TINJAUAN PUSTAKA Endophytic Bacteria Utilization to Increase Yield and Andrographolide Content on King of Bitter (Andrographis paniculata)

Gambar 2.1. Biosintesis Lintasan Mevalonat dan Non Mevalonat Vickery dan Vickery 1981; Dubay et al. 2003 Setelah asam mevalonat terbentuk lalu difosforilasi oleh ATP dan enzim asam mevalonate kinase kemudian terbentuk asam mevalonat 5-pyrophosphate. Asam mevalonat 5-pyrophosphate melalui proses dekarboksilasi-dehidrasi menjadi isopentenyl phyrophosphate, reaksi ini dikatalis oleh enzim pyrophospho mevalonat decarboxylase . Asam mevalonat adalah prekusor utama untuk semua terpenoid melalui lintasan mevalonat yang dibiosintesis oleh tanaman. Secara umum lintasan biosintesis terpenoid dari proses asam mevalonat sehingga menghasilkan kelompok-kelompok terpenoid. Akhir proses yaitu dengan Androgrpholide mengisomer isopentenyl phyropphosphate menjadi dimethylallyl phyropphosphate oleh enzim isopentenyl phyropphosphate isomerase Dubay et al. 2003; Brielmann 2006; Srivastava dan Akhila 2010 Gambar 2.1 Biosintesis terpenoid melalui lintasan non mevalonat Sebagian besar peneliti mengungkapkan bahwa pembentukan senyawa terpenoid umumnya melalui lintasan mevalonat, namun ada yang mengatakan dapat melalui lintasan non mevalonat yang berasal dari asam piruvat. Jalur non mevalonat b erbeda dengan jalur mevalonat biosintesis isoprenoid. Tanaman dan protozoa apicomplexan seperti parasit malaria memiliki kemampuan untuk memproduksi isoprenoids terpenoid menggunakan jalur alternatif yaitu jalur non-mevalonat yang terjadi dalam plastid mengarah pada pembentukan IPP dan DMAPP Rohmer 1999 Gambar 2.1 , setelah terbentuknya IPP dan DMAPP proses selanjutnya yaitu pembentukan kelompok terpenoid Gambar 2.1. Sebagian besar bakteri termasuk patogen seperti bakteri Mycobacterium tuberculosis mensintesis IPP dan DMAPP melalui jalur non-mevalonat Lichtenthaler 1999 . Klasifikasi Terpenoid Terpenoid dapat diklasifikasikan menurut jumlah unit isoprene dan dapat di bagi berdasarkan jumlah atom C. Menurut Vickery dan Vickery 1981; Brielmann et al. 2006, terpenid dapat dikelompokkan yaitu: Hemiterpenoids 1 unit isoprene C-5, Monoterpenoid 2 unit isoprene C-10, Seskuiterpenoid 3 unit isoprene C-15, Diterpenoids 4 unit isopren C-20, Sesterterpenoids 5 unit isopren C-25 jarang ditemukan, Triterpenoid unit 6 isopren C-30, Tetraterpenoids 8 unit isopren C-40, Polyterpenoids dengan jumlah yang lebih besar dari unit isopren. Biosintesis andrografolid pada tanaman sambiloto Senyawa andrografolid termasuk ke dalam biosintesis terpenoid khususnya kelompok diterpenoid. Diterpenoid terdiri atas empat unit isopren dan memiliki rumus molekul C 20 H 32 Srivastava dan Akhila 2010. Selain andrografolid, giberelin termasuk golongan diterpenoid, berperan penting sebagai hormon pertumbuhan pada tumbuhan tingkat tinggi. Bakteri Endofit Bakteri endofit didefinisikan sebagai bakteri yang hidup atau mengkoloni pada jaringan tanaman sehat baik pada akar, batang maupun daun tanpa memperlihatkan tanda yang jelas atau mengganggu tanaman inangnya dan hidup didalam jaringan vaskuler tanaman yang sehat Kloepper et al. 1999, Lindow dan Brandl 2003. Bakteri tersebut membentuk agregat dan berinteraksi dengan tanaman dalam bentuk hubungan tertentu mulai dari hubungan bebas, patogen hingga hubungan substansial seperti komensialisme, mutualisme, dan simbiosis Andrews dan Haris 2000. Jenis bakteri endofit Tiap tanaman mengandung satu atau lebih bakteri endofit Strobel 2003; Strobel dan Daisy 2003. Hampir semua tanaman vaskular yang hidup di iklim tropis memiliki bakteri endofit Firakova et al. 2007; Zhang et al. 2006. Bakteri endofit tersebut berada pada seluruh bagian tanaman baik daun, akar, batang, maupun kulit pada tanaman angiospermae Banarjee 2011. Hasil penelitian Thompson et al. 1993, menunjukkan lebih dari 78 spesies bakteri dari 37 genus yang berhasil diidentifikasi dan 12 genus yang tidak dapat diidentifikasi dari permukaan daun antara lain berasal dari genus Pseudomonas, Enterobacteriacae , bakteri gram negatif dan bakteri gram positif. Jenis Pseudomonas yang banyak ditemukan antara lain P. aureofasciens dan P. syringae . Jenis Enterobacteriacae, Erwina herbicola merupakan jenis isolat yang paling dominan. Bakteri gram positif antara lain Arthrobacter oxydans, Micrococcus roseus dan Mycobacterium lacticum. Bakteri tersebut terdapat pada trikhom, stomata, sepanjang tulang daun, dinding sel epidermis Mariano dan Carter 1993 dan spora serta jaringan intraseluler vaskular Hallmann 2001. Menurut Werner 1992, jenis bakteri yang paling sering ditemui di daun adalah Pseudomonas, Xanthomonas, Flavobacterium, Archromobacter, Bacillus, Mycobacterium, Beijerinckia, Azotobacter , dan Mycoplana. Methylobacterium adalah salah satu jenis bakteri yang hidup berasosiasi dengan tanaman. Faktor-faktor