BAB 3
METODE PENELITIAN
3.1 Alat-alat
1. Gelas ukur
100 ml 10 mL Pyrex
2. Gelas beaker
250 ml 1000 ml Pyrex
3. Gelas Erlenmeyer
250 ml Pyrex
4. Corong pisah
500 ml Pyrex
5. Ekstraktor
5000 ml Pyrex
6. Corong kaca
7. Tabung reaksi
Pyrex 8.
Spatula 9.
Pipa kapiler 10.
Pipet tetes 11.
Labu takar 250 ml
Pyrex 12.
Labu rotarievaporator 1000 ml
13. Labu didih
1000 ml Schoot Duran
14. Rotarievaporator
15. Kolom kromatografi
Pyrex 16.
Botol vial 17.
Neraca analitis Mettler AE 200
18. Lampu UV
19. Penangas Air
20. Statif dan klem
21. Alat destilasi
22. Bunsen
23. Bejana KLT
24. Spektrofotometer FT-IR
Shimadzu 25.
Spektrofotometer UV-Visible 26.
Spektrofotometer
1
H-NMR JeolDelta2_NMR
Universitas Sumatera Utara
3.2 Bahan-bahan
1. Daun sambang darah
2. Metanol
Destilasi 3.
N-heksana Teknis
4. Etil asetat
Teknis 5.
Aquadest 6.
Kloroform Teknis
7. Silika gel 40 70-230 mesh ASTM
E.Merck. KGaA 8.
FeCl
3
5 9.
NaOH 10 10.
Mg-HCl 11.
H2SO4
p
12. HCl 2N
13. Plat KLT
Merck Kieselgel 60 F
254
14. Pereaksi Benedict
3.3 Prosedur Penelitian
3.3.1 Penyediaan Sampel
Sampel yang diteliti adalah daun tumbuhan sambang darah yang diperoleh dari areal sekitar kampus USU, Medan, Sumatera Utara. Daun tumbuhan sambang darah
dikeringkan di dalam dan pada suhu ruangan, lalu dihaluskan sampai diperoleh serbuk daun sambang darah sebanyak 1000 gram.
3.3.2 Uji Skrining Fitokimia
Untuk mengetahui adanya kandungan senyawa flavonoida pada daun tumbuhan sambang darah, maka dilakukan uji pendahuluan secara kualitatif, yaitu :
Universitas Sumatera Utara
- Dimasukkan ± 10 gram serbuk daun tumbuhan sambang darah yang telah
dikeringkan dan dipotong kecil-kecil ke dalam Erlenmeyer -
Ditambahkan metanol ± 100 ml -
Didiamkan -
Disaring -
Dibagi ekstrak metanol kedalam 4 tabung reaksi -
Ditambahkan masing-masing pereaksi : a.
Tabung I : dengan FeCl
3
5 menghasilkan larutan hitam b.
Tabung II : dengan NaOH 10 menghasilkan larutan biru violet
c. Tabung III : dengan Mg-HCl menghasilkan larutan merah muda
d. Tabung IV : dengan H
2
SO
4 p
menghasilkan larutan merah
3.3.3 Ekstraksi Daun Tumbuhan Sambang Darah
Serbuk daun tumbuhan sambang darah ditimbang sebanyak 1000 gram, kemudian dimasukkan ke dalam ekstraktor dan diekstraksi maserasi dengan metanol sebanyak 7
liter hingga semua sampel terendam secara merata, dibiarkan selama ± 72 jam dan diulangi sebanyak 2 kali. Hasil ekstraksi ditampung dan dipekatkan dengan
menggunakan alat rotarievaporator sehingga diperoleh ekstrak pekat metanol. Kemudian ekstrak pekat metanol diuapkan diatas penangas air sampai semua pelarut
metanol menguap. Lalu dilakukan pemblokan tanin dengan cara melarutkan ekstrak pekat metanol dengan etil asetat dan disaring. Filtrat etilasetat dirotarievaporator dan
diuapkan hingga semua pelarut etilasetat habis menguap. Fraksi pekat etil asetat dilarutkan kembali dengan metanol dan dilakukan ekstraksi partisi secara berulang-
ulang dengan n-heksana, dimana partisi dihentikan ketika lapisan n-heksana menjadi bening. Kemudian lapisan metanol diuapkan hingga pekat sehingga diperoleh ekstrak
pekat metanol sebanyak 16,33 gram.
3.3.4 Pemutusan Gula dari Senyawa Flavonoida Hidrolisa
Pemutusan gula dari senyawa flavonoida dilakukan dengan hidrolisa asam dengan cara menambahkan HCl 2N ke dalam larutan ekstrak metanol dan dipanaskan sambil
Universitas Sumatera Utara
diaduk di atas penangas air selama 1 jam, kemudian didinginkan dan disaring. Ekstrak metanol-asam hasil hidrolisa diekstraksi partisi dengan kloroform sebanyak 3 kali.
