Isolasi dan Karakterisasi Bakteri dan Jamur Pengkontaminasi Beberapa Kultur Jaringan dan Ruangan Kultur Departemen Biologi FMIPA USU

42

Lampiran 1 BaganAlirPenelitian

Isolasi dan Karakterisasi Bakteri dan Jamur Pengkontaminan (Udara)

IsolasiMikroorganisme Aerosol di Lab. KulturJaringan FMIPA

Bakteri _Jamur

Pewarnaan Gram

UjiBiokimia

Hasil

PengamatanJamurMi kroskopis (Block

Square)

Pewarnaan LPCB (Lactophenol Cotton

Bl )

Isolasi dan Karakterisasi Bakteri dan Jamur Pengkontaminan (Kontaminasi Kultur)

IsolasiMikroorganismePengko ntaminasibeberapaKultur di Lab. KulturJaringan FMIPA

USU

Bakteri Jamur

Pewarnaan Gram

PengamatanJamurM ikroskopis (Block

Square)

UjiBiokimia _{Pewarnaan LPCB}

(Lactophenol Cotton Blue)

44

Perhitungan Bakteri dengan TPC setelah Fumigasi dengan Formalin 4%

PerhitunganMikrobaSetelahFumi gasi Formalin 4% di Lab. KulturJaringan FMIPA USU

Isolasidengan media PCA di

limatitikpengambilansampeldandilakukanselama 5 hariberturut turutsetelahdifumigasi

Dibuka petri berisi media PCA selama 30 menit di

masing-masingtitikpengambilansampeldanditutupkembali

Dilabel,

ditandaidandimasukkankeincubatorselama 24 jam

Dihitung jumlahmikroba yang tumbuhdengancolony counter

Lampiran 2 Denah Lokasi Pengambilan Sampel di Laboratorium Kultur Jaringan Departemen Biologi FMIPA USU

Gudang

TITIK 1 TITIK

2

TITIK 3 TITIK

4 TITIK 5

Toilet

Ruang

asisten

Ruang

dosen

Pintu masuk

Halaman Hutan

46

Lampiran 3 Pertumbuhan Bakteri Selama Perlakuan Fumigasi

Tabel 7. Jumlah Koloni Bakteri setelah Fumigasi

Minggu ke-

Kondisi TitikLokasi (cfu)