yang mempengaruhi keberadaan bakteri endofit Beberapa faktor yang dapat mempengaruhi keberadaan bakteri pada daun baik terhadap jumlah maupun keragamannya antara lain: kondisi daun, ketersediaan nutrisi, kelembaban, temperatur, pencucian, serta mikroorganisme di udara Sundin dan Jacobs 1999. Nutrisi merupakan hal yang terpenting bagi kehidupan bakteri yaitu berupa gula antara lain fruktosa dan sukrosa Mercier dan Lindow 2000. Nutrisi ini tidak menyebar secara merata pada permukaan daun, hanya dijumpai pada sel epidermis dekat tulang daun dan stomata Leveau 2001. Umumnya bakteri ditemukan dalam jumlah lebih besar pada permukaan bawah daun dibandingkan bagian atas karena pada bagian bawah daun banyak terdapat stomata Beattie dan Lindow 1999. Hasil penelitian Freiberg 1998, menunjukkan bahwa faktor lingkungan yang sangat berpengaruh terhadap penambatan N 2 pada daun adalah curah hujan. Kecepatan maksimum penambatan N 2 oleh sianobakteri daun per luas daun per jam sebesar 26 ng cm -2 N pada periode ada hujan, dan menurun hingga nol selama dua sampai tiga hari pada periode tanpa hujan, sedangkan intensitas cahaya matahari kurang berpengaruh terhadap bakteri endofit Freiberg 1998. Radiasi matahari berpengaruh kuat terhadap ekologi bakteri endofit, yang ditunjukkan oleh persentase hunian bakteri dari genus Curtobacterium pada permukaan atas lebih banyak dibandingkan bagian permukaan bawah daun Jacob dan Sundin 2001. Beberapa bakteri mampu mempertahankan diri dari kondisi kurang menguntungkan dengan mengeluarkan senyawa tertentu antara lain P. syringae pv syringae menghasilkan senyawa alginat, yaitu polisakarida yang dihasilkan secara optimal pada suhu 32ºC akan dipacu pembentukannya bila terjadi kondisi kurang menguntungkan akibat pemanasan oleh sinar infra merah, sehingga bakteri dapat bertahan pada permukaan daun Penazola et al. 1997. Kelembaban udara dapat mempengaruhi populasi bakteri. Kelembaban sangat diperlukan untuk kolonisasi bakteri pada permukaan daun khususnya pada tumbuhan yang hidup pada iklim basah dan curah hujan tinggi. Hasil penelitian Timmer et al. 1987 menunjukkan bahwa populasi Xanthomonas campestris pv. vesicatoria meningkat pada kelembaban yang tinggi ≥ 90, berfluktuasi pada kelembaban sedang 50 –65, dan menurun bahkan tidak teramati pada kelembaban rendah 10 –25. Peranan Bakteri Endofit Pemicu pertumbuhan tanaman Beberapa pengaruh yang menguntungkan dari interaksi bakteri endofit dengan tanaman inang antara lain 1 sebagai penghasil hormon yang berperan dalam memacu pertumbuhan tanaman Morris 2001, 2 penambat N 2 Dong et al . 1995; Asis et al. 2004, hal tersebut cukup penting karena dapat mengurangi setengah dari kebutuhan N melalui aktivitas fiksasi Nnya pada tanaman tebu di Brazil Boddey et al. 1995, 3 dapat melawan patogen tanaman melalui induksi ketahanan sistemik dan dihasilkannya senyawa antagonis Kloepper et al. 1999, Sturz dan Nowak 2000, dan 4 meningkatkan resistensi tanaman terhadap kondisi tertekan seperti cekaman air Azevado et al. 2000, meningkatkan hasil, mengurangi infeksi patogen, serta mengurangi stres biotik atau abiotik tanaman, tanpa patogenisitas Welbaum et al. 2004; van Loon dan Bakker 2005; Lugtenberg dan Kamilova 2009. Umumnya tumbuhan memenuhi kebutuhan terhadap hormon melalui kemampuannya mensintesis fitohormon Taiz dan Zeiger 2002; Salisbury dan Ross 1992. Fitohormon yang dihasilkan tanaman merupakan senyawa kimia yang memediasi komunikasi antar sel yang mempengaruhi bentuk dan fungsi tanaman Salisbury dan Ross 1992. Fitohormon juga dapat disekresikan oleh bakteri yang hidup di sekitar tanaman. Peranan bakteri endofit yang cukup penting adalah sebagai pemicu pertumbuhan tanaman yaitu dengan dihasilkannya fitohormon antara lain Indole Acetic Acid IAA Ergun et al. 2002; Pedraza et al. 2004, sitokinin Taller dan Wang 1989: Ergun et al. 2002, dan giberelin GA 3 Ergun et al. 2002; Kharwar et al . 2008. Beberapa bakteri yang dapat memproduksi berbagai jenis hormon secara in vitro antara lain bioaktivitas sitokinin telah dideteksi dari filtrat kultur Azotobacter chrococcum, A. beijerinckia , dan A. vinelandii Taller dan Wong 1989, dan juga diproduksi oleh bakteri Paenibacillus polymyxa pada fase pertumbuhan logaritmik akhir Timmusk et al. 1999. Satu strain Azotobacter mengekskresikan 3 –50 µg IAA ml -1 Vancura 1988, dan bakteri penambat N 2 Herbaspirillum seropodicae dan Bukholderia brasiliensis yang hidup pada tanaman padi juga secara nyata mensekresikan fitohormon auksin Padua et al. 2001. Bakteri endofit, selain menghasilkan fitohormon IAA dan sitokinin, bakteri endofit juga menghasilkan hormon giberrelin GA 3 . Bastian et al. 1998 melaporkan terdapat kandungan IAA dan GA 3 pada Acetobacter diazotrhopicus dan Herbaspirillum seropedicea. GA 3 juga terdapat pada Aspergillus fumigates Hamayun 2009, dan dari tanaman