BAB 3 METODE PENELITIAN
3.1 Alat – Alat
1. Gelas ukur 50 ml100 ml
Pyrex 2. Gelas Beaker
250 ml2000 ml Pyrex
3. Gelas Erlenmeyer 250 ml
Pyrex 4. Corong kaca
5. Corong pisah 500 ml
Pyrex 6. Ekstraktor
2,5 l Schott Duran
7. Kolom kromatografi Pyrex
8. Tabung reaksi Pyrex
9. Plat tetes 10. Rotari evaporator
Büchi R-114 11. Labu alas
1 L Schott Duran
12. Alat pengukur titik lebur Fisher
13. Kapas 14. Kertas aluminium
7,6 m x 300 mm Total Wrap
15. Statif dan klem 16.Spatula
17.Batang pengaduk 18.Neraca analitis
Mettler AE 200 19.Pipet tetes
20.Penangas air Büchi B-480
21.Botol vial 22.Vakum
Büchi B-169 23.Bejana Kromatografi Lapis Tipis
24.Spektrofotometer FT-IR Shimadzu
25.Spektrometer
1
26.Spektrofotometer UV-Visible H-NMR
JeolDelta2NMR-500MHz
27.Kertas Saring 28.Pelat KLT
Merck Kieselgel 60 F
254
3.2 Bahan-Bahan
1. Daun Tumbuhan Pidada Merah Soneratia caseolaris L.
2. Metanol
Destilasi 3.
N-heksana Teknis
4. Etil asetat
Teknis 5.
Aquadest 6.
Silika gel 40 70-230 mesh ASTM untuk k.kolom E.Merck. KGaA 7.
FeCl
3
8. NaOH 10
5
9. Mg-HCl
10. H
2
SO
4p
3.3 Prosedur Penelitian 3.3.1 Penyediaan Sampel
Sampel yang diteliti adalah daun tumbuhan pidada merah yang diperoleh dari desa bagan pekan, Kec.Tanjung Balai,Kab.Asahan. Daun tumbuhan pidada merah ini dikeringkan
di udara terbuka, lalu dihaluskan sampai diperoleh serbuk daun tumbuhan pidada merah sebanyak 1500 gram.
3.3.2 Uji Pendahuluan Terhadap Ekstrak Daun tumbuhan Pidada Merah
Serbuk daun pidada merah diidentifikasi dengan menggunakan cara: 1. Skrining fitokimia
2. Analisis Kromatografi Lapis Tipis
3.3.2.1 Skrining Fitokimia
Untuk mengetahui adanya senyawa flavonoida pada daun tumbuhan pidada merah,
maka dilakukan uji pendahuluan secara kualitatif sebagai berikut :
- Dimasukkan ± 10 gram daun tumbuhan pidada merah Soneratia caseolaris L. yang telah dikeringkan dan dipotong-potong kecil ke dalam erlenmeyer
- Ditambahkan metanol ± 100 ml - Didiamkan
- Disaring - Dibagi ekstrak metanol ke dalam 4 tabung reaksi
- Ditambahkan masing-masing pereaksi a. Tabung I
: dengan FeCl
3
b. Tabung II : dengan H
5 menghasilkan larutan berwarna hitam
2
SO
4p
c. Tabung III : dengan Mg-HCl menghasilkan larutan berwarna merah muda menghasilkan larutan orange kekuningan
d. Tabung IV : dengan NaOH 10 menghasilkan larutan berwarna biru violet
3.3.2.2 Analisis Kromatografi Lapis Tipis KLT
Analisis Kromatografi Lapis Tipis dilakukan terhadap ekstrak metanol dengan menggunakan fasa diam silika gel 600,063-0,200 mm
- Dimasukkan 10 ml larutan fase gerak n-heksana : etil asetat 90:10vv ke dalam bejana
kromatografi, kemudian dijenuhkan.
Merck. Analisis ini dimaksudkan untuk mencari pelarut yang sesuai didalam analisis kromatografi kolom. Pelarut yang
digunakan adalah campuran pelarut n-heksana : etil asetat. Fasa gerak yang digunakan adalah campuran n-heksana : etil asetat dengan perbandingan 90:10 ; 80:20 ; 70:30 ; 60:40 ; 50:50
vv .Cara menganalisis kromatografi Lapis tipis sebagai berikut:
- Ditotolkan ekstrak pekat metanol pada plat KLT yang telah diaktifkan. Dimasukkan plat ke
dalam bejana yang telah berisi pelarut yang telah dijenuhkan, lalu ditutup dan dielusi. Plat yang telah dielusi dikeluarkan dari bejana, lalu dikeringkan dan difiksasi dengan pereaksi
FeCl
3
5.
