Alat – Alat Bahan-Bahan Bagan Skrining Fitokimia Bagan Penelitian

BAB 3 METODE PENELITIAN

3.1 Alat – Alat

1. Gelas ukur 50 ml100 ml Pyrex 2. Gelas Beaker 250 ml2000 ml Pyrex 3. Gelas Erlenmeyer 250 ml Pyrex 4. Corong kaca 5. Corong pisah 500 ml Pyrex 6. Ekstraktor 2,5 l Schott Duran 7. Kolom kromatografi Pyrex 8. Tabung reaksi Pyrex 9. Plat tetes 10. Rotari evaporator Büchi R-114 11. Labu alas 1 L Schott Duran 12. Alat pengukur titik lebur Fisher 13. Kapas 14. Kertas aluminium 7,6 m x 300 mm Total Wrap 15. Statif dan klem 16.Spatula 17.Batang pengaduk 18.Neraca analitis Mettler AE 200 19.Pipet tetes 20.Penangas air Büchi B-480 21.Botol vial 22.Vakum Büchi B-169 23.Bejana Kromatografi Lapis Tipis 24.Spektrofotometer FT-IR Shimadzu 25.Spektrometer 1 26.Spektrofotometer UV-Visible H-NMR JeolDelta2NMR-500MHz 27.Kertas Saring 28.Pelat KLT Merck Kieselgel 60 F 254

3.2 Bahan-Bahan

1. Daun Tumbuhan Pidada Merah Soneratia caseolaris L. 2. Metanol Destilasi 3. N-heksana Teknis 4. Etil asetat Teknis 5. Aquadest 6. Silika gel 40 70-230 mesh ASTM untuk k.kolom E.Merck. KGaA 7. FeCl 3 8. NaOH 10 5 9. Mg-HCl 10. H 2 SO 4p 3.3 Prosedur Penelitian 3.3.1 Penyediaan Sampel Sampel yang diteliti adalah daun tumbuhan pidada merah yang diperoleh dari desa bagan pekan, Kec.Tanjung Balai,Kab.Asahan. Daun tumbuhan pidada merah ini dikeringkan di udara terbuka, lalu dihaluskan sampai diperoleh serbuk daun tumbuhan pidada merah sebanyak 1500 gram.

3.3.2 Uji Pendahuluan Terhadap Ekstrak Daun tumbuhan Pidada Merah

Serbuk daun pidada merah diidentifikasi dengan menggunakan cara: 1. Skrining fitokimia 2. Analisis Kromatografi Lapis Tipis

3.3.2.1 Skrining Fitokimia

Untuk mengetahui adanya senyawa flavonoida pada daun tumbuhan pidada merah, maka dilakukan uji pendahuluan secara kualitatif sebagai berikut : - Dimasukkan ± 10 gram daun tumbuhan pidada merah Soneratia caseolaris L. yang telah dikeringkan dan dipotong-potong kecil ke dalam erlenmeyer - Ditambahkan metanol ± 100 ml - Didiamkan - Disaring - Dibagi ekstrak metanol ke dalam 4 tabung reaksi - Ditambahkan masing-masing pereaksi a. Tabung I : dengan FeCl 3 b. Tabung II : dengan H 5 menghasilkan larutan berwarna hitam 2 SO 4p c. Tabung III : dengan Mg-HCl menghasilkan larutan berwarna merah muda menghasilkan larutan orange kekuningan d. Tabung IV : dengan NaOH 10 menghasilkan larutan berwarna biru violet