timun menghasilkan bakteri endofit Phoma sp. GAH7 yang mensintesis giberrelin Hamayun 2010. Fitohormon yang dihasilkan tanaman diperlukan oleh bakteri agar dapat tumbuh dengan baik, sedangkan hormon yang dihasilkan bakteri membantu agar tanaman dapat tumbuh secara normal, seperti mencegah pertumbuhan sel secara cepat, kerusakan tanaman akibat pembekuan sel dan kerusakan tanaman akibat cuaca dingin Leveau 2001. Bakteri penambat N 2 pada daun ada yang hidup bebas dan ada yang bersimbiosis membentuk nodul pada daun. Tanaman tropika tertentu diketahui bersimbiosis dengan Chromobacterium dan Klebsiella dan membentuk nodul daun. Bakteri penambat N 2 tertentu dijumpai didalam nodul daun Marlberry famili Rubiaceae Oevelan et al. 2003. Bakteri penambat N 2 dipengaruhi oleh cahaya yang menunjukkan ketergantungannya terhadap fotosintesis Pereg et al. 1994. Boddey et al. 1995, mendapatkan bakteri penambat N 2 BNF pada tanaman tebu kultivar tertentu di Brazil yang dapat mengurangi setengah dari kebutuhan unsur nitrogen melalui aktivitas menambat N 2 yaitu lebih dari 150 kg N ha -1 tahun -1 , dan bakteri penambat N 2 ditemukan pada jaringan akar, tajuk, dan daun tebu Kennedy et al. 1997. Bakteri penambat N 2 tidak semua menguntungkan bagi tanaman dari hasil penelitian menunjukkan bahwa beberapa strain bakteri penambat N 2 ada yang dapat menstimulasi pertumbuhan tanaman padi, ada yang sedikit berpengaruh, dan ada pula yang dapat menghambat pertumbuhan dan perkembangan tanaman padi Rolfed dan Weinman 2001, dan tanaman kentang Sturz 1995. Penghasil senyawa bioaktif Bakteri endofit selain memacu pertumbuhan tanaman, dapat juga menghasilkan senyawa metabolit sekunder, yaitu senyawa bioaktif yang dapat berfungsi sebagai obat. Sejumlah besar tanaman, bakteri, dan hewan laut telah diperiksa metabolit sekunder atau bioaktifnya Firakova et al. 2007. Bakteri endofit sebagai sumber produk bioaktif Strobel 2003. Penelitian Melliawati 2006, telah mengisolasi senyawa aktif dari bakteri endofit sebagai antibakteri untuk proteksi tanaman. Beberapa jenis mikroorganisme menunjukkan kekhususan inang dan aktivitas antagonis spesifik lain; kekhususan ini melibatkan interaksi biokimia yang kompleks antara tanaman dan mikroorganisme Gomez 2010. Informasi yang tersedia dapat memberikan arahan dalam pemilihan jenis organisme yang terkait dengan tanaman obat ketika mencari produk alami yang baru Strobel 2003. Kemampuan bakteri endofit memproduksi senyawa metabolit sekunder sesuai dengan tanaman inangnya merupakan peluang yang sangat besar dan dapat diandalkan untuk memproduksi metabolit sekunder Strobel et al. 2003; Radji 2005. Beberapa bakteri endofit telah diisolasi senyawa aktifnya yang berfungsi sebagai antibakteri Strobel et al. 2003, antivirus Guo et al. 2000; antibiotik Arunachalam dan Gayathri, 2010 dan antioksidan Anurada et al. 2010. Fitohormon Hormon tumbuhan merupakan senyawa senyawa kimia yang terjadi secara alamiah didalam tanaman yang berperan dalam mengatur pertumbuhan dan perkembangan tanaman serta aktif pada konsentrasi yang kecil George dan Sherington 1984. Menurut Salibury dan Ross 1995; Wattimena 1991, hormon tanaman adalah senyawa organik bukan nutrisi yang aktif dalam jumlah kecil, yang disintesiskan pada bagian tertentu dari tanaman dan pada umumnya diangkut ke bagian lain tanaman kemudian zat tersebut menimbulkan tanggapan secara biokimia, fisiologis dan morfologis. Zat pengatur tumbuh dalam konsentrasi rendah dapat mempengaruhi proses fisiologis tumbuhan. Hal ini disebabkan karena adanya asam yang langsung mempengaruhi sintesis protein dan mengatur aktivitas enzim Gardner et al. 1991. Fitohormon tersebut antara lain auksin IAA dan GA 3. Peranan fitohormon terhadap pertumbuhan tanaman Istilah auksin digunakan pada sekelompok senyawa kimia yang memiliki fungsi utama mendorong pemanjangan kuncup yang sedang berkembang. Beberapa auksin dihasilkan secara alami oleh tumbuhan, misalnya IAA Indole Acetic Acid . Auksin merupakan salah satu hormon yang sangat penting didalam pertumbuhan tanaman dan berperan untuk memacu pertumbuhan sepanjang sumbu longitudinal. Hal spesifik yang terlihat berupa peningkatan pembesaran sel yang berlangsung ke segala arah secara isodiametrik. Auksin juga berperan dalam pembelahan dan pembentangan sel Wattimena 1991. Pengaruh IAA nyata meningkatkan pertumbuhan tanaman kunyit pada 200 ppm. Pada konsentrasi yang lebih tinggi dapat meningkatkan sel sekretori, tetapi menurunkan diameter sel sekretori rimpang kunyit Wijayati et al. 2005. Pemberian IAA dalam konsentrasi tinggi tidak lagi memacu pembentangan sel tetapi menghambat karena melampaui batas optimum Hopkins 1995. Peristiwa ini berhubungan dengan terhambatnya pemasukan air kedalam sel karena konsentrasi IAA yang terlalu tinggi menyebabkan pH dinding sel berubah, sehingga air tidak dapat terserap