Waktu dan Tempat Alat dan Bahan Analisis Statistik

12 12

BAB 3 METODE PENELITIAN

3.1. Waktu dan Tempat

Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Juni sampai dengan September 2013 di Laboratorium Struktur Hewan dan Laboratorium Fisiologi Hewan, Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sumatera Utara, Medan.

3.2. Alat dan Bahan

Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah untuk pemeliharaan hewan uji yaitu kandang plastik dan penutup kawat. Alat untuk pemberian perlakuan yaitu timbangan digital, jarum gavage, spit 1 ml, mortar, beaker glass, batang pengaduk, gelas ukur, alat test kolesterol EasyTouch ® , botol zat dan toolbox. Alat untuk pembuatan sediaan histologis yaitu bak bedah, dissecting set, sample cup, botol balsem, botol Winkler, hotplate, holder, mikrotom, kuas, cover glass, object glass, pipet tetes, erlenmeyer, freezer, cutter, spatula, bunsen, chumber, plat parafin, kotak preparat, kertas saring, kertas millimeter, kertas label, kamera digital dan mikroskop Primo Star Zeiss Axio Cam Erc 5C. Bahan yang digunakan adalah mencit Mus musculus L. jantan strain DDW, limut Hydrilla verticillata, kuning telur bebek, striptest kolesterol EasyTouch ® , aluminium foil, pellet pakan mencit tipe Pb551, sekam, aquadest, alkohol, Formalin 10, larutan NaCl 0,9, perak nitrat, sodium tiosulfat, safranin, canada balsam, xylol dan parafin.

3.3. Rancangan Penelitian

Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental dengan menggunakan Rancangan Acak Lengkap RAL dengan 6 perlakuan, yaitu 2 kontrol tanpa perlakuan dan diet kuning telur serta 4 perlakuan ekstrak segar limut diberi diet kuning telur dan ekstrak segar limut dengan berbagai konsentrasi. Universitas Sumatera Utara 13 13 Pembagian masing-masing perlakuan, yaitu: a. Perlakuan 1 : Kontrol normal tanpa perlakuan selama 28 hari b. Perlakuan 2 : Kontrol kolesterol hanya diberi diet kuning telur selama 28 hari c. Perlakuan 3 : Diet kuning telur selama 28 hari + ekstrak segar limut konsentrasi 25 selama 14 hari yaitu mulai dari hari ke-8 sampai hari ke-21 d. Perlakuan 4 : Diet kuning telur selama 28 hari + ekstrak segar limut konsentrasi 50 selama 14 hari yaitu mulai dari hari ke-8 sampai hari ke-21 e. Perlakuan 5 : Diet kuning telur selama 28 hari + ekstrak segar limut konsentrasi 75 selama 14 hari yaitu mulai dari hari ke-8 sampai hari ke-21 f. Perlakuan 6 : Diet kuning telur selama 28 hari + ekstrak segar limut konsentrasi 100 selama 14 hari yaitu mulai dari hari ke-8 sampai hari ke-21 Bagan kerja penelitian selengkapnya dapat dilihat pada Gambar 3. Periode pemberian diet kuning telur 7 14 21 28 Periode pemberian ekstrak segar limut Gambar 3. Alur Penelitian. 0= hari ke-0 pengukuran KKT awal mencit; 7= hari ke-7 pengukuran KKT mencit setelah diberi DKT; 14= hari ke-14 pengukuran KKT mencit setelah 7 hari diberi ekstrak segar limut; 21= hari ke-21 pengukuran KKT mencit setelah 14 hari diberi ekstrak segar limut; 28= hari ke-28 pengukuran KKT akhir mencit dan pengambilan sampel organ aorta. Jumlah ulangan untuk setiap perlakuan ditentukan dengan menggunakan rumus Federer Chairul et al. 1992 yaitu: t - 1 n - 1 ≥ 15 Keterangan: t = jumlah perlakuan n = jumlah ulangan Universitas Sumatera Utara 14 14 Jumlah ulangan yang digunakan dalam penelitian ini adalah sebanyak 4 ekor masing-masing perlakuan, sehingga jumlah mencit jantan yang digunakan adalah sebanyak 24 ekor. 3.4. Prosedur Penelitian 3.4.1. Penyediaan Hewan Uji Penelitian ini menggunakan mencit Mus musculus L. jantan strain DDW yang diperoleh dari Balai Pengujian Penyidikan Veteriner BPPV Sumatera Utara, Medan sebanyak 24 ekor. Mencit dipelihara dalam kandang yang terbuat dari plastik yang diberi alas sekam yang dilakukan pergantian sekam dua kali seminggu. Berat badan mencit yang digunakan ± 30 g Smith Mangkoewidjoyo, 1988. Pemberian pakan dan air ledeng dilakukan secara ad- libitum Hrapkiewicz Medina, 2007.