Kemudian lapisan kloroform dirotarievaporator lalu diuapkan di atas penangas air hingga semua pelarut kloroform menguap sehingga diperoleh ekstrak pekat kloroform
sebanyak 1,44 gram.
3.3.5 Analisis Kromatografi Lapis Tipis
Analisis kromatografi lapis tipis dilakukan terhadap ekstrak kloroform dengan menggunakan fase diam silika gel 60 F
254
Merck. Analisis ini bertujuan untuk mencari perbandingan pelarut yang sesuai untuk pemisahan senyawa didalam analisis
kromatografi kolom. Pelarut yang sesuai didasarkan pada jumlah bercak atau noda yang terpisah dengan baik dalam kromatografi lapis tipis.
Pelarut yang digunakan adalah campuran antara n-heksana : etil asetat dengan perbandingan 90:10 vv, 80:20 vv, 70:30 vv, 60:40 vv. Prosedur yang
dilakukan adalah dimasukkan 10 ml larutan fase gerak n-heksana : etil asetat 90:10 vv ke dalam bejana kromatografi, kemudian dijenuhkan. Ditotolkan ekstrak pekat
metanol pada batas bawah plat KLT yang telah diaktifkan. Dimasukkan plat ke dalam bejana yang berisi pelarut yang telah dijenuhkan dan ditutup. Setelah proses elusi
selesai, plat dikeluarkan dari dalam bejana dan dikeringkan. Kemudian plat difiksasi dengan pereaksi FeCl
3
5. Diamati warna bercak yang timbul dan dihitung harga Rf yang diperoleh. Dilakukan perlakuan yang sama untuk perbandingan pelarut n-
heksana : etil asetat 80:20 vv, 70:30 vv, dan 60:40 vv.
3.3.6 Isolasi Senyawa Flavonoida dengan Kromatografi Kolom
Isolasi senyawa flavonoida secara kromatografi kolom dilakukan terhadap ekstrak pekat kloroform yang telah diperoleh. Fasa diam yang digunakan adalah silika gel 40
70-230 mesh ASTM dan fasa gerak yaitu n-heksana 100, campuran pelarut n-
Universitas Sumatera Utara
heksan : etil asetat dengan perbandingan 90:10 vv, 80:20 vv, 70:30 vv, dan 60:40 vv.
Dirangkai alat kolom kromatografi. Terlebih dahulu dibuburkan 65 gram silika gel dengan menggunakan n-heksana, diaduk hingga homogen lalu dimasukkan ke
dalam kolom kromatografi. Kemudian dielusi dengan menggunakan n-heksana 100 hingga silika gel padat dan homogen. Dimasukkan 1,44 gram ekstrak pekat kloroform
yang telah dibuburkan juga terlebih dahulu dengan silika gel ke dalam kolom kromatografi yang telah berisi silika gel yang telah padat. Lalu ditambahkan fasa
gerak n-heksana : etil asetat 90:10 vv secara perlahan-lahan dan diatur sehingga aliran fasa yang keluar dari kolom sama banyaknya dengan penambahan fasa gerak
dari atas. Ditingkatkan kepolaran dengan menambahkan fasa gerak n-heksana : etil asetat dengan perbandingan 80:20 vv, 70:30 vv, dan 60:40 vv. Hasil yang
diperoleh ditampung dalam botol vial setiap 5 ml lalu di KLT dan digabung fraksi dengan harga Rf yang sama.
3.3.7 Pemurnian
Senyawa yang diperoleh dari hasil isolasi dimurnikan dengan melarutkan kembali pasta yang diperoleh dengan pelarut etil asetat, diaduk hingga semua pasta larut
sempurna. Kemudian ditambahkan n-heksana secara perlahan-lahan melalui dinding beaker glass hingga terjadi pengendapan zat-zat pengotor di dasar wadah. Kemudian
didekantasi larutan pada lapisan atas n-heksana, lalu diuapkan sisa pelarut dari pasta hingga diperoleh pasta yang bebas dari pelarut.
3.3.8 Uji Kemurnian Hasil Isolasi dengan Kromatografi Lapis Tipis KLT
Uji kemurnian pasta dilakukan dengan kromatografi lapis tipis dengan menggunakan fasa diam silika gel 60 F
254
dengan fasa gerak n-heksana : etil asetat 60:40 vv, benzene : eter 80:20 vv, dan kloroform : metanol 80:20 vv. Dimasukkan 10 ml
larutan fasa gerak ke dalam bejana kromatografi, lalu dijenuhkan. Ditotolkan pasta
Universitas Sumatera Utara
yang sebelumnya telah dilarutkan dengan etil asetat pada plat KLT. Dimasukkan plat KLT tersebut ke dalam bejana kromatografi yang telah jenuh. Setelah pelarut fasa
gerak merembes sampai batas atas, plat KLT dikeluarkan dari bejana, dikeringkan dan difiksasi dengan menggunakan pereaksi FeCl3 5. Diamati warna noda yang
dihasilkan dan dihitung harga Rf yang diperoleh.