Rata- rata Titik 1 Titik 2 Titik 3 Titik 4 Titik 5

1 Sebelumdifumigasi 70 90 55 57 52 64.8

Hari ke1 setelahfumigasi 35 46 22 25 24 30.4

Hari ke2 setelahfumigasi 42 63 26 28 30 37,8

Hari ke3 setelahfumigasi 51 70 34 32 39 45,2

Hari ke4 setelahfumigasi 61 78 46 38 45 53,6

Hari ke5 setelahfumigasi 67 83 51 46 50 59,4

2 Sebelumdifumigasi 75 85 50 56 58 64,8

Hari ke1 setelahfumigasi 38 40 28 26 28 32

Hari ke2 setelahfumigasi 43 45 37 35 34 38,8

Hari ke3 setelahfumigasi 49 52 44 41 40 45,2

Hari ke4 setelahfumigasi 56 58 50 48 47 51,8

Hari ke5 setelahfumigasi 65 64 58 57 59 60,6

3 Sebelumdifumigasi 68 85 57 60 55 65

Hari ke1 setelahfumigasi 30 41 29 29 27 31,2

Hari ke2 setelahfumigasi 35 46 35 37 34 37,4

Hari ke3 setelahfumigasi 41 51 40 42 40 42,8

Hari ke4 setelahfumigasi 47 57 46 48 45 48,6

Hari ke5 setelahfumigasi 53 62 54 55 52 55,2

4 Sebelumdifumigasi 69 78 60 60 58 65

Hari ke1 setelahfumigasi 33 35 30 31 29 31,6

Hari ke2 setelahfumigasi 39 40 37 38 34 37,6

Hari ke3 setelah fumigasi 45 47 44 43 40 43,8

Hari ke4 setelahfumigasi 51 51 50 50 48 50

Hari ke5 setelahfumigasi 60 59 58 59 55 58,2

5 Sebelumdifumigasi 70 90 55 58 54 65,4

Hari ke1 setelahfumigasi 42 63 25 20 30 36

Hari ke2 setelahfumigasi 51 70 34 28 39 44,4

Hari ke3 setelahfumigasi 61 78 46 38 45 53,6

Hari ke4 setelahfumigasi 67 83 51 46 50 59,4

Hari ke5 setelahfumigasi 69 88 54 50 54 63

6 Sebelumdifumigasi 69 88 58 55 58 65,6

Hari ke1 setelahfumigasi 42 63 25 20 30 36

Hari ke2 setelahfumigasi 50 70 34 28 39 44,2

Hari ke3 setelahfumigasi 55 74 38 34 44 49

Hari ke4 setelahfumigasi 60 78 43 39 49 53,8

Lampiran 4 Data Faktor Fisik di LaboratoriumKulturJaringan FMIPA USU

No. Titik Kelembapanudara (% RH) Suhu (0C)

1. 1 54% 33,40C

2. 2 50% 330C

3. 3 Kondisi AC hidup : 51% 27 0C Kondisi AC mati : 48% 28,4 0C 4. 4 Kondisi AC hidup : 51% 26,5 0C Kondisi AC mati : 50% 27,8 0C 5. 5 Kondisi AC hidup : 49% 26,5 0C Kondisi AC mati :51% 26,8 0C

48

Lampiran 5 DokumentasiPenelitian

a. Pengambilan Sampel Mikroorganisme Aerosol

Titik 1 Titik 2

Titik 3 Titik 4

b. Kontaminasi Kultur

Kultur eksplan daun Apel Kultur eksplan Bunga betina Kelapa Sawit

Kultur eksplan Biji Balaka Kultur eksplan Apical Bud Kelapa Sawit c. Media Penelitian

50

d. UjiBiokimia

e. Hasil Pewarnaan Gram

g. Hasil Pewarnaan LPCB

Penicillium sp. Fusarium sp.

Mucor sp. Aspergillussp.

52

DAFTAR PUSTAKA

Altan, F., Burun, B. & Sahin, N. 2010.Fungal Contamination observed during micropopagation of Lilium candidum L. and the effects of chemoteurapeutic substances applied after sterilization.African journal of Biotechnology.9(7): 991-995

Barbosa, H.R., Rodrigues, M.F.A., Campos, C. C., Chaves, M.E., Nunes, I., Juliano, Y. & Novo N.F. 1994. Counting of viable cluster of forming and cluster non-forming bacteria: a comparison between the drop and the spread methods. Journal of Microbial Methods. 22(1) : 39-50

Braswell, J.R., Spiner, D.R. & Hoffman, R.K. 1970.Adsorption of formaldehyde by various surfaces during gaseous decontamination.Journal of American Society for Microbiology. 20(5): 765-769

Buckley, P. M., Dewilde, T.N & Reed, B. M. 1995.Characterization and Identification of Bacteria isolated from micropopagated Mints Plant.Journal in Vitro Cell Biology. 31: 58-64

Chen, W. L. &Yeh, D. M. 2007.Elimination of in vitro contamination, shoot multiplication, and ex vitro rooting of Aglaonema.Journal of Hort Science. 42(3): 629-632

Connoly, G. P. & Fletcher, J.T. 1981. Procedures for the generation of formaldehyde vapour to fumigate structure. Journal Plant Pathology. 30(2) : 245-250

Dreyfus, W.M. 1983. Review of formaldehyde fumigation. Journal American Public HealthAssociation : New York. Pages 1046-1049

Dwidjeseputro, D. 1978. Dasar-dasar Mikrobiologi.Jakarta : Penerbit Djambatan. hlm. 91-92

Gandjar, I., Samson, R.A., Vermulen. K. V. D., Oetari,A&Santoso, I. 1999.Pengenalan Kapang Tropik Umum. Yayasan Obor Indonesia: Jakarta. Hal. 136.