secara maksimal. Sel menjadi tidak dapat mengembang dan membesar akibat terhambatnya pemasukan air. Hal ini kurang sesuai dengan fungsi dari IAA itu sendiri yaitu meningkatkan tekanan osmotik sel yang diatur oleh gradien potensial pada plasma membran Davies 1995. Zat pengatur tumbuh lain yang dapat mengendalikan pertumbuhan dan perkembangan tanaman yaitu asam giberelat. Giberelin adalah turunan dari asam giberelat merupakan hormon tumbuhan alami yang merangsang pembungaan, pemanjangan batang dan membuka benih yang masih dorman. Ada sekitar 100 jenis giberelin, namun Gibberellic Acid GA 3 yang paling umum digunakan. Senyawa ini merupakan hormon pada tanaman yang mempunyai pengaruh memacu pertumbuhan, serta dapat meningkatkan ukuran daun, bunga, dan buah. Respon tanaman terhadap GA meliputi peningkatan pembelahan sel dan pembesaran sel. Asam giberelat diketahui dapat mendukung proses pembentukan RNA baru serta sintesis protein Taiz dan Zeiger 2002. Asam giberelat merupakan hormon tanaman yang mempunyai efek fisiologis dapat mempengaruhi diferensiasi kambium dalam proses pembentukan berkas pengangkut. Pemberian GA dapat meningkatkan jumlah floem yang terbentuk Davies 1995. Selulosa dan lignin sebagai penyusun dinding sel akan meningkat jumlahnya seiring peningkatan jumlah floemnya. Selulosa dan lignin merupakan penentu kualitas serat. Hormon ini juga dapat memacu pertumbuhan dan perkembangan tanaman serta memperpendek siklus hidup tanaman. Pengaruh GA 3 terhadap diferensiasi sel telah dilaporkan oleh Maryani 1992, bahwa perlakuan GA 3 pada konsentrasi 30 ppm memacu pembentukan sklerenkim batang Hibiscus cannabius. Perlakuan giberelin juga berpengaruh nyata terhadap tinggi tanaman, jumlah daun, luas daun, masa primordial, masa panen, diameter bunga, dan panjang tangkai bunga krisan Zuhriyah 2004. Pemberian GA 3 pada konsentrasi 50 ppm optimum untuk meningkatkan luas daun dan pada konsentrasi 75 ppm optimum untuk meningkatkan bobot kering dan kadar saponin pada tanaman daun sendok Plantago major Khristyana et al. 2005. Perlakuan GA 3 memberikan pengaruh yang signifikan terhadap perubahan diameter batang tunas, tinggi batang tunas tanaman rami dan kandungan lignin Mudyantini 2008. Salisbury dan Ross 1995 menyatakan bahwa peningkatan GA 3 endogen dapat meningkatkan hidrolisis pati, fruktan, dan sukrosa menjadi molekul glukosa dan fruktosa. Selulosa merupakan penggabungan unit-unit glukosa menjadi senyawa makromolekul yang tidak larut dalam semua pelarut yang biasa digunakan Fengel dan Gerd 1995. Pemberian GA 3 dapat meningkatkan kandungan glukosa dalam tanaman maka kandungan selulosa juga akan meningkat Mudyantini 2008. Peranan fitohormon terhadap bahan aktif tanaman Hormon pertumbuhan selain dihasilkan tanaman, juga dapat disekresikan oleh bakteri yang hidup di sekitar dan di dalam jaringan tanaman. Hormon tumbuh ternyata tidak hanya mampu memacu pertumbuhan dan produksi tetapi juga dapat meningkatkan mutu dan kadar bahan aktif. Pemberian zat pengatur tumbuh GA 3 sebesar 50 mg l -1 mampu meningkatkan produksi artemisinin dari 0.77 menjadi 1.10 mg g -1 . Kinetin 10 dan 20 mg l -1 meningkatkan produksi artemisia. Hormon tumbuh disintesis dari bakteri endofit dan dimanfaatkan untuk meningkatkan produksi dan kadar artemisinin Farooqi et al. 1996. Pemberian GA 3 dan IAA eksogen mampu meningkatkan kadar andrografolid pada tanaman sambiloto Anurada et al. 2010. Bakteri endofit dapat mensintesis giberelin dan memacu pertumbuhan tanaman padi Khan et al. 2009, dan timun Hamayun et al. 2010. Bakteri endofit mampu meningkatkan produksi segar herba dan minyak tanaman Ocimum sanctum Tiwari et al. 2009, meningkatkan produksi dan kandungan N pada tanaman padi sawah tadah hujan Pedraza et al. 2009, padi lahan gambut Fitri dan Gofar, 2009, dan kacang tanah Lee at al. 2005. Fosfat Peranan unsur fosfat terhadap tanaman Unsur fosfat merupakan salah satu unsur esensial yang diperlukan untuk pertumbuhan dan reproduksi tanaman selain nitrogen dan kalium Salisbury dan Ross 1992; Taiz dan Zeiger 2002. Jika tanpa salah satu unsur esensial maka siklus hidup tanaman tidak akan lengkap siklus hidupnya, tidak dapat digantikan oleh unsur lain dan terlibat langsung dalam metabolisme tanaman Fageria 2009. Bila pasokan P pada tanaman tidak tercukupi maka tidak dapat memberikan potensi hasil yang maksimal Fageria dan Gheyi 1999 karena pertumbuhan dan perkembangannya tidak normal Glass 1989. Fosfat berperan penting didalam penyimpanan dan transfer energi dalam tanaman Marschner 1995; Fageria dan Gheyi 1999. Menurut Marschner 1995, fungsi P pada tanaman dibagi dalam 3 golongan. Fungsi pertama adalah sebagai penyusun makro molekul. Fungsi ke- dua adalah sebagai pembentuk senyawa penyimpanan dan transfer energi. Fungsi ke-tiga adalah sebagai regulator reaksi biokimia melalui fosforilasi yang dapat