3.4.2. Pengambilan Bahan Uji

Bahan uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah limut Hydrilla verticillata L. yang diperoleh dari wilayah perairan Danau Toba, Desa Marbun Toruan, Kecamatan Baktiraja, Kabupaten Humbang Hasundutan. Limut diambil pada sore hari dari dalam danau kemudian dimasukkan ke dalam botol yang sudah diisi dengan air dan disimpan di dalam toolbox.

3.4.3. Pembuatan Ekstrak dan Pemberian Dosis Ekstrak pada Perlakuan

Pembuatan ekstrak dilakukan dengan cara mencuci limut, ditiriskan di atas kertas saring lalu dihaluskan dengan menggunakan mortar. Bahan uji yang sudah dihaluskan diperas hingga diperoleh perasan 100 limut. Hasil perasan tersebut dimasukkan ke dalam beaker glass dan dibagi menjadi beberapa konsentrasi yaitu 25, 50, 75 dan 100 dengan penambahan aquadest kemudian dimasukkan ke dalam botol coklat dan disimpan di dalam freezer. Pergantian ekstrak segar limut dilakukan sekali tiga hari untuk mendapatkan ekstrak yang tetap segar. Bahan uji yang digunakan untuk sekali pembuatan ekstrak ± 50 g. Ekstrak yang telah didapatkan diberikan kepada hewan uji mencit jantan secara oral dengan menggunakan jarum gavage Hrapkiewicz Medina, 2007. Universitas Sumatera Utara 15 15 Volume pemberian ekstrak adalah 0,3 mlekorhari, yang ditentukan mengikuti Lisminingsih 1996, dalam Hutapea, 2006, yaitu 0,1 ml10gBBhari. Ekstrak segar limut diberikan selama 14 hari. 3.4.4. Pemberian Diet Khusus Menggunakan Kuning Telur Diet khusus untuk menaikkan kadar kolesterol total mencit dilakukan dengan menggunakan kuning telur sebanyak 0,3 mlekorhari Hutagalung, 2012. Pembuatan diet kuning telur dilakukan dengan cara memisahkan kuning telur dari putihnya dan membuat emulsi kuning telur dengan cara mengocok perlahan. Diet kuning telur diberikan secara oral dengan menggunakan jarum gavage selama 28 hari Wardiah, 2009. Kuning telur berasal dari telur bebek yang diperoleh dari pasar.