3.3.2.2 Analisis Kromatografi Lapis Tipis KLT

Analisis Kromatografi Lapis Tipis dilakukan terhadap ekstrak metanol dengan menggunakan fasa diam silika gel 600,063-0,200 mm - Dimasukkan 10 ml larutan fase gerak n-heksana : etil asetat 90:10vv ke dalam bejana kromatografi, kemudian dijenuhkan. Merck. Analisis ini dimaksudkan untuk mencari pelarut yang sesuai didalam analisis kromatografi kolom. Pelarut yang digunakan adalah campuran pelarut n-heksana : etil asetat. Fasa gerak yang digunakan adalah campuran n-heksana : etil asetat dengan perbandingan 90:10 ; 80:20 ; 70:30 ; 60:40 ; 50:50 vv .Cara menganalisis kromatografi Lapis tipis sebagai berikut: - Ditotolkan ekstrak pekat metanol pada plat KLT yang telah diaktifkan. Dimasukkan plat ke dalam bejana yang telah berisi pelarut yang telah dijenuhkan, lalu ditutup dan dielusi. Plat yang telah dielusi dikeluarkan dari bejana, lalu dikeringkan dan difiksasi dengan pereaksi FeCl 3 5. - Diamati warna bercak yang timbul dan dihitung harga Rf yang diperoleh. Perlakuan yang sama dilakukan untuk perbandingan pelarut n-heksana : etil asetat dengan perbandingan 80 :20vv; 70:30vv; 60:40vv ; dan 50:50 vv. Dari hasil analisis KLT menunjukkan bahwa di dalam daun pidada merah terkandung senyawa flavonoida. Hasil pemisahan yang baik diberikan pada fase gerak n-heksana : etil asetat 50:50vv 3.3.3 Prosedur Memperoleh Ekstrak Pekat Lapisan Metanol dari Daun Tumbuhan Pidada Merah Soneratia caseolaris L. Serbuk daun tumbuhan pidada merah ditimbang sebanyak 1500 g, kemudian dimaserasi dengan metanol sebanyak ± 10 L sampai semua sampel terendam dan dibiarkan selama ± 4 hari. Maserat ditampung dan dipekatkan dengan menggunakan alat rotarievaporator sehingga diperoleh ekstrak pekat metanol. Kemudian diuapkan hingga semua pelarut metanol menguap. Lalu dilakukan pemblokan tannin dengan cara melarutkan fraksi metanol dengan etil asetat, dan disaring. Filtrat kemudian dirotarievaporator lalu diuapkan hingga semua pelarut etil asetat menguap. Lalu fraksi etil asetat dilarutkan dengan metanol dan dipartisi berulang-ulang dengan n-heksana. Lapisan metanol dipisahkan dari lapisan n-heksana, lalu dipekatkan kembali dengan rotarievaporator dan diuapkan sehingga diperoleh ekstrak pekat lapisan metanol sebanyak 18,96 g.

3.3.4 Isolasi Senyawa Flavonoida dengan Kromatografi Kolom

Isolasi senyawa flavonoida secara kolom dilakukan terhadap ekstrak pekat metanol yang telah diperoleh. Fasa diam yang digunakan adalah silika gel 60G 0,063-0,200 mm dan fasa gerak yaitu n-heksana 100, campuran pelarut n-heksana : etil asetat dengan perbandingan 90:10vv, 80:20vv, 70:30vv, 60:40vv, dan 50:50vv. Cara mengisolasi senyawa flavonoida dengan Kromatografi kolom sebagai berikut: - Dirangkai alat kolom kromatografi. Terlebih dahulu dibuburkan silika gel 60G 0,063- 0,200 mm dengan menggunakan n-heksana, diaduk-aduk hingga homogen lalu dimasukkan ke dalam kolom kromatografi.- - Dielusi dengan menggunakan n-heksana 100 hingga silika gel padat dan homogen. - Dimasukkan18.96 g ekstrak pekat metanol daun pidada merah ke dalam kolom kromatografi yang telah berisi bubur silika gel, lalu ditambahkan fasa gerak n-heksana : etil asetat 90 : 10 vv secara perlahan – lahan, dan diatur sehingga aliran fasa yang keluar dari kolom sama banyaknya dengan penambahan fasa gerak dari atas. - Ditingkatkan kepolaran dengan menambahkan fasa gerak n – heksana : etil asetat dengan perbandingan 50:50vv. Hasil yang diperoleh ditampung dalam botol vial setiap 5 ml , lalu di KLT dan digabung fraksi dengan harga Rf yang sama lalu diuji dengan FeCl 3 - Diuapkan sampai terbentuk kristal. 5.

3.3.5 Pemurnian Rekristalisasi

Kristal yang diperoleh dari isolasi dilarutkan kembali dengan etil asetat , diaduk hingga semua kristal larut sempurna. Kemudian ditambahkan etil asetat pa

3.3.6 Uji Kemurnian Hasil Isolasi dengan Kromatografi Lapis Tipis KLT

secara perlahan–lahan hingga terjadi pengendapan zat-zat pengotor di dasar wadah. Kemudian didekantasi larutan bagian atas wadah, lalu diuapkan sisa pelarut dari kristal hingga diperoleh kristal yang benar – benar bebas dari pelarut. Dimasukkan 10 ml larutan fasa gerak ke dalam bejana kromatografi, lalu dijenuhkan. Ditotolkan kristal yang diperoleh dari fraksi 51-60 dengan fase gerak n-heksana : etil asetat 50:50 vv pada plat KLT. Dimasukkan plat KLT tersebut ke dalam bejana kromatografi yang telah jenuh. Setelah pelarut fasa gerak merembes sampai batas tanda, plat KLT dikeluarkan dari bejana, dikeringkan, dan difiksasi dengan menggunakan pereaksi FeCl 3

