Pembuatan Suspensi Bahan Uji Uji Sitotoksisitas

4.7.2 Pembuatan Suspensi Bahan Uji

Pembuatan suspensi bahan uji ekstrak lerak dimulai dari konsentrasi 40 karena kemampuan alat filtrasi yang digunakan hanya dapat melarutkan bahan pada konsentrasi 40. Ekstrak lerak disuspensikan dengan media Rosewell Park Memorial Institute 1640 RPMI-1640 dengan perbandingan 100 artinya 1 gram1 ml. Kemudian dilakukan pengenceran bahan secara dilusi berganda pengenceran ganda dengan mengambil setengah dari ekstrak 40 dan ditambahkan 0,5 ml media RPMI untuk mendapatkan konsentrasi 20. Kemudian diambil lagi setengah dari konsentrasi 20 dan ditambah 0,5 ml RPMI untuk mendapatkan konsentrasi 10, dan seterusnya hingga diperoleh konsentrasi 5, 2,5, 1,25, 0,62, dan 0,31.

4.7.3 Uji Sitotoksisitas

Semua pekerjaan dilakukan dalam Laminar flow Gambar 12. Kultur sel BHK-21 dalam bentuk cell-line ditanam dalam botol roux selama 4 hari Gambar 26. Setelah itu kultur sel dipanen menggunakan trypsine versene solution. Hasilnya kemudian ditanam pada media Rosewell Park Memorial Institute 1640 RPMI-1640 yang terdiri dari 10 serum albumin fetal bovine yang diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 C Gambar 26. Selanjutnya sel fibroblas didistribusikan pada setiap 96 sumuran well microplate Gambar 27a dan b. Setiap sumuran terdiri dari sel dan media RPMI dengan kepadatan 75 x 10 4 selml dalam 150 µ l dan masing-masing diberikan larutan ekstrak lerak pada konsentrasi 40, 20, 10, 5, 2,5, 1,25, 0,62, 0,31 8 sampel sebanyak Universitas Sumatera Utara 25 µ l bahan uji tersebut sebelumnya telah disterilisasi dengan cara filltrasi dengan kertas saring Millipore, USA ukuran pori-pori 0,45 µ m dengan waktu kontak bahan uji selama 24 jamGambar 28. Microplate diinkubasi kembali pada suhu 37 C selama waktu kontak Gambar 29, kemudian dipindahkan dari inkubator. Kontrol sel disiapkan, dan dianggap persentase sel hidupnya adalah 100. Kontrol media dianggap persentase sel hidupnya 0. Selanjutnya, garam tetrazolium MTT dilarutkan dalam Phosphate-Buffered Saline PBS 5 mgmL. MTT ditambahkan secara langsung pada plate yang berisi medium kultur sebanyak 10 μl Gambar 30, kemudian diinkubasi kembali selama kurang lebih 4 jam pada suhu 37 C suasana CO 2 5. Seluruh media dalam sumuran dan bahan uji diambil. Kemudian, setiap sumuran ditambahkan DMSO Dimethylsufoxide sebanyak 50 μl Gambar 32. Plate diaduk secara mekanis dengan Plate Shaker sampai kristal formazan terlarut + 10 menit Gambar 35. Sel fibroblas yang hidup akan terwarnai dengan formazan menjadi biru Gambar 39, sedang yang mati tidak terbentuk warna biru. Selanjutnya, formazan dibaca absorbansinya secara spektrofotometri dengan ELISA reader pada panjang gelombang 620 nm Gambar 35b. Hitung rata-rata persentase kehidupan sel dari nilai Optical density absorbansi masing-masing sampel pada setiap konsentrasi terhadap nilai kontrol. Buat grafik persentase kehidupan sel terhadap kelompok perlakuan dan kontrol. Nilai LC 50 selanjutnya dapat ditentukan dari nilai rata-rata persentase kehidupan sel. Alur uji sitotoksisitas dapat dilihat pada Lampiran 2. Universitas Sumatera Utara Gambar 26. Kultur cell lines BHK-21 dengan media RPMI-1640 Gambar 27. Sel fibroblas didistribusikan ke dalam 96-well microplate a sel fibroblas dalam 96-well microplate b Gambar 28. Kontrol sel diperiksa dengan Gambar 29. Siapkan bahan uji microscope inverted a b Universitas Sumatera Utara Gambar 30. Bahan uji dimasukkan ke dalam Gambar 31. Inkubasi dengan suhu 37 C sumuran 25 μlkonsentrasi suasana CO 2 5 selama 24 jam Gambar 32. MTT dilarutkan dalam PBS 5 mgml dan ditambahkan langsung pada plate yang berisi sel fibroblas sebanyak 10 μl dan diinkubasi selama 4 jam Gambar 33. Hasil uji diperiksa dengan microscope Gambar 34. Seluruh media dan bahan uji inverted untuk melihat terbentuknya formazan dalam sumuran diambil dan ditambah DMSO 50 µl Universitas Sumatera Utara Gambar 35. Plate di-shaking dengan plate shaker Gambar 36. Plate dimasukkan kedalam alat ELISA reader a Formazan dibaca absorbansinya pada monitor menggunakan panjang gelombang 620 nm b Persentase kehidupan sel dihitung menggunakan rumus yang digunakan oleh Christian Khoswanto UNAIR, 2008 sebagai berikut: 15 Rumus Umum: Keterangan: kehidupan sel : persentase jumlah kehidupan sel setelah uji Kehidupan sel = Grup tes + media x 100 Sel + media a b Universitas Sumatera Utara Grup tes : nilai OD Optical density formazan setiap sampel setelah tes Media : nilai OD Optical density formazan pada rata-rata setiap kontrol media Sel : nilai OD Optical density formazan pada rata-rata kontrol sel Contoh hasil pengujian sitotoksisitas ekstrak lerak terhadap sel fibroblas pada pengamatan 24 jam. Tabel 1. NILAI OD OPTICAL DENSITY FORMAZAN KELOMPOK UJI Keterangan : = nilai OD formazan grup tes = nilai OD formazan rata-rata sel = nilai OD formazan rata-rata media Sesuai dengan hasil nilai OD formazan, contoh yang akan dihitung persen kehidupan sel fibroblas adalah pada konsentrasi ekstrak lerak 40, sesuai dengan rumus: Ekstrak lerak 40 Ekstrak lerak 20 Ekstrak lerak 10 Ekstrak lerak 0,31 Kontrol sel Kontrol media 40 Kontrol media 20 Kontrol media 10 Kontrol media 0,31 0,209 0,142 0,1 0,133 0,263 0,162 0,231 0,126 0,109 0,201 0,14 0,119 0,097 0,238 0,145 0,211 0,11 0,096 0,216 0,126 0,106 0,079 0,253 0,143 0,143 0,103 0,093 Rata-rata 0,254 0,15 0,195 0,113 0,099 Universitas Sumatera Utara Kehidupan sel = Grup tes + media x 100 Sel + media Kehidupan sel = 0,209 + 0,15 x 100 0,254 + 0,15 Kehidupan sel = 91,83 Kemudian seterusnya dilakukan perhitungan kehidupan sel pada setiap sampel tes yang telah dilakukan uji.

4.8 Analisa Data