3.4.5. Pembuatan Irisan Mikroskopis Aorta Metode Parafin

Irisan pembuluh darah diambil dari aorta mencit dari setiap perlakuan. Mencit dari setiap perlakuan dipuasakan sehari sebelum dibedah yaitu pada hari ke-28 dan kandang dibersihkan lalu alas sekam diganti. Tahapan-tahapan dalam pembuatan irisan mikoskopis aorta adalah sebagai berikut, tahapan pertama yaitu: fiksasi, mencit Mus musculus L. didislokasi leher dan dibedah. Organ aorta diambil dan dicuci dengan larutan NaCl 0,9 kemudian difiksasi selama 1 malam dengan Formalin buffer 10. Washing pencucian dilakukan dengan alkohol 70 dengan cara dishaker sampai benar- benar jernih dan direndam dengan alkohol 70 selama 1 malam. Dehidrasi dilakukan dengan merendam aorta sambil dishaker dengan menggunakan alkohol bertingkat yaitu dari alkohol 70, 80 dan 96 selama 1 jam pada masing-masing konsentrasi. Clearing dilakukan dengan merendam aorta ke dalam xylol di dalam botol balsem selama 1 malam. Infiltrasi dilakukan dengan merendam aorta ke dalam xylol selama 1 jam pada suhu kamar kemudian dipindahkan lagi ke dalam xylol yang baru yang berada di dalam oven pada suhu 56 C selama 1 jam. Aorta selanjutnya direndam ke dalam parafin murni I, II, III masing-masing selama 1 jam pada suhu 56 C, yang selama proses pengerjaannya dilakukan dalam oven. Universitas Sumatera Utara 16 16 Embedding penanaman dilakukan dengan cara meletakkan aorta pada kotak berbentuk segi empat yang telah dipersiapkan sebelumnya sebagai cetakan. Parafin yang telah cair dituang ke dalam kotak tersebut, kemudian aorta ditanam dalam kotak yang telah berisi parafin dan diatur posisinya lalu diberi label. Parafin dibiarkan sampai dingin sehingga membentuk blok parafin dan dimasukkan ke dalam freezer. Blok-blok tersebut dirapikan dan ditempelkan pada holder yang terbuat dari kayu berbentuk persegi dengan bantuan lampu bunsen. Cutting pemotongan dilakukan dengan memotong blok-blok parafin yang telah diholder pada mikrotom sehingga membentuk pita-pita parafin dengan ukuran ketebalan 6µ m. Attaching penempelan dilakukan dengan mengambil beberapa pita parafin dengan skapel, kemudian diletakkan pada object glass, dan dicelupkan pada air dingin dan kemudian pada air hangat. Object glass yang telah ditempel dengan pita parafin diletakkan di atas hotplate beberapa detik untuk melekatkan pita parafin dan membersihkan sebagian parafin yang melekat pada aorta. Deparafinasi dilakukan dengan cara mencelupkan object glass pada xylol sampai parafin habis kira-kira selama ± 5 menit. Dealkoholisasi dilakukan dengan cara mencelupkan object glass ke dalam alkohol bertingkat dengan konsentrasi menurun, yaitu dari alkohol 96, 80, 70, 60, 50, 40, 30 dan kemudian ke dalam aquadest, masing-masing konsentrasi dicelupkan ± 3-5 detik. Sediaan aorta diwarnai dengan menggunakan metode pewarnaan von Kossa Sheehan Hrapchak, 1980. Pewarnaan dilakukan dengan cara preparat dimasukkan kedalam larutan perak nitrat 5 selama satu jam di bawah lampu 60 watt, diletakkan kaca dibelakang staining jar untuk merefleksikan cahaya atau diletakkan di bawah sinar matahari sampai kalsium berubah menjadi warna hitam, lalu dicuci dengan aquadest sebanyak tiga kali, lalu dimasukkan ke dalam larutan hipo 5 sodium tiosulfat selama 5 menit, dicuci dengan air mengalir kemudian dimasukkan ke dalam larutan safranin 1 selama 5 menit sebagai warna pembanding, lalu dicuci dengan air mengalir, kemudian direndam ke dalam xylol selama 1 menit. Mounting dilakukan dengan menutup preparat dengan canada balsam. Diusahakan supaya tidak terdapat gelembung udara. Labelling, preparat yang Universitas Sumatera Utara 17 17 telah selesai dimounting diberi label di bagian pinggir object glass Suntoro, 1983. 3.5. Parameter Pengamatan 3.5.1. Pengukuran Berat Badan Mencit Pengukuran berat badan masing-masing mencit dilakukan setiap hari sebelum diberi perlakuan, data yang diambil adalah data pada saat awal dan akhir sesuai masing-masing perlakuan.