mengaktivasi atau protein inaktif yang dianggap sebagai faktor kunci dalam transduksi sinyal. Fosfat memegang peranan penting pada banyak reaksi enzim, hal ini karena P bagian dari inti sel yang sangat penting dalam pembelahan sel dan perkembangan jaringan meristem, merangsang pertumbuhan akar dan mempercepat pembungaan dan pemasakan buah. Fosfat berfungsi dalam pertumbuhan dan metabolisme tanaman, maka kekurangan fosfor mengindikasikan pada pengurangan secara umum sebagian besar proses metabolisme seperti pembelahan dan pembesaran sel, respirasi dan fotosintesis Terry dan Ulrich 1993. Beberapa hasil penelitian menunjukkan pentingnya pemberian P yang akan mempengaruhi pertumbuhan dan hasil tanaman. Pemberian P akan menghasilkan tanaman serealia, kacang-kacangan yang jauh lebih baik dibandingkan dengan tanpa pemberian P, meskipun pemupukan N dan K diberikan Fageria 2009. Selain berperan dalam proses metabolisme primer, unsur P berperan pula di dalam proses metabolit sekunder terutama kelompok terpenoid, baik melalui lintasan asam mevalonat maupun non mevalonat Vickery dan Vickery 1986; Srivastava dan Akhila 2010. Tanaman biasanya mengabsorbsi P dalam bentuk ion orthofosfat primer H 2 PO 4 - , orthofosfat sekunder HPO 4 2- Leiwakabessy et al. 2003, PO 4 3- , H 2 PO 3 - , dan HPO 3 2- Avila et al. 2013. Gardner et al. 1991 menyatakan fosfor berasal dari pecahan organik dan inorganik tanah sebagai berikut: 1 larutan tanah sedikit mengandung P yang dapat larut seperti orthofosfat H 2 PO - 4 dan HPO 4 2- , 2 mineral yang berisi P seperti apatit, Ca, Mg, Fe, dan Al-P, 3 genangan labil mengandung P yang diabsorbsi oleh koloid tanah, Fe dan Al-P dalam keseimbangan dengan P larutan tanah. Konsentrasi ion P dipengaruhi oleh kemasaman tanah. Bentuk H 2 PO 4 - banyak dijumpai pada tanah masam, dan HPO 4 2- dijumpai pada tanah alkali. Selain itu dipengaruhi pula oleh waktu, temperatur, dan ketersediaan bahan organik didalam tanah. Disamping ion-ion tersebut, tanaman dapat menyerap P dalam bentuk asam nukleat, fitin dan fosfohumat Havlin et al. 1999. Fosfat yang diserap tanaman tidak direduksi, melainkan berada didalam senyawa-senyawa organik dan anorganik dalam bentuk teroksidasi. Fosfat anorganik banyak terdapat didalam cairan sel sebagai komponen sistem penyangga tanaman. Fosfat dalam bentuk organik terdapat sebagai: 1 fosfolipid, yang merupakan komponen membran sitoplasma dan kloroplas; 2 fitin, yang merupakan simpanan fosfat dalam biji; 3 gula fosfat, yang merupakan senyawa antara dalam berbagai proses metabolisme tanaman; 4 nukleoprotein, komponen utama DNA dan RNA inti sel; 5 ATP, ADP, AMP, dan senyawa sejenis, sebagai senyawa berenergi tinggi untuk metabolisme; 6 NAD dan NADP, merupakan koenzim penting dalam proses reduksi dan oksidasi; dan 7 FAD dan berbagai senyawa lain, yang berfungsi sebagai pelengkap enzim tanaman Salisbury dan Ross 1995. Adenosin trifosfat ATP terbentuk melalui proses fosforilasi oksidatif pada asimilasi fosfat oleh tumbuhan. Fosfat yang diasimilasi menjadi ATP dengan cepat segera ditransfer melalui reaksi metabolisme berikutnya menjadi berbagai macam bentuk fosfat dalam tanaman, diantaranya gula fosfat, fosfolipid, dan nukleotida. Asam deoksiribonukleat DNA yang tersusun dari basa purin dan pirimidin, gula pentosa dan fosfat, berfungsi sebagai pembawa informasi genetik, sedangkan RNA sebagai penterjemah informasi dan keterlibatan lain dalam sintesis protein. Fosfat juga merupakan penyusun fitin, yaitu bentuk utama P yang tersimpan dalam biji. Substansi ini merupakan garam kalsium dan magnesium inositol asam heksafosfat, sedangkan fosfolipid merupakan bahan yang berperanan penting dalam mengatur permeabilitas membran sel dan pengangkutan ion Salisbury dan Ross 1995. Pergerakan fosfat didalam tanah Pergerakan hara P didalam tanah diserap oleh akar melalui proses difusi yang didasarkan pada perbedaan konsentrasi unsur hara yang berada pada suatu tempat dengan tempat yang lain di dalam bentuk larutan tanah. Pergerakan ion fosfat menuju akar tanaman terdiri dari dua cara yakni aliran massa dan difusi Tisdale et al. 1985. Kadar P larutan tanah di luar sel akar umumnya hanya 1 μM, sedangkan kadar dalam sitoplasma adalah 10 3 -10 4 lebih tinggi. Fosfat yang diserap tanaman tidak mengalami reduksi akan tetapi tetap dalam bentuk oksidatif tertinggi Marschner 1995 Respon tanaman terhadap defisiensi fosfat Mekanisme adaptasi tanaman terhadap kahat P dapat dikelompokkan menjadi dua yaitu: 1 mekanisme internal yang berkaitan dengan penggunaan P oleh jaringan tanaman, dan 2 mekanisme eksternal yang memungkinkan efisiensi serapan P yang lebih tinggi oleh akar Peng dan Ismail 2004 dalam Sopandie 2006. Mekanisme internal dicapai melalui kemampuan tanaman untuk: a memanfaatkan P dengan efisien, dan b memobilisasi P dari jaringan yang tidak lagi aktif