Hoffman, R.K & Spiner, D.R. 1970.Effects of relative humidity on the penetrability and sporocidal activity of formaldehyde.Journal American Society for Microbiology. 20(4) : 616-619

Holt, J.G., Cowan, S.C., Murray, R.G.E. & Stainer, R.Y. 1994. Bergeys Manual of Determinative of Bacteriology. California: United stated of America. pages 571-576

Irianto, A. 2002. Mikrobiologi Lingkungan. Edisi Pertama. Pusat Penerbitan Universitas Terbuka: Jakarta. hlm. 72.

40

Jena, R. C. & Samal, K.C. 2011.Endogenous microbial contamination during in vitro culture of sweet potato (Ipomea batatas L. Lam) identification and prevention.Journal of Agricultural Technology. 7(6):1725-1731

Lay, B. W. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. Jakarta: Raja Grafindo Persada. hlm. 150-156

Leggats & Waites, W.M. 1988.Characterization of microorganisms isolated from plants during micropopagation.Journal of Acta Horticultures and Bacterial Contamination in vitro.225: 93-101

Leifert, C. & Cassels, A. C. 2001.Microbial Hazards in Plant Tissue and Cell Cultures.Journal in vitro Cell Biology Plant.37:133-138

Listiandini, K. 2011. Identifikasi Kapang Endofit ES1, ES2, ES3 dan ES4 dari Broussonetia papynifera Vent.dan Pengujian Aktivitas Antimikroba.Depok : Universitas Indonesia. hlm 8-12

Mbah, E.I & Wakil, S. M. 2012.Elimination of Bacteria from in vitro Yam Tisuuse Cultures using Antibiotics.Journal of Plant Pathology. 94(1): 53-58

Msogoya,T., Kanyagha, H., Mutigih, J., Kulebelwa, M & Mamiro, D. 2012.Identification and management of microbial contaminants of bananas in vitro cultures.Journal of Apllied Biosciences.55:3987-3994

Munro, M., Lanser, J. & Flower, R. 1999.A comparative study of methods to validate formaldehyde decontamination of biological safety cabinets.Journal of applied and enviromental microbiology.65(2) : 873-876

Mwrigi, P. N., Kahangi, E. M., Nyende, A. B. & Mamati, E. G. 2010.In vitro of the Kenyan Yam (Dioscorea spp.).African journal Hort Sciences. 3:112-122

Omamor, I. B., Asemota, A. O., Eke, C. R. & Eziashi, E. I. 2007. Fungal contaminants of the Oil Palm Tissue Culture in Nigerian Institute for Oil Palm Research (NIFOR). African Journal of Agriculture Research. 2(10) : 534-537

Pelczar, M. J & Chan, E. C.S. 1988. Dasar-dasar Mikrobiologi. UI Press: Jakarta. hlm. 642-643.

Putri, I. A. 2009. Kajian Glycocalyx Bakteri pada Kontaminasi Ulin (Eusidoroxylon zwageri) in vitro. Jurnal Pemuliaan Tanaman. 3(1) : 33-42

Reed, B. M. & Tanprasert, P. 1995. Detection and control of bacterial contaminations of Plant Tissue Cultures.Journal of Plant Tissue Culture and Biotechnology. 1(3): 137-142

Rohman, A.F. 2011.Analisis Kualitas Udara Ruang (In door) secara Mikologis : Studi Kasus di Pemukiman Kumuh Kecamatan Semampir Surabaya. Surabaya : Universitas Airlangga

Santoso, A. & Sutigno, P. 2004. Pengaruh fumigasi ammonium hidroksida terhadap emisi formaldehida kayu lapis dan papan partikel.Penelitian hasil hutan. 1(22) : 9-16

Scholz, F. & Bergmann, F. 1984.Selection pressure by air pollution as studied bt isozimes gene systems in Norway Spruce Exposed to Sulphur dioxide. Journal of Silva Genetica. 6(4):40-43

Sien, L.S., Chuan, C.H., Lihan, S & Yee, L.T. 2013. Isolation and identification of airbone bacteria inside swiftlet houses in Sarawak, Malaysia. Makara Journal Science. 17(3): 105-108.

