Alat- alat Pembuatan Ekstrak

26

BAB III METODE PENELITIAN

Metode penelitian yang dilakukan adalah metode eksperimental. Tahap penelitian menyeliputi penyiapan bahan, karakterisasi simplisia, uji golongan senyawa kimia dan pembuatan ekstrak teripang Holohuria scabra Jaeger dengan cara maserasi berkesinambungan yang dimulai dari ekstrak n-heksan, etilasetat dan etanol secara berturut-turut. Pengujian aktivitas antibakteri masing-masing ekstrak menggunakan metode difusi agar dengan cakram kertas.Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Farmakognosi dan Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara.Penelitian dilakukan dari Oktober 2014 sampai Maret 2015.

3.1 Alat- alat

Alat- alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah alat- alat gelas,alat tanur, aluminium foil, autoklaf Fisons, blender Philips,cakram kertas, cawan petri, inkubator Fiber Scientific,jarum ose, jangka sorong,kaca objek, Laminar Air Flow Cabinet Astec HLF I200 L,lampu Bunsen, lemari pendinginToshiba, lemari pengering, oven Memmert,pipet mikro Eppendorf, pinset, rotary evaporator Haake D, spektrofotometervisible Dynamica Halo Vis-10 dan timbangan analitik Mettler Toledo. 3.2Bahan- bahan Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah teripang Holothuria scabra Jaeger, air suling, muller hinton agar, nutrient broth dan 27 bahan-bahan yang berkualitas proanalisa E.Merck: etanol, dimetilsulfoksida DMSO,n-heksana, etilasetat, raksa II klorida, natrium hidroksida, iodium, bismuth III nitrat, kalium iodida, besi III klorida, α-naftol, asam nitrat pekat, asam klorida pekat, asam sulfat pekat, timbal II asetat, asam asetat anhidrat, isopropanol, kloroform, metanol,natrium klorida, benzena, serbuk magnesium, toluena dan amil alkohol. Bakteri yang digunakan adalah bakteri Staphylococcus aureus ATCC 25923 dan Pseudomonas aeruginosaATCC 25922. 3.3 Penyiapan Sampel 3.3.1 Pengumpulan Sampel Pengumpulan sampel dilakukan secara purposif, yaitu tanpa membandingkan dengan daerah lain. Sampel yang digunakan adalah teripang dari Perairan Sibolga, Pulau Panjang, Provinsi Sumatera Utara, Kabupaten Tapanuli Tengah, Kecamatan Manduamas.

3.3.2 Identifikasi Sampel

Identifikasi sampel dilakukan di Pusat Penelitian Oseaonografi LIPI Jakarta.

3.3.3. Pengolahan Sampel

Teripang dibersihkan dari kotoran dengan cara dicuci di bawah air mengalir hingga bersih, kemudian dipisahkan dari bagian dalam perut dan diperkecil potongan. Ditiriskan lalu ditimbang kemudian disebar diatas wadah. Sampel dikeringkan dengan cara diangin-anginkan di udara terbuka, kemudian dikeringkan di lemari pengering.Teripang yang sudah kering ini disebut simplisiahewan. Simplisia diblender, ditimbang beratnya. Simplisia disimpan dalam wadah plastik dan disimpan di tempat yang terlindung dari cahaya. 28 3.4 Pembuatan Pereaksi 3.4.1 Pereaksi Meyer Sebanyak 2,266 g raksa II klorida dilarutkan dalam air suling hingga 100 ml. Pada wadah lain, 50 g kalium iodida dilarutkan dalam 100 ml air suling. Kemudian 60 ml larutan I dicampurkan dengan 10 ml larutan II dan ditambahkan air suling hingga 100 ml Depkes RI, 1989.

3.4.2 Pereaksi Natrium Hidroksida 2 N

Sebanyak 8,002 g Natrium hidroksida ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air suling hingga 100 ml Ditjen POM, 1979.

3.4.3 Pereaksi Bouchardat

Sebanyak 4 g Kalium Iodida ditimbang kemudian dilarutkan dalam air suling secukupnya sampai KI larut dengan sempurna, lalu ditambahkan 2 g iodium sedikit demi sedikit. Setelah semuanya larut, dicukupkan dengan air suling hingga volume 100 ml Depkes RI, 1989.

3.4.4 Pereaksi Dragendorff

Sebanyak 8,0 g bismuth II nitrat dilarutkan dalam 20 ml asam nitrat dan dilarutkan 27,2 g kalium iodida dalam 50 ml air suling. Campur kedua larutan dan dicukupkan dengan air suling hingga 100 ml Depkes RI, 1989.

3.4.5 Pereaksi Besi III Klorida 1

Sebanyak 1 g besi III klorida ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air suling hingga 100 ml, lalu disaring Ditjen POM, 1979.

3.4.6 Pereaksi Asam Klorida 2 N

Asam klorida pekat sebanyak 16,6 ml ditambahkan air suling sampai 100 ml Ditjen POM, 1979. 29

3.4.7 Pereaksi Timbal II Asetat 0,4 M

Sebanyak 15,17 g timbal asetat ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air suling bebas karbon dioksida hingga 100 ml Depkes RI, 1989.

