15
BAB III METODOLOGI PENELITIAN
3.1 Desain Penelitian
Penelitian ini mengunakan jenis penelitian uji eksperimental dengan teknik disc diffusion secara in vitro dengan melihat hasil setelah perlakuan terhadap
pengaruh ekstrak madu karet terhadap pertumbuhan bakteri Staphylococcus aureus.
3.2 Lokasi dan Waktu Penelitian
Madu karet yang digunakan pada penelitian ini dibeli dan dilakukan proses determinasi di taman Wisata Lebah madu Cibubur daerah Bumi Perkemahan
Pramuka Cibubur. Balai Penelitian Tanaman Rempah dan Obat Balittro Jl. Tentara Pelajar No. 3 Bogor
–Jawa Barat 16111 Indonesia. Sedangkan uji sensitivitas madu karet dan Perlakuan pengekstrakan dilakukan di Balai Besar
Teknik Kesehatan Lingkungan dan Pengendalian Penyakit Jakarta. Penelitian dilakukan pada bulan juni-september 2014.
3.3 Sample Penelitian
Penelitian ini mengunakan kultur Bakteri Staphylococcus aureus. Bakteri ini dikultur pada media Nutrein agar yang di inkubasi pada suhu 37
O
C selama 24 jam.
Berdasarkan penelitian yang pernah dilakukan sebelumnya Agil Dananjaya, FK UB. menggunakan jumlah kelompok sebanyak 7 kelompok. Madu
karet 100, ekstrak madu karet dengan variasi konsentrasi 20, 25, 50, dan 100, serta kontrol positif menggunakan antibiotik amoksisilin 25ug maupun
kontrol negatif menggunakan pelarut aseton dan n-heksan. Penentuan jumlah sample mengunakan rumus feder
Oleh karena itu digunakan rumus Federer : k-1.n- 1 ≥ 15
Keterangan : k = jumlah kelompok perlakuan
n = jumlah sample dalam tiap kelompak Sehingga berdasarkan penghitungan menghasilkan sampel sebagai berikut :
k-1.n-1 ≥ 15
7-1.n-1 ≥ 15
6.n-1 ≥ 15
6n - 6 ≥ 15
6n ≥ 21
n ≥ 214
n
≥ 4 hasil pembulatan
Maka jumlah pengulangan yang digunakan pada penelitian ini berjumlah 4 pengulangan.
3.4 Variabel Penelitian 3.4.1.
Variabel Bebas
Variabel bebas adalah Ekstrak Madu karet dengan berbagai konsentrasi 20,,25,50,100, kontol positif dan kontrol negatif. Kontrol negatif
mengunakan pelarut aseton dan n-heksan yang menghasilkan sedimen dan residu madu karet. Kontrol positf dengan antibiotik amoksisilin 25ug.
3.4.2. Variabel Terikat
Pertumbuhan bakteri Staphylococcus aureus di medium Agar darah yang
diukur dengan berbagai diameter zona hambat zona bening dalam satuan milimeter mm.
3.5 Bahan dan Alat 3.5.1.
Bahan
Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah madu karet asli, madu karet dengan ekstrasi,madu karet dengan pelerut aseton dan n-heksana, aquades steril,
nutrein agar dan bakteri Staphylococcus aureus.
3.5.2. Alat
Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah alkohol, pengaris, inkubator, kapas swab, jam, cawan petri, jangka sorong, bunsen, alumunium foil,
tabung reaksi, flacon, mikro pipet, autoclav, label, tibangan, vortex, korek api, pinset dan alat tulis.