Sinta, M. M., Riyadi, I. & Sumaryono. 2014. Identifikasi dan Pencegahan Kontaminasi pada Kultur Cair Sistem Perendaman Sesaat. 82(2) : 64-69

Subarnas, A. 2011.Produksi Karantin melalui Kultur Jaringan. Bandung: Penerbit Lubuk Agung.hlm. 45,49,53-59,61-62

Susilowati, A. & Listyawati, S. 2001. Keanekaragaman Jenis Mikroorganisme Sumber Kontaminasi Kultur in vitro di Sub-Lab Biologi Laboratorium MIPA Pusat UNS. 2(1) : 110-114

Waluyo, L. 2005. Mikrobiologi Lingkungan. Penerbit Universitas Muhammadiyah Malang: Malang. hlm. 67-68.

Wojtania, A., Pulawska, J. & Gabryszewska, E. 2005.Identification and elimination of Bacterial contaminants from Pelargonium Tissue Cultures. Journal of Fruit and Ornamental Plant Research.13: 101-108

Zulkarnain, H. 2009. Kultur Jaringan Tanaman. Jakarta: Bumi Aksara. hlm.90,92-95, 111-112

BAB 3

METODOLOGI PENELITIAN

3.1. Waktu dan Tempat

Penelitian dilaksanakan pada bulan November 2015 sampai dengan Juni 2016 di Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, dan Laboratorium Kultur Jaringan, Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sumatera Utara, Medan.

3.2. Posedur Penelitian

3.2.1. Isolasi Bakteri dan Jamur yang berasal dari kultur tanaman

Media Nutrient Agar dan Potato Dextrose Agardituangkan kedalam masing-masing petri steril secara aseptis.Media diratakan dengan membentuk angka delapan dan dibiarkan hingga memadat. Sebanyak 1 ose dari kultur tanaman yang terkontaminasi diambil dengan menggunakan ose bengkok dan digoreskan ke media Nutrient Agar untuk golongan bakteri dan Potato Dextrose Agar untuk golongan jamur, diinkubasi selama 24 jam untuk bakteri dan 2 x 24 jam untuk jamur di inkubator. Satu koloni diambil dan dimurnikan.

3.2.2. Isolasi Bakteri dan Jamur yang berasal dari udara

Prosedur isolasi dilakukan berdasarkan metode Malaysia Veterinary Health Air Quality Sampling (Sien et al., 2013) yaitu metode pasif (settle plate) dengan modifikasi. Cawan petri sterilberisi media PDA dan NA dibuka selama 30 menit di 5 titik pengambilan sampel(Lampiran 2 hlm. 45). Untuk setiap titik dilakukan dua ulangan. Cawan petri ditutup, dilabel tanda sesuai lokasi dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam yang berisi media NA, sedangkan untuk media PDA diinkubasi pada suhu 28oC selama 24-48 jam.Mikroorganisme yang tumbuh diamati dan ditentukan karakteristiknya berdasarkan tepi koloni, bentuk koloni, elevasi koloni dan warna koloni.Satu koloni diambil dan dimurnikan.

3.2.3. Karakterisasi Bakteri denganPewarnaan Gram

Dari kultur bakteri yang berasal dari planlet tanaman maupun udara dibuat preparat ulas,diberi 1-2 tetes zat warna kristal violet, dibiarkan selama 1 menit, dibilas dengan aquadest, dikeringanginkan dan diberi iodine sebanyak 1-2 tetes selama 30 detik, dibilas dengan aseton alkohol selama 15 detik kemudian dibilas dengan aquadest.Preparat ulas tersebut diberi 1 tetes larutan safranin (zat warna tanding) selama 1 menit, dibilas dengan aquadest, dikeringkan dan diamati di bawah mikroskop.

3.2.4. Karakterisasi Bakteri dengan Uji Bikomia Sederhana 3.2.4.1. Uji Hidrolisa Pati

Media pati steril dicairkan, dituangkan ke petri, dibiarkan hingga memadat dan dibagi menjadi dua kuadran. Biakan bakteri diambil dengan ose bengkok lalu digoreskan pada masing-masing kuadran dan diinkubasi selama 24-48 jam dan ditetesi iodine pada permukaan koloni bakteri dan dilihat uji positif jika terdapat zona bening pada koloni setelah ditetesi iodine(Lay, 1994).