bermetabolisme. Mekanisme eksternal meliputi: 1 kemampuan tanaman untuk membentuk perakaran yang lebih panjang, 2 kemampuan meningkatkan luas serapan dengan pertumbuhan rambut akar, 3 kemampuan melarutkan P tidak tersedia melalui perubahan pH atau sekresi senyawa pengkelat, 4 kemampuan menggunakan P organik melalui sekresi fosfatase, dan 5 kemampuan dalam bersimbiosis dengan mikoriza Peng dan Ismail 2004 dalam Sopandie 2006. Faktor utama penyebab ketersediaan hara P rendah di tanah adalah akibat fiksasi Syarif 2007. P tersedia bagi tanaman kurang dari 1 P total tanah Masrchner 1995. Pada umumnya ketersediaan P terdapat pada kisaran pH 5.5 sampai 7.0. Ketersediaan P menurun di bawah pH 5.5 karena terfiksasi oleh Al, Fe, hidroksida, dan liat, sedangkan di atas pH 7.0, fosfat difiksasi oleh Ca dan Mg Tisdale et al. 1985. Ketersediaan P tanah yang rendah tersebut menyebabkan mekanisme eksternal menjadi lebih penting, tanaman mengembangkan berbagai mekanisme untuk membuat P menjadi tersedia dan juga untuk meningkatkan kemampuan menyerap P. Salah satu mekanisme eksternal yang penting dalam meningkatkan ketersediaan P adalah dengan peningkatan kinetika serapan P Kochian et al. 2004 dalam Sopandie 2006. Perubahan fisiologi akar merupakan mekanisme ketenggangan tanaman terhadap terbatasnya suplai P yang terutama disebabkan oleh perubahan kinetika serapan. Kinetika serapan P menunjukkan adanya high affinity transporter yang lebih aktif dibandingkan low affinity transporter pada konsentrasi P rendah Sopandie 2006. Kompartementasi P intraseluler dapat mempengaruhi efisiensi penggunaan P tanaman. Mimura et al. 1996 dalam Sopandie 2006 menunjukkan terjadi pergerakan P dari vakuola ke sitoplasma pada kondisi defisiensi P yang memungkinkan kadar P dalam sitoplasma dapat dipertahankan agar proses fisiologis berjalan normal. Kondisi tanaman terhadap kahat P disajikan pada Tabel 2.1. Tabel 2.1. Respon tanaman terhadap keadaan kahat P Tingkatan respon tanaman Respon tanaman Morfologi Peningkatan nisbah akar-tajuk, perubahan morfologi dan arsitektur akar, peningkatan jumlah dan panjang rambut akar, akumulasi pigmen antosianin, pembentukan akar proteoid Fisiologi Peningkatan serapan P, penurunan fluks Pi, peningkatan efisiensi penggunaan P, mobilisasi Pi dari vakuola ke sitoplasma, proton sekresi fosfatase dan RNase, perubahan metabolisme karbon, fotosisntesis dan fiksasi nitrogen. Biokimia Aktivasi enzim-enzim, peningkatan produksi fosfatase, RNase dan asam organik, perubahan dalam fosforilasi protein. Molekuler Aktivasi gen-gen yang mengendalikan sintesa RNase, fosfatase, fosfat transforter, Ca-ATPase, beta glukosidase dan PEPCase. Sumber: Raghothama 1999 dalam Sopandie 2006 Keberhasilan suatu tanaman untuk tumbuh dan berkembang secara optimal sangat tergantung kepada kemampuan tanaman untuk memanfaatkan P tanah. Peningkatan serapan hara per tanaman dapat dicapai antara lain dengan a peningkatan sistem perakaran yang dapat meningkatkan kontak dengan hara, terutama hara yang kurang mobil seperti P, b peningkatan serapan per unit akar dengan meningkatkan kinetika serapan, dan c kemampuan untuk menggunakan bentuk-bentuk hara yang relatif kurang tersedia bagi tanaman seperti P anorganik tidak larut Syarif 2007. Eksudasi asam organik malat, sitrat dan oksalat adalah mekanisme lain tanaman untuk meningkatkan ketersediaan P dari tanah. Asam organik dapat meningkatkan ketersediaan P melalui mekanisme pelarutan senyawa P sukar larut Al-P dan Fe-P dengan penurunan pH atau desorbsi P dari jerapan dengan pertukaran anion Crowley dan Rengel 2000 dalam Sopandie 2006. Anion asam organik dapat membentuk kompleks dengan Al atau Fe sehingga dapat melepaskan ion P atau mencegah ion P bereaksi dengan ion Al atau Fe Sopandie 2006.

3. EKSPLORASI, ISOLASI, DAN SELEKSI KONSORSIUM BAKTERI ENDOFIT DARI TANAMAN SAMBILOTO

SEBAGAI PEMACU PERTUMBUHAN TANAMAN Abstrak Bakteri endofit mempunyai peranan yang cukup penting didalam tanaman yaitu sebagai pemacu pertumbuhan tanaman. Percobaan dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi dan Rumah Kaca Balittro Cimanggu Bogor, dari bulan Juni 2011-Oktober 2012. Percobaan ini bertujuan untuk mendapatkan konsorsium bakteri endofit dari beberapa kondisi agroklimat yang mampu memicu pertumbuhan tanaman sambiloto. Percobaan ini terdiri dua tahap, tahap pertama yaitu eksplorasi dan isolasi konsorsium bakteri endofit dari tanaman sambiloto yang tumbuh liar di 4 lokasi yaitu Jawa Timur Madiun dan Pasuruan, Jawa Tengah Blora dan dibudidayakan dari Jawa Barat Bogor. Konsorsium bakteri endofit diisolasi dari jaringan akar, batang dan daun dengan menggunakan media TSA 5 dan 20. Tahap kedua menyeleksi konsorsium bakteri endofit yang diperoleh dari tahap pertama menggunakan rancangan acak kelompok, 25 perlakuan dan 3 ulangan. Perlakuan terdiri dari kontrol dan 24 