- Diamati warna bercak yang timbul dan dihitung harga Rf yang diperoleh. Perlakuan yang
sama dilakukan untuk perbandingan pelarut n-heksana : etil asetat dengan perbandingan 80 :20vv; 70:30vv; 60:40vv ; dan 50:50 vv.
Dari hasil analisis KLT menunjukkan bahwa di dalam daun pidada merah terkandung senyawa flavonoida. Hasil pemisahan yang baik diberikan pada fase gerak n-heksana : etil
asetat 50:50vv
3.3.3 Prosedur Memperoleh Ekstrak Pekat Lapisan Metanol dari Daun Tumbuhan Pidada Merah Soneratia caseolaris L.
Serbuk daun tumbuhan pidada merah ditimbang sebanyak 1500 g, kemudian dimaserasi dengan metanol sebanyak ± 10 L sampai semua sampel terendam dan dibiarkan selama ± 4
hari. Maserat ditampung dan dipekatkan dengan menggunakan alat rotarievaporator sehingga diperoleh ekstrak pekat metanol. Kemudian diuapkan hingga semua pelarut metanol
menguap. Lalu dilakukan pemblokan tannin dengan cara melarutkan fraksi metanol dengan etil asetat, dan disaring. Filtrat kemudian dirotarievaporator lalu diuapkan hingga semua
pelarut etil asetat menguap. Lalu fraksi etil asetat dilarutkan dengan metanol dan dipartisi berulang-ulang dengan n-heksana. Lapisan metanol dipisahkan dari lapisan n-heksana, lalu
dipekatkan kembali dengan rotarievaporator dan diuapkan sehingga diperoleh ekstrak pekat lapisan metanol sebanyak 18,96 g.
3.3.4 Isolasi Senyawa Flavonoida dengan Kromatografi Kolom
Isolasi senyawa flavonoida secara kolom dilakukan terhadap ekstrak pekat metanol yang telah diperoleh. Fasa diam yang digunakan adalah silika gel 60G 0,063-0,200 mm dan
fasa gerak yaitu n-heksana 100, campuran pelarut n-heksana : etil asetat dengan perbandingan 90:10vv, 80:20vv, 70:30vv, 60:40vv, dan 50:50vv. Cara
mengisolasi senyawa flavonoida dengan Kromatografi kolom sebagai berikut: - Dirangkai alat kolom kromatografi. Terlebih dahulu dibuburkan silika gel 60G 0,063-
0,200 mm dengan menggunakan n-heksana, diaduk-aduk hingga homogen lalu dimasukkan ke dalam kolom kromatografi.-
- Dielusi dengan menggunakan n-heksana 100 hingga silika gel padat dan homogen.
- Dimasukkan18.96 g ekstrak pekat metanol daun pidada merah ke dalam kolom kromatografi yang telah berisi bubur silika gel, lalu ditambahkan fasa gerak n-heksana :
etil asetat 90 : 10 vv secara perlahan – lahan, dan diatur sehingga aliran fasa yang keluar dari kolom sama banyaknya dengan penambahan fasa gerak dari atas.
- Ditingkatkan kepolaran dengan menambahkan fasa gerak n – heksana : etil asetat dengan perbandingan 50:50vv. Hasil yang diperoleh ditampung dalam botol vial setiap
5 ml , lalu di KLT dan digabung fraksi dengan harga Rf yang sama lalu diuji dengan FeCl
3
- Diuapkan sampai terbentuk kristal. 5.
3.3.5 Pemurnian Rekristalisasi
Kristal yang diperoleh dari isolasi dilarutkan kembali dengan etil asetat
,
diaduk hingga semua kristal larut sempurna. Kemudian ditambahkan etil asetat
pa
3.3.6 Uji Kemurnian Hasil Isolasi dengan Kromatografi Lapis Tipis KLT
secara perlahan–lahan hingga terjadi pengendapan zat-zat pengotor di dasar wadah. Kemudian didekantasi larutan
bagian atas wadah, lalu diuapkan sisa pelarut dari kristal hingga diperoleh kristal yang benar – benar bebas dari pelarut.
Dimasukkan 10 ml larutan fasa gerak ke dalam bejana kromatografi, lalu dijenuhkan. Ditotolkan kristal yang diperoleh dari fraksi 51-60 dengan fase gerak n-heksana :
etil asetat 50:50 vv pada plat KLT. Dimasukkan plat KLT tersebut ke dalam bejana kromatografi yang telah jenuh. Setelah pelarut fasa gerak merembes sampai batas tanda, plat
KLT dikeluarkan dari bejana, dikeringkan, dan difiksasi dengan menggunakan pereaksi FeCl
3
3.3.7 Penentuan Titik Lebur