3.4.8 Pereaksi Liebermann-Burchard

Sebanyak 10 tetes asam asetat anhidrat dicampur dengan 1 tetes asam sulfat pekat.Larutan selalu dibuat baru Depkes RI, 1989.

3.4.9 Pereaksi Molisch

Sebanyak 3 g alfa naftol dilarutkan dalam 15 ml etanol 95 ditambahkan dengan asam nitrat 0,5 N secukupnya hingga diperoleh larutan 100 ml Depkes RI, 1989. 3.5 Karakterisasi Simplisia 3.5.1 Pemeriksaan Makroskopik Pemeriksaan makroskopik dilakukan terhadap serbuk simplisia teripang Holothuria scabra Jaeger dengan mengamati bentuk, bau, rasadan warna.

3.5.2 Pemeriksaan Mikroskopik

Pemeriksaan mikroskopik dilakukan terhadap serbuk simplisia teripang Holothuria scabra Jaeger. Serbuk simplisia ditaburkan di atas kaca objek yang telah ditetesi dengan larutan kloralhidrat dan ditutup dengan kaca penutup, kemudian diamati di bawah mikroskophasil dapat dilihat pada Lampiran 2, halaman 58. 3.5.3 Penetapan Kadar Air Penetapan kadar air dilakukan dengan metode azeotropi destilasi toluena. Cara penetapan: ke dalam labu alas bulat dimasukkan 200 ml toluena dan 2 ml air 30 suling, lalu didestilasi selama 2 jam. Toluena dibiarkan mendingin selama 30 menit dan dibaca volume air pada tabung penerima dengan ketelitian 0,05 ml. Labu alas bulat tersebut dimasukkan 5 g serbuk simplisia yang telah ditimbang seksama, labu dipanaskan dengan hati- hati selama 15 menit. setelah toluena mendidih, kecepatan tetesan diatur lebih kurang 2 tetes tiap detik, hingga sebagian air terdestilasi, kemudian dinaikkan kecepatan tetesan hingga 4 tetes tiap detik. Semua air terdestilasi, kemudian bagian dalam pendingin dibilas dengan toluena yang telah jenuh.Destilasi dilanjutkan selama 5 menit, kemudian tabung penerima dibiarkan mendingin sampai suhu kamar. Air dan toluena memisah sempurna, volume air dibaca dengan ketelitian 0,05 ml. Selisih kedua volume air dibaca sesuai dengan kandungan air yang terdapat dalam bahan yang diperiksa. Kadar air dihitung dalam persen WHO, 1992.

3.5.4 Penetapan Kadar Sari Larut Dalam Air

Sebanyak 5 g serbuk simplisia dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml air-kloroform 2,5 ml kloroform dalam aquadest sampai 1 L dengan menggunakan botol bersumbat sambil sekali-kali dikocok selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18-24 jam dan disaring. Sebanyak 20 ml filtrat pertama diuapkan hingga kering dalam cawan yang berdasar rata yang telah dipanaskan dan ditara.Residu dipanaskan dalam oven pada suhu 105 o C sampai diperoleh bobot tetap.Kadar sari yang larut dalam air dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan Depkes RI, 1995.

3.5.5 Penetapan Kadar Sari Larut Dalam Etanol

Sebanyak 5 g serbuk simplisia dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml etanol 96 dengan menggunakan botol bersumbat sambil sekali-kali dikocok 31 selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18-24 jam dan disaring. Sebanyak 20 ml filtrat pertama diuapkan hingga kering dalam cawan yang berdasar rata yang telah dipanaskan dan ditara.Residu dipanaskan dalam oven pada suhu 105 o C sampai diperoleh bobot tetap.Kadar sari yang larut dalam air dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan Depkes RI, 1995.

3.5.6 Penetapan Kadar Abu Total

Sebanyak 2,5 g serbuk simplisia yang telah digerus dan ditimbang seksama, dimasukkan ke dalam krus porselin yang telah dipijar dan ditara, kemudian diratakan. Kurs porselin bersama isinya dipijarkan perlahan hingga arang habis, dinginkan, ditimbang sampai diperoleh bobot yang tetap.Kadar abu dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara Depkes RI, 1995.