3.3.9 Identifikasi Senyawa Hasil Isolasi
3.3.9.1 Identifikasi dengan Spektrofotometer UV-Visible
Analisis dengan alat spektrofotometer UV-Visible diperoleh dari Laboratorium Pusat Penelitian Kimia – LIPI, kawasan PUSPITEK Serpong Tangerang dengan
menggunakan metanol sebagai pelarut.
3.3.9.2 Identifikasi dengan Spektrofotometer Inframerah FT-IR
Analisis dengan alat spektrofotometer FT-IR diperoleh dari Laboratorium Pusat Peneltian Kimia – LIPI, kawasan PUSPITEK Serpong Tangerang dengan
menggunakan KBr sebagai pelarut.
3.3.9.3 Identifikasi dengan Spektrometer Resonansi Magnetik Inti Proton
1
H-NMR
Analisa dengan alat spektrometer
1
H-NMR diperoleh dari Pusat Penelitian Kimia – LIPI, kawasan PUSPITEK Serpong Tangerang dengan menggunakan Aseton sebagai
pelarut.
Universitas Sumatera Utara
3.4 Bagan Skrining Fitokimia
Serbuk daun tumbuhan sambang darah E. cochinchinensis Lour
diekstraksi maserasi dengan metanol disaring
dipekatkan dibagi ke dalam 4 tabung reaksi
Tabung I Tabung II
Tabung III Tabung IV
ditambahkan pereaksi
FeCl
3
5 diamati
perubahan warna
ditambahkan pereaksi
NaOH 10 diamati
perubahan warna
ditambahkan pereaksi
Mg-HCl diamati
perubahan warna
ditambahkan pereaksi
H
2
SO
4P
diamati perubahan
warna
Larutan Hitam
Positif Flavonoida Larutan
biru violet Positif Flovonoida
Larutan merah muda
Positif Flavonoida Larutan orange
kekuningan Negatif Flavonoida
Universitas Sumatera Utara
3.5 Bagan Penelitian
1000 g serbuk daun tumbuhan sambang darah E. cochinchinensis Lour
Diskrining fitokimia Dimaserasi dengan metanol
sebanyak 7L Didiamkan selama ± 72 jam
Diulangi sebanyak 2 kali Disaring
Ekstak metanol Residu
Diskrining fitokimia Dipekatkan dengan rotarievaporator
Diuapkan hingga semua pelarut metanol menguap
Ekstrak pekat metanol Dilarutkan dengan etil asetat secara berulang-ulang sampai bening
Disaring Ekstrak etil asetat
Endapan Diskrining fitokimia
Dipekatkan dengan rotarievaporator Ekstrak pekat etil asetat
Dilarutkan dengan metanol Diekstraksi partisi dengan n-heksana hingga bening
Lapisan Metanol Lapisan n-heksana
tidak dilanjutkan Diskrining fitokimia
Dipekatkan dengan rotarievaporator Dilakukan uji kandungan gula dengan pereaksi benedict +
Dihidrolisa dengan HCl 2N sambil dipanaskan selama 1 jam Didinginkan
Disaring
Ekstrak metanol asam Residu
Diekstraksi partisi dengan kloroform sebanyak 3 kali Lapisan kloroform
Universitas Sumatera Utara
Lanjutan
Lapisan kloroform Dipekatkan
Ekstrak pekat kloroform Diskrining fitokimia
Diuji KLT untuk mengetahui sistem eluen yang sesuai pada kromatografi kolom Dikolom kromatografi dengan fasa diam silika gel dan fasa gerak
yaitu campuran pelarut n-heksana:etil asetat dengan perbandingan 90:10; 80-20; 70:30; 60:40 vv
Ditampung tiap fraksi sebanyak 5 ml dalam botol vial Diuji KLT untuk mengetahui harga Rf
Digabung fraksi dengan harga Rf yang sama
Fraksi 1 - 67 90:10
Fraksi 68 - 164 80:20
Fraksi 165 - 311 70:30
Fraksi 312 - 441 60:40
Diuji dengan FeCl
3
5 Diuji dengan
FeCl
3
5 Diuji dengan
FeCl
3
5 Diuji dengan
FeCl
3
5 Hasil negatif
Hasil negatif Hasil Positif
Hasil Positif Dimurnikan
Senyawa murni Dianalisis KLT
Ditimbang massanya Dianalisis dengan
spektrofotometer UV-Visible, FT-IR dan
spektrometer
1
H-NMR Hasil analisis
Universitas Sumatera Utara
BAB 4
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil Penelitian
Kategori