disterilisasi dengan menggunakan autoklaf
pada suhu 121°C selama 20 menit. Setelah disterilkan alat langsung dipakai atau disimpan dalam keadaan tertutup rapat, untuk media yang tidak langsung digunakan, disimpan pada
suhu 4°C.
b. Pembuatan media
Bahan yang digunakan telah tersedia dipasaran dalam bentuk kemasan. Pembuatan media sesuai dengan instruksi pada kemasan tersebut. Jumlah bahan yang ditimbang untuk
tiap liter yaitu media MH 38 gram, BHI 37 gram. Kemudian disterilisasi dengan autoklaf 121°C selama 20 menit, dituang pada cawan petri, didiamkan pada suhu kamar sampai
memadat. Media yang tidak langsung digunakan disimpan pada suhu 4°C dalam lemari es.
c. Pembiakan bakteri
Satu mata ose dari stok bakteri Salmonella typhi digoreskan secara streak plate pada media MH padat, diinkubasi pada suhu 37°C selama 18-24 jam. Setelah koloni
bakteri Salmonella typhi tumbuh, disimpan pada suhu 4°C dalam almari es.
5
d. Pembuatan suspensi bakteri
Sebanyak 3–5 koloni bakteri diambil dari stok bakteri 24 jam pada agar, kemudian disuspensikan dalam 5 mL media BHI, diinkubasi pada suhu 37°C selama 2–6 jam. Mc.
Farland 1,5x10
8
CFUmL digunakan sebagai standar untuk menyamakan kekeruhan suspensi bakteri. Suspensi yang lebih keruh dari standar ditambah dengan larutan salin.
Setelah sesuai dengan standar, suspensi bakteri diambil 300 µL setiap pengujian.
e. Uji sensitivitas bakteri
Sebanyak 300 µL suspensi bakteri setara 1,5x10
8
CFUmL ditanam pada cawan berisi media MH, diratakan dengan spreader glass, kemudian disk antibiotik ampisilin,
amikasin, amoksisilin, eritromisin, gentamisin, kloramfenikol, sefalotin, streptomisin, tertrasiklin, trimetoprim-sulfamatoksazol diletakkan diatas permukaan media yang telah
diinokulasi bakteri. Diinkubasi pada suhu 37°C selama 18-24 jam. Selanjutnya diukur diameter zona hambat masing-masing antibiotik.
f. Pembuatan seri konsentrasi minyak atsiri daun kemangi
Pelarut yang tepat diperlukan untuk melarutkan minyak atsiri kemangi, sehingga dilakukan uji kelarutan dan sensitivitas bakteri terhadap pelarut yaitu PEG, CMC Na,
tween, DMSO, span, gliseril, propilen glikol, kloroform, n-heksan, dan etil asetat. Seri konsentrasi minyak atsiri kemangi yang dibuat yaitu 2,5 ; 5 ; 7,5 ; 10 ; 15 ; 25 ;
35 ; 45 dengan melarutkan 12,5 µL ; 25 µL ; 37,5 µL ; 50 µL ; 75 µL ; 125 µL ; 175 µL ; 225 µL minyak atsiri murni dalam 0,5 mL etil asetat.
g. Uji aktivitas antibakteri metode difusi
Sebanyak 20 mL media MH dimasukkan dalam cawan petri steril, didiamkan kurang lebih 30 menit sampai keras. Diambil 300 µL suspensi bakteri setara dengan
1,5x10
8
CFUmL, dimasukkan dalam media MH, dan diratakan dengan spreader glass steril pada permukaan media MH, didiamkan 3-15 menit sebelum penanaman disk. Disk
ditempatkan menggunakan pinset steril. Kedua disk ditempatkan sejajar dengan mengukur jarak yang sama dengan jumlah diameter zona radikal minyak atsiri dan antibiotik. Setiap
disk ditekan untuk memastikan kontak yang sempurna dengan permukaan agar. Kemudian diinkubasi pada suhu 35°C ± 2°C selama 16-18 jam dalam inkubator. Cawan petri dibalik
dan jangan ditumpuk lebih dari lima cawan petri pada saat inkubasi. Pengamatan dilakukan dengan pengukuran diameter zona hambat Verma, 2007 yang dimodifikasi.
6
HASIL DAN PEMBAHASAN A.
Determinasi Tanaman
Determinasi tanaman dilakukan dengan memastikan morfologi suatu tanaman dengan pustaka acuan Flora of Java Backer, dan Van den Brink, 1965, determinasi dapat
menghindarkan kesalahan pada pengumpulan bahan penelitian. Determinasi ini dilakukan di Laboratorium Biologi Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah Surakarta. Hasil
yang diperoleh dari determinasi adalah sebagai berikut : Kunci identifikasi :
1b-2b-3b-4b-12b-13b-14b-17b-18b-19b-20b-21b-22b-23b-24b-25b-26b-27a-28b-29b-30b- 31b-403a-414a-415a-451a-452b-453a-454a-455b-456b-457a-Lamiaceae-1b-2b-3b-5b-7b-
8c-11a-12b-16b-18a-19a-Ocimum-1a-2a-3a-Ocimum basilicum L. Dari hasil yang diperoleh dapat dipastikan bahwa tanaman yang digunakan adalah
Ocimum basilicum L.