- Diamati warna bercak yang timbul dan dihitung harga Rf yang diperoleh. Perlakuan yang
sama dilakukan untuk perbandingan pelarut n-heksana : etil asetat dengan perbandingan 80 :20vv; 70:30vv; 60:40vv ; dan 50:50 vv.
Dari hasil analisis KLT menunjukkan bahwa di dalam daun pidada merah terkandung senyawa flavonoida. Hasil pemisahan yang baik diberikan pada fase gerak n-heksana : etil
asetat 50:50vv
3.3.3 Prosedur Memperoleh Ekstrak Pekat Lapisan Metanol dari Daun Tumbuhan Pidada Merah Soneratia caseolaris L.
Serbuk daun tumbuhan pidada merah ditimbang sebanyak 1500 g, kemudian dimaserasi dengan metanol sebanyak ± 10 L sampai semua sampel terendam dan dibiarkan selama ± 4
hari. Maserat ditampung dan dipekatkan dengan menggunakan alat rotarievaporator sehingga diperoleh ekstrak pekat metanol. Kemudian diuapkan hingga semua pelarut metanol
menguap. Lalu dilakukan pemblokan tannin dengan cara melarutkan fraksi metanol dengan etil asetat, dan disaring. Filtrat kemudian dirotarievaporator lalu diuapkan hingga semua
pelarut etil asetat menguap. Lalu fraksi etil asetat dilarutkan dengan metanol dan dipartisi berulang-ulang dengan n-heksana. Lapisan metanol dipisahkan dari lapisan n-heksana, lalu
dipekatkan kembali dengan rotarievaporator dan diuapkan sehingga diperoleh ekstrak pekat lapisan metanol sebanyak 18,96 g.
3.3.4 Isolasi Senyawa Flavonoida dengan Kromatografi Kolom
Isolasi senyawa flavonoida secara kolom dilakukan terhadap ekstrak pekat metanol yang telah diperoleh. Fasa diam yang digunakan adalah silika gel 60G 0,063-0,200 mm dan
fasa gerak yaitu n-heksana 100, campuran pelarut n-heksana : etil asetat dengan perbandingan 90:10vv, 80:20vv, 70:30vv, 60:40vv, dan 50:50vv. Cara
mengisolasi senyawa flavonoida dengan Kromatografi kolom sebagai berikut: - Dirangkai alat kolom kromatografi. Terlebih dahulu dibuburkan silika gel 60G 0,063-
0,200 mm dengan menggunakan n-heksana, diaduk-aduk hingga homogen lalu dimasukkan ke dalam kolom kromatografi.-
- Dielusi dengan menggunakan n-heksana 100 hingga silika gel padat dan homogen.
- Dimasukkan18.96 g ekstrak pekat metanol daun pidada merah ke dalam kolom kromatografi yang telah berisi bubur silika gel, lalu ditambahkan fasa gerak n-heksana :
etil asetat 90 : 10 vv secara perlahan – lahan, dan diatur sehingga aliran fasa yang keluar dari kolom sama banyaknya dengan penambahan fasa gerak dari atas.
- Ditingkatkan kepolaran dengan menambahkan fasa gerak n – heksana : etil asetat dengan perbandingan 50:50vv. Hasil yang diperoleh ditampung dalam botol vial setiap
5 ml , lalu di KLT dan digabung fraksi dengan harga Rf yang sama lalu diuji dengan FeCl
3
- Diuapkan sampai terbentuk kristal. 5.
3.3.5 Pemurnian Rekristalisasi
Kristal yang diperoleh dari isolasi dilarutkan kembali dengan etil asetat
,
diaduk hingga semua kristal larut sempurna. Kemudian ditambahkan etil asetat
pa
3.3.6 Uji Kemurnian Hasil Isolasi dengan Kromatografi Lapis Tipis KLT
secara perlahan–lahan hingga terjadi pengendapan zat-zat pengotor di dasar wadah. Kemudian didekantasi larutan
bagian atas wadah, lalu diuapkan sisa pelarut dari kristal hingga diperoleh kristal yang benar – benar bebas dari pelarut.