3.6 Cara Kerja Penelitian 3.6.1
Sterilisasi alat dan bahan
Seluruh peralatan yang akan digunakan selama penelitian harus dibersihkan dengan cara dicuci kemudian dikeringkan lalu dibungkus dengan
kertas alumunium foil. Kemudian dilakukan sterilisasi di dalam autoclave selama 30 menit dengan mengatur tekanan sebesar 15 dynecm
3
1atm pada suhu 121
o
C. 3.6.2
Ekstrasi S
ampel madu karet sebanyak 150 mL di ekstraksi. menggunakan metode maserasi dengan madu karet dan pelarut aseton dan n-heksan sebanyak 150 mL
perbandingan 1:1. Letakan pada 2 beaker glass dengan di berikan label. Tuangkan madu karet dengan pelarut aseton di beaker glass A dan tuangkan juga madu karet
dengan pelarut n-heksan di beaker glass B. setelah tercampur, masing-masing beaker glass masukan kedalam corong pisah yang berbeda untuk melakukan tahan
pengabungan dengan alat soker selama 3 jam. Hal ini dilakukan agar dapat kedua senyawa dapat bercampur dan menghasilkan dua senyawa endapan dan cair setelah
di diamkan selama 12 jam di beaker glass yang berbeda dengan mengunakan pipet tetes. Setelah itu diletakan didalam oven dengan suhu 80
O
agar ekstrak madu karet menjadi lebih pekat Hingga terbentuk 2 bagian. Bagian yang bawah adalah endapan
sisa madu karet sedangkan bagian yang atas berwarna cokelat bening. 3.6.3
Pembuatan medium
Pembuatan medium Nutrein Agar sebanyak 11,5 Gram dilarutkan dalam 50mL aquades kemudian dipanaskan dan diaduk dengan menggunakan magnetik
stier sampai homogen dan bening. Media disterilisasikan dengan mengunakaan autoklaf pada suhu 121
O
C, tekanan 1,5 atm dan selama 15 menit setelah distrelisasikan. Medium Nutrient dimasukkan kedalam cawan petri sebanyak 15ml
dan dibiarkan mengeras.
3.6.4 Pembuatan variabel konsentrasi ekstrak madu
Uji antibakteri dengan variasi konsentrasi ekstrak madu karet asli, sedimen madu karet+aseton maupun n-heksan, residu madu karet dengan pelarut aseton
maupun n-heksan yaitu 20, 25 , 50 , 100 dan kontrol. Masing masing variasi konsentrasi ekstrak dengan pengulangan sebanyak 4 kali. Agar didapatkan
hasil rata-rata pada masing-masing variasi konsentrasi.
Keterangan : n = volume zat terlarut
3.6.5 Kultur bakteri staphylococcus aureus
Butiran cryo yang berasal dari microbank dengan suhu -70 C dimasukkan
ke dalam media cair Brain heart infussion BHI di inkubasi pada suhu 37
o
C selama 24 jam, keesokan harinya bakteri tersebut di isolasi pada nutrien agar
petri disk atau tabung di inkubasi pada suhu 37
o
C selama 24 jam.
3.6.6 Metode Difusi cakram
Buat suspensi bakteri terlebih dahulu dengan metode four plate, dengan mengambil bakteri Staphylococcus aureus yang telah diremajakan dalam bentuk
cair, dengan mikropipet dan diletakan kedalam cawan petri yang telah di sterilisasikan, kemudian dicampurkan nutrien agar dalam bentuk cair, aduk hingga
rata dan diamkan sampai menjadi padat. Selama menunggu rendam blank disk didalam wadah yang berisi ekstrak madu karet, sedimen madu karet dengan pelarut
aseton dan n-heksan, residu madu karet dengan pelarut aseton dan n-heksan, pelarut aseton dan n-heksan selama 15 menit pada suhu 37
C. Lalu disk yang sudah terendam ekstrak diletakkan di cawan petri yang sudah berisi suspensi bakteri
Staphylococcus aureus dan nutrien agar. Lalu diinkubasi didalam inkubator pada suhu 37
o
selama 24 jam. Keesokan harinya diamati dan diukur diameter zona hambat diukur dengan menggunakan penggaris dengan satuan milimeter mm dan
dibandingkan dengan zona hambat pada kontrol.
3.7 Pengolahan dan Analisis Data
Analisis data yang digunakan adalah uji statistik one way ANOVA untuk mengatahui pengaruh ekstrak madu karet.Sebelumnya dilakukan pengujian
distribusi normal atau tidak. Jika hasil menunjukan distribusi normal maka langsung mengunakan uji statistik one way anova melihat adakah terdapat
perbedaan signifikan pada tiap konsentrasi terhadap zona hambat.Analisis data menggunakan program SPSS Statistical Product of Service Solution for
Windows.
3.8 Alur Penelitian