B. Destilasi
Batang dan daun kemangi didestilasi yang segar agar memperoleh hasil minyak atsiri yang lebih banyak. Minyak yang diperoleh dimasukkan ke dalam flakon yang telah
dibungkus rapat dengan alumunium foil, dan disimpan pada suhu 4
o
C. Sebanyak 27850 gram batang dan daun kemangi menghasilkan 29 mL minyak atsiri. Rendemen yang
dihasilkan pada proses destilasi yang dilakukan selama penelitian sebesar 0,0967 bb.
C. Penetapan Fisik Minyak Atsiri
Penetapan bobot jenis dan indeks bias minyak atsiri kemangi dilakukan untuk mengetahui kemurnian minyak atsiri yang telah diperoleh dari destilasi. Penetapan
dilakukan di LPPT Universitas Gadjah Mada pada 1 November 2013 Tabel 1.
Tabel 1.Hasil uji penetapan sifat fisik minyak atsiri kemangi Ocimum basilicum L.
Parameter Uji
Hasil Uji Hasil Maryati,
2007 Hasil Khelifa
et al, 2012 Standar Ketaren, 1985
Bobot Jenis 0,9292 gcm
3
Gravimetri 0,925 ± 7,36
x10
-6
gcm
3
0,93 ± 0,02 gcm
3
0,9246–0,9303gcm
3
Indeks Bias 1,4880
Refraktometri 1,477 ±
4,078x10
-5
. 1,466 ± 0,04
1,49250–1,49597
Berdasarkan tabel hasil penetapan sifat fisik minyak atsiri kemangi dengan bobot jenis 0,9292 gcm3 dan indeks bias 1,4880 gcm3. Bobot jenis minyak atsiri kemangi
berkisar 0,9246 - 0,9303 gcm
3
sedangkan indeks bias berkisar 1,49250-1,49597 Ketaren, 1985. Dalam Khelifa et al 2012 disebutkan bahwa indeks bias kemangi sebesar
7 1,466±0,04, sedangkan bobot jenisnya 0,93±0,02. Minyak mengandung air nilai indeks
biasnya akan lebih rendah, sedangkan nilai bobot jenis yang rendah mengindikasikan adanya pemalsuan, sifat kelarutan minyak atsiri rendah, atau umur minyak telah lama
Ketaren, 1987 cit Hadipoentianty, 2008.
D. Identifikasi Bakteri
1. Metode Pengecatan Gram
Identifikasi bakteri dilakukan dengan metode pengecatan Gram dan uji biokimiawi, yang bertujuan untuk menggolongkan bakteri. Pengecatan Gram bakteri dilakukan agar
bakteri dapat dengan jelas diamati dibawah mikroskop, hal ini dikarenakan terdapat perbedaan warna antara sel bakteri dan latar belakangnya setelah dilakukan pengecatan
Gram. Berdasarkan hasil yang diperoleh pada pengamatan di bawah mikroskop setelah
dilakukannya pengecatan Gram, Salmonella typhi mempunyai bentuk batang berwarna merah. Hal ini dikarenakan Salmonella typhi tidak tahan terhadap alkohol, sehingga cat
pertama dilunturkan dan bakteri akan mengikat warna kontras dan tampak merah. Lipid dalam dinding sel bakteri Gram negatif larut dengan alkohol, sehingga pori-pori pada
dinding sel membesar dan zat warna yang sudah diserap akan dilepaskan kembali Radji, 2011.
Gambar 2. Hasil Uji Identifikasi Bakteri dengan Pengecatan Gram
2. Uji Biokimiawi
Identifikasi sifat bakteri dengan KIA, LIA, MIO. KIA merupakan media gabungan yang mengandung glukosa, laktosa, fenol merah, dan ferri sitrat. Identifikasi menggunakan
KIA menghasilkan perubahan warna dari merah menjadi kuning asam pada bagian tegak, miring berwarna merah basa, dan terlihat warna hitam pada bagian tengah media. Hal ini
menunjukkan bahwa bakteri Salmonella typhi memfermentasi laktosa dan glukosa, serta menghasilkan asam sulfida.
Uji dengan media LIA digunakan untuk mengetahui kelakuan bakteri dalam menghasilkan asam sulfida dan terhadap lisin. Berdasarkan identifikasi dengan LIA
Salmo Sedan
pada l kemam
terjadi kabut
media media
siklus ornitin
3. Uj
Kategori