3.5.2. Pengukuran Kadar Kolesterol Total

Kadar kolesterol total masing-masing mencit diukur dengan menggunakan alat test kolesterol. Darah diambil dari bagian ekor mencit dengan menggunakan jarum frank. Darah tersebut dimasukkan ke dalam bagian darah striptest kolesterol. Hasil pengukuran akan tampil pada layar setelah ± 2 menit kemudian dicatat. Pengukuran kadar kolesterol total awal dilakukan setelah seminggu adaptasi mencit. Pengukuran kadar kolesterol total selanjutnya dilakukan seminggu setelah diberi diet kuning telur dan seminggu setelah pemberian ekstrak segar limut. Pengukuran kadar kolesterol total dilakukan setiap sekali seminggu dari setiap perlakuan. Kadar kolesterol total mencit diukur dengan alat test kolesterol EasyTouch ® . 3.5.3. Pengamatan Preparat Mikrostruktur Aorta Pengamatan gambaran mikrostruktur aorta dilakukan untuk mendeteksi adanya penebalan dinding aorta. Ketebalan dinding aorta diukur dengan menggunakan mikroskop Primo Star Zeiss Axio Cam Erc 5C. Preparat diamati dengan menggunakan perbesaran 40x okuler 10x, obyektif 4x, ketebalan penampang lintang aorta diukur dari tunika intima sampai tunika adventisia pada 8 zona, yaitu jam 12.00, 13.30, 15.00, 16.30, 18.00, 19.30, 21.00, dan 22.30. Hasil pengukuran dari 8 zona tersebut selanjutnya dirata-ratakan Nugroho, 2005. Universitas Sumatera Utara 18 18

3.6. Analisis Statistik

Data yang didapat dari setiap parameter variabel pengamatan dicatat dan disusun ke dalam bentuk tabel. Data kuantitatif variabel dependen yang didapatkan, diuji kemaknaannya terhadap pengaruh kelompok perlakuan variabel independen dengan bantuan program statistik komputer SPSS release 15. Urutan uji untuk setiap parameter diawali dengan uji normalitas dan uji homogenitas. Apabila hasil uji normalitas dan uji homogenitas menunjukkan p0,05 maka dilanjutkan uji sidik ragam ANOVA satu arah untuk data dengan pengamatan berulang lebih dari 2 kali atau lebih dari 2 perlakuan. Jika berbeda nyata p0,05 maka dilanjutkan dengan uji analisis Post Hoc-Scheffe taraf 5. Universitas Sumatera Utara 19 19

BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN

Penelitian tentang pengaruh ekstrak segar limut Hydrilla verticillata L. Danau Toba terhadap kadar kolesterol total dan gambaran mikrostruktur aorta mencit Mus musculus L. didapatkan hasil sebagai berikut:

4.1. Pertambahan Berat Badan Mencit

Pemberian ekstrak segar limut tidak berpengaruh terhadap pertambahan berat badan mencit yang diukur pada awal dan akhir penelitian P0,05. Dari hasil analisis statistik menunjukkan bahwa tidak ada perbedaan yang nyata terhadap pertambahan berat badan mencit pada setiap perlakuan yang diuji dengan sidik ragam ANOVA. Hasil selengkapnya dapat dilihat pada Gambar 4. Gambar 4. Pertambahan Berat Badan Mencit Setelah Pemberian Ekstrak Segar Limut. P1= K, P2= DKT, P3= DKT+L25, P4= DKT+L50, P5= DKT+L75, P6= DKT+L100. K= kontrol normal; DKT= diet kuning telur; L= limut Pertambahan berat badan mencit dari setiap perlakuan bervariasi, terlihat pada P1 dan P2 sebesar 3,2 g, P3= 2 g, P4= 3,4 g, P5= 2,5 g dan P6= 2,1 g. Namun, setelah dianalisis statistik tidak berbeda nyata. Hal ini dapat dikatakan bahwa perlakuan tidak berpengaruh terhadap pertambahan berat badan mencit. Menurut Smith dan Mangkoewidjoyo 1988 banyak faktor yang dapat mempengaruhi pertumbuhan mencit salah satunya adalah faktor lingkungan yaitu P1 P2 P3 P4 P5 P6 Series1 3,2 3,2 2 3,4 2,5 2,1 1 2 3 4 B e r at B ad an M e n c it g Perlakuan Universitas Sumatera Utara