Identifikasi Karakteristik Morfologi BAL Prescott 2002.
Pengujian morfologi sel bertujuan melihat bentuk isolat dengan pewarnaan Gram. Bentuk morfologi sel yang diharapkan adalah Gram positif berbentuk batang atau bulat.
Identifikasi Karakteristik Fisiologis BAL Harrigan 1998 a.
Penentuan ketahanan terhadap suhu. Kemampuan BAL tumbuh pada suhu yang berbeda diuji secara kualitatif. Satu
ose isolat BAL dimasukkan dalam 9 ml MRSB. Isolat diinkubasi pada suhu 10, 37, dan 45
o
C selama 2-5 hari. Hasil positif pertumbuhan ditandai adanya kekeruhan pada media tersebut.
b. Penentuan ketahanan terhadap garam.
Bakteri asam laktat memiliki kemampuan tumbuh yang berbeda pada media garam. Ketahanan BAL pada media garam diuji dengan menambahkan garam
NaCl dalam tabung yang berisi MRSB dengan konsentrasi 4,0 dan 6,5 serta satu tabung tanpa penambahan garam NaCl sebagai kontrol. Sebanyak 1 tetes
kultur BAL dimasukkan media tersebut kemudian diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 7-14 hari. Hasil positif pertumbuhan ditandai adanya kekeruhan pada
media tersebut.
c. Penentuan ketahanan terhadap pH.
Ketahanan isolat BAL pada lingkungan asam, netral dan alkali diuji pada berbagai pH. Sebanyak satu tetes kultur BAL ditumbuhkan pada media MRSB
dengan pH 4.4, 7.0 dan 9.6. Media tersebut diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 7 -14 hari. Hasil positif pertumbuhan ditandai adanya kekeruhan pada media
tersebut.
Identifikasi Karakteristik kimiawi BAL Harrigan 1998 a.
Penentuan katalase. Uji katalase dilakukan menggunakan hidrogen peroksida H
2
O
2
. satu ose isolat diambil dari media pertumbuhan MRSA, kemudian diletakkan pada obyek gelas
dan diteteskan pereaksi H
2
O
2
3 pada permukaan obyek gelas serta dibiarkan beberapa saat. Uji positif ditandai dengan terbentuknya gelembung.
Perhitungan Kurva Tumbuh dan
Perbanyakan Kultur
Perhitungan kurva tumbuh BAL dilakukan dengan metode agar tuang, pertumbuhan bakteri diukur setiap jam selama 0-42 jam dan dinyatakan dalam kurva pertumbuhan bakteri.
Pertumbuhan optimum ditetapkan sebagai starter kerja. Perbanyakan kultur dilakukan melalui tahap pembuatan kultur induk, kultur antara dan kultur kerja. Kultur induk diperoleh dengan
cara menambahkan masing-masing 5 mL kultur penyegaran ke-3 ke dalam botol yang berisi 45 mL susu skim steril lalu diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 24 jam. Kultur antara dihasilkan dengan cara menambahkan masing-masing 20 mL kultur induk ke dalam 180 mL
susu skim steril dan diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 24 jam. Kultur kerja dihasilkan dengan menambahkan masing-masing 40 mL kultur antara ke dalam 360 mL susu skim steril
dan diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 13 jam pada L. plantarum TW 14 dan 12 jam pada L. rhamnosus TW 2.
Pada tahap pertama dilakukan fermentasi susu dengan membandingkan berbagai perlakuan konsentrasi penambahan starter sebesar 3, 4, 5, sehingga diperoleh
konsentrasi terbaik yang akan digunakan pada penelitian kedua. Parameter pengamatan
inhibitor tirosinase dan antioksidan yang diamati pada tahap pertama juga akan diamati kembali pada tahap kedua, sebelum dianalisis sampel susu terlebih dahulu diekstraksi.