Dimasukkan 10 ml larutan fasa gerak ke dalam bejana kromatografi, lalu dijenuhkan. Ditotolkan kristal yang diperoleh dari fraksi 51-60 dengan fase gerak n-heksana :
etil asetat 50:50 vv pada plat KLT. Dimasukkan plat KLT tersebut ke dalam bejana kromatografi yang telah jenuh. Setelah pelarut fasa gerak merembes sampai batas tanda, plat
KLT dikeluarkan dari bejana, dikeringkan, dan difiksasi dengan menggunakan pereaksi FeCl
3
3.3.7 Penentuan Titik Lebur
5 dalam metanol menghasilkan bercak berwarna hitam yang menunjukkan adanya senyawa flavonoida.
Hasil isolasi yang telah murni dimasukkan ke dalam alat pengukur titik lebur, diatur suhu. Lalu diamati suhu sampai kristal melebur.
3.3.8 Identifikasi Senyawa Hasil Isolasi 3.3.8.1 Identifikasi dengan Spektrofotometer UV-Visible
Analisis dengan alat Spektrofotometer UV-Visible diperoleh dari Laboratorium Pusat Penelitian Kimia - LIPI, Kawasan PUSPIPTEK Serpong, Tangerang dengan menggunakan
metanol sebagai pelarut. Gambar 1. 3.3.8.2. Identifikasi dengan Spektrofotometer Inframerah FT-IR
Analisis dengan alat Spektrofotometer FT-IR diperoleh dari Laboratorium Pusat
Penelitian Kimia - LIPI, Kawasan PUSPIPTEK Serpong, Tangerang. Gambar 2. 3.3.8.3 Identifikasi dengan Spektrofotometer Resonansi Magnetik Inti Proton
1
Analisis dengan alat Spektrometer
H-NMR
1
H-NMR diperoleh dari Laboratorium Pusat Penelitian Kimia - LIPI, Kawasan PUSPIPTEK Serpong, Tangerang dengan menggunakan
aseton sebagai pelarut. Gambar 3.
3.4 Bagan Skrining Fitokimia
diekstraksi maserasi dengan metanol disaring
dipekatkan
dibagi ke dalam 4 tabung reaksi
ditambahkan ditambahkan ditambahkan ditambahkan pereaksi FeCl
3
5 pereaksi NaOH 10 pereaksi Mg-HCl pereaksi H
2
SO
4P
diamati perubahan diamati perubahan diamati perubahan
diamati warna warna warna perubahan warna
BAB BAB 4
Larutan biru violet
Larutan merah muda
Larutan orange kekuningan
Larutan hitam
10 g serbuk daun tumbuhan pidada merah
Soneratia caseolaris L.
Tabung II Tabung III
Tabung IV
Positif Flavonoida
Positif Flavonoida
Positif Flavonoida
Positif Flavonoida
Ekstrak pekat metanol
Tabung I
3.5 Bagan Penelitian
1500 g serbuk daun tumbuhan pidada merah Soneratia caseolaris L Diskrining fitokima
Dimaserasi dengan metanol selama + 48 jam Diulangi sebanyak 4 kali
Ekstrak metanol Residu
Diskrining fitokimia Dipekatkan dengan rotarievaporator
ekstrak pekat metanol diekstraksi partisi dengan n-heksana
lapisan metanol Dipekatkan dengan rotarievaporator
Lapisan n-heksana Diskrining fitokimia
Diuapkan hingga kental Negatif
Dilarutkan dengan etil asetat Disaring
Fraksi etil asetat Residu
Dipekatkan dengan rotarievaporator Ekstrak pekat etil asetat
Diskrining fitokimia Diuji KLT untuk mengetahui sistem eluent yang sesuai pada kromatografi kolom
Dikolom kromatografi dengan fasa diam silika gel 60 G0,063-0,200 dan fase gerak n-heksana :etil asetat 50:50 vv
Ditampung tiap fraksi sebanyak 5 ml dalam botol vial Diuji KLT untuk mengetahui harga Rf
Digabung fraksi dengan harga Rf yang sama Fraksi 1-50
90:10 Fraksi 51-60
50-50 diuji
dengan FeCl
3
Negatif direkristalisasi
kristal jarum kuning diuji kemurnian dengan perbandingan 70:30,60:40,50:50
kristal jarum kuning
dikarakterisasi Titik lebur
UV-Visible FT-IR
1
H-NMR Fraksi
61-65
Positif Fraksi
66-70
Positif Fraksi
71-80 Fraksi
81-90
positif Negatif
Fraksi 91-95
positif Fraksi
96-100
positif diuji
dengan FeCl
3
diuji dengan
FeCl
3
diuji dengan
FeCl
3
diuji dengan
FeCl
3
diuji dengan
FeCl
3
diuji dengan
FeCl
3
diuji dengan
FeCl
3
diuji KLT
BAB 4
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1. Hasil penelitian