konsorsium bakteri endofit. Hasil eksplorasi dan isolasi konsorsium bakteri endofit pada tanaman sambiloto diperoleh 24 konsorsium bakteri endofit yang beragam. Konsorsium bakteri endofit yang diisolasi dari jaringan akar 10 5 -10 6 cfu ml -1 mempunyai populasi yang lebih tinggi dibandingkan dengan daun dan batang 10 3 -10 5 cfu ml -1 . Konsorsium bakteri endofit berpengaruh nyata meningkatkan pertumbuhan, bobot kering tajuk 7-82, akar 10-120 dan biomas tanaman pada umur 1.5 bulan. Persentase daya tumbuh kecambah dan bobot kering tajuk tertinggi diperoleh dari pemberian konsorsium bakteri endofit 5MD, 20 BB, 20 BD dan 20 CD. Kata kunci: agroklimat, konsorsium bakteri endofit, daya tumbuh kecambah, sambiloto Abstract Endophytic bacteria have an important role as plant growth promoter. The experiment was conducted at Microbiology Laboratory and greenhouse of ISMCRI at Cimanggu Bogor, from June 2011 to October 2012. This experiment aimed to obtain endophytic bacteria consortia from several agro-climatic conditions as plant growth promoter suitable for king bitter. The experiment consisted of two stages. The first stage was the exploration and isolation of endophytic bacteria consortia from wild grown king of bitter in East Java Madiun and Pasuruan, Central Java Blora; and cultivated in West Java Bogor. Endophytic bacteria consortia was isolated from tissues of roots, stems and leaves using media TSA 5 and 20. The second stage was selecting endophytic bacteria consortia from first stage activity, using a randomized block design RBD, 25 treatments and 3 replications. Treatment consisted of control and 24 endophytic bacteria consortia obtained from the first stage. Endophytic bacteria consortia isolated from the root tissue 10 5 -10 6 cfu ml -1 had higher population than from leaves and stems 10 3 -10 5 cfu ml -1 . Endophytic bacteria consortia significantly increased growth, the shoot dry weight 7-82, roots 10- 120 and plant biomass at 1.5 months old. Endophytic bacteria consortia of 5MD, 20BB, 20BD and 20CD gave the highest germination percentage and shoot dry weight. Keywords : agro-climate, endophytic bacteria consortia, germination percentage, king of bitter Pendahuluan Tanaman sambiloto merupakan salah satu tanaman obat mempunyai khasiat yang cukup penting bagi kesehatan manusia antara lain sebagai hepatoprotektor Rao et al. 2004, antioksidan Lin et al. 2009, antidiabetes Zhang et al. 2009, dan antibakteri Xu et al. 2006. Banyaknya khasiat yang cukup penting tersebut pengembangan teknologi budidaya tanaman sambiloto perlu dilakukan. Tanaman sambiloto merupakan tanaman herba dan yang digunakan untuk bahan baku obat adalah bagian tajuk. Pengembangan teknologi budidaya untuk meningkatkan biomas daun tersebut seminimal mungkin menggunakan bahan kimia. Hal tersebut dengan mengurangi pemberian input seperti pupuk dan tanpa pestisida, sehingga secara ekonomis lebih menguntungkan dan lebih aman untuk dikonsumsi. Bakteri endofit merupakan salah satu alternatif yang dapat dimanfaatkan untuk pengembangan tanaman sambiloto tersebut. Bakteri endofit merupakan bakteri yang hidup didalam jaringan tanaman yang sehat tanpa merugikan tanaman inangnya Hallmann et al.2001; Kloepper et al. 1999. Bakteri tersebut membentuk agregat pada permukaan tanaman dan berinteraksi dengan tanaman dalam bentuk hubungan tertentu mulai dari hubungan bebas, patogen hingga hubungan substansial seperti komensialisme, mutualisme, dan simbiosis Andrews dan Haris 2000. Bakteri endofit mempunyai beberapa mekanisme yang dapat memacu pertumbuhan dan kesehatan tanaman Taghavi et al. 2009. Peningkatan pertumbuhan dan kesehatan tanaman tersebut, tidak lepas dari peranan bakteri endofit yang mampu menghasilkan fitohormon Leveau 2001; Sobral et al. 2004, dapat menyuplai unsur hara melalui proses penambatan unsur hara dari udara Hirano dan Upper 2000, meningkatkan mobilisasi P, dan mengkelat Fe Ryan et al. 2008. Bakteri endofit dapat melawan patogen tanaman melalui induksi ketahanan sistemik dan dihasilkannya senyawa-senyawa metabolit sekunder yang bersifat antagonis Kloepper dan Ryu 2006; Sturz dan Nowak, 2000. Bakteri endofit dapat pula mengurangi stres biotik atau abiotik tanaman, tanpa patogenisitas van Loon dan Bakker 2005; Lugtenberg dan Kamilova 2009. Pedraza et al. 2004 menunjukkan bahwa bakteri endofit dapat menghasilkan fitohormon antara lain Indole Acetic Acid IAA, sitokinin Ergun et al . 