Ekstraksi Susu
Susu fermentasi dengan dan tanpa penambahan daun kari sebanyak 10 g dihomogenkan dengan 2.5 ml dH
2
O, pH susu fermentasi diturunkan dengan HCl 0.1 M hingga mencapai pH 4.0. Susu fermentasi kemudian dipanaskan dalam waterbath 45
o
C selama 10 menit diikuti dengan sentrifugasi dengan kecepatan 5,000 rpm selama 10 menit. Supernatan diambil dan
ditambahkan NaOH hingga pH 7.0. Supernatan disentrifugasi kembali dengan kecepatan 5,000 rpm selama 10 menit. Supernatan yang diperoleh diambil dan disaring millipore milex
0.45 µm, selanjutnya disimpan pada suhu -20
o
C untuk analisis Shabboo dan Baba 2011.
Pengukuran Inhibitor Tirosinase
Sampel susu yang sudah diekstraksi dan ekstrak daun kari diuji langsung pada multiplate. Asam kojat digunakan sebagai kontrol positif dengan konsentrasi 7.8, 15.60,
31.25, 62.5, 125, 250, 500 ppm. Sebanyak 70 μ l dari masing-masing ekstrak ini ditambahkan dengan 30 μ l enzim tirosinase Sigma 333 unitml dalam buffer fosfat pH 6.5, setelah itu
dilakukan inkubasi pada suhu kamar selama lima menit, kemudian ditambahkan sebanyak 110 μ l substrat 2 mM L-Tirosin atau 12 mM L-DOPA ke dalam tiap lubang multiplate,
campuran diinkubasi selama 30 menit pada suhu kamar. Campuran diukur menggunakan multiplate reader pada λ= 492 nm Batubara et al. 2010.
Pengukuran Antioksidan
Pengukuran aktivitas antioksidan dilakukan menggunakan metode penghambatan radikal bebas 2.2-diphenyl-1-pycrylhydrazil DPPH dengan modifikasi pelarut dan
konsentrasi Marinova dan Batchvarov 2011. Pelarut yang digunakan metanol pada konsentrasi 0.1 mM dan perbandingan sampel : DPPH adalah 1:1. Selanjutnya diinkubasi
pada ruang gelap dan suhu ruang selama 30 menit. Panjang gelombang dukur dengan menggunakan multiwell plate reader ELISA pada λ =517 nm. Sebagai kontrol positif
digunakan vitamin C asam askorbat.
Tahapan Kedua
Konsentrasi starter terbaik pada tahap pertama menjadi rujukan pada tahap kedua. Penelitian tahap kedua melihat pengaruh waktu inkubasi dan penambahan daun kari
terhadap inhitor tirosinase, antioksidan, populasi bakteri asam laktat dan kandungan protein. Matrik kerja pada tahapan kedua tersaji pada Tabel 2.
Daun kari yang digunakan dalam penelitian ini adalah tumbuhan indigenus di Provinsi Aceh, sering digunakan sebagai penyedap pada masakan. Daun ini sangat disenangi karena
memiliki aroma yang khas. Pada penelitian ini daun kari diperoleh dari Desa Cot Keueng, Kecamatan Darul Imarah, Kabupaten Aceh Besar, Provinsi Aceh.
Persiapan Daun Kari
Persiapan daun kari meliputi tahapan sebagai berikut: 1 Identifikasi tumbuhan kari, 2 Pengukuran kadar air dan kadar abu, 3 Ekstraksi daun kari, 4 Pengujian fitokimia dan
total fenolik. Pengeringan daun kari dilakukan pada temperatur 50
o
C selama 8 jam Biswas 2012 dan digiling dengan ukuran 20 mesh. Ekstraksi daun kari menggunakan n-heksana
untuk menghilangkan bagian non polar, lalu residunya diekstraksi dengan etanol 90 dengan perbandingan 1:5. Ekstrak dikeringkan menggunakan penguap putar dan disimpan pada suhu
-20
o
C sebelum dianalisis. Daun kari ditambahkan sebanyak 1 Biswas 2012 pada susu kambing sebelum fermentasi.