3.5.7 Penetapan Kadar Abu Yang Tidak Larut Asam

Abu yang diperoleh pada penetapan kadar abu total dididihkan dengan 25 ml asam klorida encer selama 5 menit, bagian yang tidak larut asam dikumpulkan, disaring dengan kertas saring, lalu cuci dengan air panas. Kemudian residu dan kertas saring dipijarkan sampai diperoleh bobot yang tetap, dinginkan dan ditimbangberatnya.Kadar abu yang tidak larut asam dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara Depkes RI, 1995. 3.6 Pemeriksaan Senyawa Kimia 3.6.1 Pemeriksaan Alkaloida Serbuk simplisiaditimbang sebanyak 0,5 g kemudian ditambahkan 1 ml asam klorida 2 N dan 9 ml air suling, dipanasakan di atas penangas air selama 2 menit. Didinginkan dan disaring. 32 Filtrat dipakai untuk percobaan sebagai berikut: a. Filtrat sebayak 3 tetes ditambah dengan 2 tetes larutan pereaksi Meyer, akan terbentuk endapan menggumpal bewarna putih atau kuning. b. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambah dengan 2 tetes larutan pereaksi Bouchardat, akan terbentuk endapan berwarna coklat sampai hitam. c. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambah dengan 2 tetes larutan pereaksi Dragendorff, akan terbentuk endapan merah atau jingga. Alkaloida positif jika terjadi endapan atau kekeruhan paling sedikit duadari tiga percobaanDepkes RI, 1995.

3.6.2 Pemeriksaan Flavonoida

Sebanyak 0,5 g serbuk simplisiaditambahkan 20 ml air panas, dididihkan selama 10 menit dan disaring dalam keadaan panas, ke dalam 5 ml filtrat ditambahkan 0,1 g serbuk magnesium dan 1 ml asam klorida pekat dan 2 ml amil alkohol, dikocok dan dibiarkan memisah. Flavonoida positif jika terjadi warna merah, kuning, jingga pada lapisan amil alkohol Depkes RI, 1995.

3.6.3 Pemeriksaan Saponin

Sebanyak 0,5 g serbuk simplisiadimasukkan ke dalam tabung reaksi, ditambahkan 10 ml air panas, didinginkan kemudian dikocok selama 10 detik, jika terbentuk busa setinggi 1 sampai 10 cm yang stabil tidak kurang dari 10 menit dan tidak hilang dengan penambahan 1 tetes asam klorida 2 N menunjukkan adanya saponin Depkes RI, 1995.

3.6.4 Pemeriksaan Tanin

Sebanyak 0,5 g serbuk simplisiadisari dengan 10 ml air suling lalu disaring, filtratnya diencerkan dengan air sampai tidak berwarna. Larutan diambil 33 sebanyak 2 ml dan ditambahkan 1 sampai 2 tetes pereaksi besi III klorida 1.Jika terjadi warna hijau, biru, atau kehitaman menunjukkan adanya tanin Harborne, 1987.

3.6.5 Pemeriksaan SteroidaTriterpenoida

Sebanyak 1 g serbuk simplisiadimaserasi dengan 20 ml eter selama 2 jam, disaring, filtrat diuapkan dalam cawan penguap dan pada sisanya ditambahkan 10 tetes asam asetat anhidrat dan 1 tetes asam sulfat pekat pereaksi Liebermann – Burchard. Apabila terbentuk warna ungu atau merah yang berubah menjadi biru hijau menunjukkan adanya steroidatriterpenoida Harborne, 1987.

3.7 Pembuatan Ekstrak

Sebanyak 200 g simplisia teripang Holothuria scabra Jaeger dimasukkan ke dalam wadah gelas bertutup maserator, ditambahkan pelarut n-heksan sampai terendam sempurna, diaduk dan dibiarkan selam 24 jam. Maserat disaring dan filtrat ditampung, dilakukan pengulangan selama 3 kali. Maserat dipekatkan denganbantuan alat penguap rotary evaporator pada suhu tidak lebih dari 40 o C sampai diperoleh ekstrak kentaln-heksan sebanyak 2,3 g. Ampas simplisia kemudian dikeringkan di atas kertas perkamen dengan cara diangin-anginkan selama 24 jam. Ampas simplisia dimaserasi kembali dengan dimasukkan ke dalam wadah gelas bertutup maserator, ditambahkan pelarut etilasetat sampai terendam sempurna, diaduk dan dibiarkan selam 24 jam. Maserat disaring dan filtrat ditampung, dilakukan pengulangan selama 3 kali. Maserat dipekatkan denganbantuan alat penguap rotary evaporator pada suhu tidak lebih dari 40 o C sampai diperoleh ekstrak kental etilasetat sebanyak 2,0 g. Ampas simplisia 34 kemudian dikeringkan kembali di atas kertas perkamen dengan cara diangin- anginkan selama 24 jam. Ampas simplisia dimaserasi kembali dengan dimasukkan ke dalam wadah gelas bertutup maserator, ditambahkan pelarut etanol 96 sampai terendam sempurna kemudian diaduk dan dibiarkan selam 24 jam. Maserat disaring dan filtrat ditampung, dilakukan pengulangan selama 3 kali. Maserat dipekatkan denganbantuan alat penguap rotary evaporator pada suhu tidak lebih dari 40 o C sampai diperoleh ekstrak kental etanol sebanyak 11,25 gram. Bagan pembuatan ekstrak n-heksan, etilasetat dan etanol dapat dilihat di Lampiran 4, halaman 60-62.

3.8 Sterilisasi Alat dan Bahan