3.3.7 Penentuan Titik Lebur

5 dalam metanol menghasilkan bercak berwarna hitam yang menunjukkan adanya senyawa flavonoida. Hasil isolasi yang telah murni dimasukkan ke dalam alat pengukur titik lebur, diatur suhu. Lalu diamati suhu sampai kristal melebur. 3.3.8 Identifikasi Senyawa Hasil Isolasi 3.3.8.1 Identifikasi dengan Spektrofotometer UV-Visible Analisis dengan alat Spektrofotometer UV-Visible diperoleh dari Laboratorium Pusat Penelitian Kimia - LIPI, Kawasan PUSPIPTEK Serpong, Tangerang dengan menggunakan metanol sebagai pelarut. Gambar 1. 3.3.8.2. Identifikasi dengan Spektrofotometer Inframerah FT-IR Analisis dengan alat Spektrofotometer FT-IR diperoleh dari Laboratorium Pusat Penelitian Kimia - LIPI, Kawasan PUSPIPTEK Serpong, Tangerang. Gambar 2. 3.3.8.3 Identifikasi dengan Spektrofotometer Resonansi Magnetik Inti Proton 1 Analisis dengan alat Spektrometer H-NMR 1 H-NMR diperoleh dari Laboratorium Pusat Penelitian Kimia - LIPI, Kawasan PUSPIPTEK Serpong, Tangerang dengan menggunakan aseton sebagai pelarut. Gambar 3.

3.4 Bagan Skrining Fitokimia

diekstraksi maserasi dengan metanol disaring dipekatkan dibagi ke dalam 4 tabung reaksi ditambahkan ditambahkan ditambahkan ditambahkan pereaksi FeCl 3 5 pereaksi NaOH 10 pereaksi Mg-HCl pereaksi H 2 SO 4P diamati perubahan diamati perubahan diamati perubahan diamati warna warna warna perubahan warna BAB BAB 4 Larutan biru violet Larutan merah muda Larutan orange kekuningan Larutan hitam 10 g serbuk daun tumbuhan pidada merah Soneratia caseolaris L. Tabung II Tabung III Tabung IV Positif Flavonoida Positif Flavonoida Positif Flavonoida Positif Flavonoida Ekstrak pekat metanol Tabung I

3.5 Bagan Penelitian

1500 g serbuk daun tumbuhan pidada merah Soneratia caseolaris L Diskrining fitokima Dimaserasi dengan metanol selama + 48 jam Diulangi sebanyak 4 kali Ekstrak metanol Residu Diskrining fitokimia Dipekatkan dengan rotarievaporator ekstrak pekat metanol diekstraksi partisi dengan n-heksana lapisan metanol Dipekatkan dengan rotarievaporator Lapisan n-heksana Diskrining fitokimia Diuapkan hingga kental Negatif Dilarutkan dengan etil asetat Disaring Fraksi etil asetat Residu Dipekatkan dengan rotarievaporator Ekstrak pekat etil asetat Diskrining fitokimia Diuji KLT untuk mengetahui sistem eluent yang sesuai pada kromatografi kolom Dikolom kromatografi dengan fasa diam silika gel 60 G0,063-0,200 dan fase gerak n-heksana :etil asetat 50:50 vv Ditampung tiap fraksi sebanyak 5 ml dalam botol vial Diuji KLT untuk mengetahui harga Rf Digabung fraksi dengan harga Rf yang sama Fraksi 1-50 90:10 Fraksi 51-60 50-50 diuji dengan FeCl 3 Negatif direkristalisasi kristal jarum kuning diuji kemurnian dengan perbandingan 70:30,60:40,50:50 kristal jarum kuning dikarakterisasi Titik lebur UV-Visible FT-IR 1 H-NMR Fraksi 61-65 Positif Fraksi 66-70 Positif Fraksi 71-80 Fraksi 81-90 positif Negatif Fraksi 91-95 positif Fraksi 96-100 positif diuji dengan FeCl 3 diuji dengan FeCl 3 diuji dengan FeCl 3 diuji dengan FeCl 3 diuji dengan FeCl 3 diuji dengan FeCl 3 diuji dengan FeCl 3 diuji KLT BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Hasil penelitian