Tabel 2 Matrik kerja pengaruh penambahan daun kari dan waktu inkubasi Parameter
Uji Hasil
Preparasi daun kari Identifikasi daun kari
Nama ilmiah daun kari
Uji kadar air Nilai kadar air
Uji kadar abu Nilai kadar abu
Uji fitokimia Nilai alkaloid,
fenolik, terpenoid, tanin,
steroid, saponin
Uji total Fenolik Nilai fenolik
Uji inhibitor tirosinase Nilai inhibitor
tirosinase Uji antioksidan
Nilai antioksidan Pengaruh waktu inkubasi 0
jam, 12 jam, 24 jam dan Uji inhibitor tirosinase
Nilai inhibitor tirosinase
36 jam dengan penambahan Uji antioksidan
Nilai antioksidan daun kari
Uji protein Nilai protein
Uji populasi BAL Jumlah BAL
Gambaran persiapan dari daun kari tersaji pada Gambar 3. Persiapan daun kari meliputi identifikasi, uji kadar air dan abu, ekstraksi, pengujian fitokimia, pengukuran total fenolik, uji
inhibitor tirosinase dan antioksidan.
Identifikasi Spesies Daun Kari
Identifikasi spesies dilakukan di bagian Herbarium Bogoriensis, bidang Botani, Pusat Penelitian Biologi Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia LIPI, Cibinong, Jawa Barat.
Identifikasi spesies daun kari dilakukan dengan cara merendam sampel tumbuhan kari yang terdiri dari akar, batang, daun dan bunga usia muda di dalam alkohol 90 selama 24 jam.
Sampel tumbuhan kari dikeringkan dengan cara diangin-anginkan tidak terpapar matahari langsung. Sampel tumbuhan kari kering tadi diserahkan ke LIPI untuk diidentifikasi.
Penentuan Kadar Air Daun Kari Kementerian Kesehatan 2011
Cawan dikeringkan terlebih dahulu selama 1 jam dalam oven pada suhu 105
o
C, lalu didinginkan dalam eksikator kemudian beratnya ditimbang. Sampel ditimbang seberat 1 g
dan dimasukkan ke dalam cawan, kemudian sampel dimasukkan ke dalam oven selama 4 jam pada suhu 105
o
C, lalu didinginkan 15 menit dalam eksikator kemudian ditimbang kembali sampai diperoleh bobot yang konstan. Pekerjaan ini dilakukan triplo.
= A adalah bobot sampel basah g
B adalah bobot sampel kering g C adalah bobot cawan dan bahan setelah diabukan g
Filtrat Uji Herbarium
Uji kadar air Maserasi 1:5
n - heksana uji kadar abu
Residu Etanol
Penguapan filtrat
Disimpan Suhu -20
C
uji Fitokimia Uji Total
Fenolik Inhibitor
Tirosinase Antioksidan
a. Alkaloid b. Fenolik
c. Flavonoid d. Terpenoid
e. Steroid f .Tanin
g. Saponin
Daun Kari
Gambar 3 Persiapan, ekstraksi dan pengujian daun kari
Penentuan Kadar Abu Daun Kari Kementerian Kesehatan 2011
Cawan porselin dikeringkan pada temperatur 600
o
C selama 30 menit dan didinginkan dalam eksikator kemudian ditimbang. Sebanyak 2 g sampel ditimbang dan dimasukkan ke
dalam cawan porselin. Cawan dan isinya dipanaskan dengan nyala Bunsen sampai tidak berasap lagi. Kemudian cawan dimasukkan ke dalam tanur listrik dengan temperatur 600
o
C sampai contoh menjadi abu kira-kira 30 menit. Setelah didinginkan dalam eksikator
kemudian cawan ditimbang. Dilakukan triplo.
= −
A adalah bobot kosong cawan porselen g B adalah bobot sampel kering g
C adalah bobot cawan dan bahan setelah diabukan g
Uji Fitokimia Harborne 1987
Uji fitokimia merupakan uji pendahuluan untuk mengetahui kandungan senyawa alkaloid, triterpenoid, steroid, saponin, flavonoid, tanin dan fenol secara kualitatif.
a. Uji Alkaloid.