2002, dan giberelin GA 3 Khawar el al. 2008. Senyawa-senyawa tersebut sangat diperlukan oleh tanaman untuk pertumbuhan dan perkembangannya sehingga pada akhirnya tanaman dapat berproduksi secara optimal. Pemberian bakteri endofit nyata meningkatkan pertumbuhan dan produksi padi Gusmaini et al. 2007, dan pada tanaman apricot penyemprotan bakteri pada saat pembungaan dapat meningkatkan produksi pada tahun pertama dan ke-dua masing-masing sebesar 30 dan 90 Esitken et al. 2004. Bakteri endofit telah banyak yang diisolasi dari berbagai tanaman baik tanaman liar maupun tanaman yang telah dibudidayakan. Setiap bagian tanaman mengandung bakteri endofit yang beragam. Bakteri endofit telah diisolasi dari seluruh bagian tanaman antara lain dari biji, bunga, buah, daun, batang dan akar dari berbagai spesies tanaman Kobayahsi dan Palumbo 2000. Bakteri endofit yang berperan sebagai pemacu pertumbuhan tersebut, sangat diperlukan bagi tanaman yang hasilnya berupa biomas seperti pada tanaman sambiloto. Di Indonesia penyebaran dan pengembangan tanaman sambiloto serta industri obat tradisional banyak terdapat di pulau Jawa, sehingga perlu dilakukan eksplorasi dan isolasi bakteri endofit yang berasal dari tanaman sambiloto di daerah Jawa Barat, Tengah, dan Timur. Percobaan ini bertujuan untuk mendapatkan konsorsium bakteri endofit dari tanaman sambiloto dari beberapa kondisi agroklimat yang mampu memicu pertumbuhan tanaman sambiloto. Bahan dan Metode Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi dan Rumah Kaca Balittro dari bulan Juni 2011-Oktober 2012. Bahan dan Alat Bahan tanaman sambiloto yang digunakan untuk uji seleksi konsorsium bakteri endofit berasal dari Cimanggu yang merupakan koleksi Balittro. Bahan kimia yang digunakan adalah untuk isolasi dan perbanyakan bakteri endofit. Alat- alat laboratorium untuk isolasi dan perbanyakan bakteri endofit, serta alat-alat untuk penanaman sambiloto di rumah kaca. Metode Penelitian Eksplorasi tanaman sambiloto Eksplorasi bakteri endofit dilakukan pada tanaman sambiloto yang tumbuh liar pada kondisi lingkungan yang berbeda, yaitu di Pasuruan dan Madiun Jawa Timur, dan Blora Jawa Tengah, sedangkan sambiloto yang dieksplorasi dari Bogor Jawa Barat adalah tanaman yang sudah dibudidayakan. Komponen lingkungan yang diamati antara lain ketinggian tempat, curah hujan, suhu udara rata-rata harian, dan sifat kimia tanah masing-masing lokasi pengambilan tanaman sambiloto. Isolasi bakteri endofit Tanaman sambiloto yang diambil dari empat lokasi tersebut dianggap sebagai aksesi yang berbeda karena tidak diketahui genotipe dan varietasnya, sehingga diperoleh 4 aksesi. Isolasi dilakukan dari 3 bagian tanaman yaitu daun, batang, dan akar. Setiap konsorsium bakteri yang diperoleh di isolasi menggunakan dua konsentrasi media Tryptone Soya Agar TSA, yaitu 5 dan 20, sehingga diperoleh 24 konsorsium 4 aksesi, 3 bagian tanaman, dan 2 konsentrasi media. Kedua konsentrasi tersebut yaitu 5 dan 20 merupakan media yang miskin nutrisi diharapkan pada konsentrasi tersebut akan merangsang bakteri sebanyak mungkin untuk tumbuh dan menekan bakteri yang dominan. Adapun cara isolasi bakteri endofit terdapat pada Lampiran 1. Seleksi konsorsium bakteri endofit Konsorsium bakteri endofit yang diperoleh dari isolasi diuji terhadap benih tanaman sambiloto aksesi Cimanggu dalam pot percobaan. Rancangan yang digunakan adalah rancangan acak kelompok, dengan 25 perlakuan yaitu kontrol tanpa endofit dan 24 perlakuan konsorsium bakteri endofit dengan 2 ulangan. Adapun perlakuannya sebagai berikut: 1. Konsentrasi medium TSA 5 dan 20 , 2. Asal daerah Madiun, Pasuruan, Blora, dan Cimanggu, 3. Bagian tanaman akar, batang dan daun. Adapun perlakuan konsorsium bakteri endofit sebagai berikut: Tabel 3.1. Perlakuan konsorsium bakteri endofit pada benih sambiloto pada percobaan di rumah kaca No Perlakuan Hasil isolasi dari Konsentrasi media TSA 1 Kontrol K 2 5MA akar sambiloto asal Madiun 5 3 5MB batang sambiloto asal Madiun 5 4 5MD daun sambiloto asal Madiun 5 5 5PA akar sambiloto asal Pasuruan 5 6 5PB batang sambiloto asal Pasuruan 5 7 5PD daun sambiloto asal Pasuruan 5 8 5BA akar sambiloto asal Blora 5 9 5BB batang sambiloto asal Blora 5 10 5BD daun sambiloto asal Blora 5 11 5CA akar sambiloto asal Bogor 5 12 5CB batang sambiloto asal Bogor 5 13 5CD daun sambiloto asal Bogor 5 14 20MA akar sambiloto asal Madiun 20 15 20BB batang sambiloto asal Madiun 20 16 20MD daun sambiloto asal Madiun 20 17 20PA akar sambiloto asal Pasuruan 20 18 20PB batang sambiloto asal Pasuruan 20 19 20PD daun sambiloto asal Pasuruan 20 20 20BA akar sambiloto asal Blora 20 21 20BB batang sambiloto asal Blora 20 22 20BD daun sambiloto asal Blora 20 23 20CA akar sambiloto asal Bogor 20 24 20CB batang sambiloto asal Bogor 20 25 20CD daun sambiloto asal Bogor 20 Benih sambiloto yang digunakan dalam penelitian ini berasal dari aksesi Cimanggu Gambar 3.1. Benih direndam selama 2x24 jam dengan menggunakan air steril pada suhu ruang. Selanjutnya benih disterilkan dengan menggunakan alkohol 70 selama 30 detik, direndam dalam larutan sodium hypochlorite 1- 2 selama 1-2 menit, lalu dibilas dengan air steril. Benih sambiloto yang telah steril, kemudian dimasukkan ke dalam pot yang telah berisi media zeolit steril.