3.2.4.2. Uji Hidrolisa Gelatin

Media gelatin semisolid yang terdapat di dalam tabung reaksi, ditusuk secara lurus dengan ose lurus yang berisi inokulum bakteri (biakan cair) pada bagian tengah media, diinkubasi selama 24-48 jam, dimasukkan ke dalam lemari pendingin selama 10 menit dan dilihat uji positifnya jika terdapat cairan pada permukaan media (Lay, 1994).

3.2.4.3. Uji Sitrat

Media SCA (Simon’s Sitrate Agar) diambil. Inokulum bakteri digoreskan pada media dengan menggunakan ose bengkok, diinkubasi selama 24-48 jam, diamati perubahan warna pada uji tersebut dan dilihat uji positifnya jika terdapat perubahan warna pada media dari hijau menjadi biru (Lay,1994).

20

3.2.4.4. Uji TSIA

Media miring TSIA (Tripple Sugar Iron Agar) disiapkan, digoreskan dengan ose bengkok yang berisi inokulum, ditusuk pada bagian tengah media secara lurus dengan ose lurus, diinkubasi selama 24-48 jam dan diamati perubahan warna pada slant dan butt pada media, keretakan pada media dan ada tidaknya endapan hitam (Lay,1994).

3.2.4.5. Uji Motilitas

Media SIM (Sulfite Indole Motility) disiapkan di dalam tabung reaksi, diinokulasikan bakteri dengan ose lurus pada media dengan cara menusukkannya secara lurus hingga setengah media, diinkubasi selama 24-48 jam dan diamati tipe bentuk pergerakan bakteri (Lay,1994).

3.2.4.6. Uji Katalase

Glass slide disiapkan dan satu lup ose biakan bakteri diinokulasikan pada permukaan object glass, diteteskan dengan 2-3 tetes H202 3% pada permukaan

glass slide, dan dilihat uji positifnya dengan melihat terjadinya pembentukan gelembung gas yang berasal dari proses penguraian H202 (Lay,1994).Hasil

karakterisasi dari masing-masing isolat diidentifikasi dengan merujuk kepada buku Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology Edisi Kesembilan.

3.2.5.Karakterisasi Jamur dengan Pengamatan Jamur Mikroskopis (Metode Block Square)

Kertas saring bulat, alumunium foil berbentuk huruf U, object glass, dan cover glass disiapkan dan dimasukkan ke dalam beaker glass yang berisi air bersih. Beaker glass tersebut dipanaskan di atas hot plate. Kertas saring bulat, alumunium foil berbentuk huruf u, objek glass dan potongan media PDA diletakkan di dalam cawan petri dan ditotolkan jamur ke sisi media block square. Kemudian ditutup dengan cover glass steril dan di inkubasi selama 2 hari, lalu diamati dan diidentifikasi jamur di bawah mikroskop.

3.2.6. Pewarnaan Jamur dengan Laktofenol cotton blue(LPCB)

Isolat fungi yang memiliki hifa di ambil sebanyak 1-2 ose lup di goreskan ke glass slide dan di teteskan dengan 1-2 tetes zat warna lactophenol cotton blue dan diamati di bawah mikroskop.Pewarnaan ini dilakukan untuk melihat ada tidaknya konidia dan konidiofor dari jamur tersebut.Hasil karakterisasi dari masing-masing isolat diidentifikasi dengan merujuk kepada buku Mikologi Identifikasi Kapang (Gandjar & Sjamsuridjal, 2006).

3.2.7. Perhitungan Jumlah Mikroba Setelah Proses Fumigasi

Metode yang digunakan dengan metode drop (presipitasi) dimana cawan petri dibiarkan terbuka dalam waktu tertentu untuk mengetahui jumlah mikroorganisme yang tumbuh pada media dan dihitung dengan colonycounter. Fumigasi dilakukan dengan cara penyemprotan menggunakan sprayer yang berisi formalin 4% secara teratur seminggu sekalidi Laboratorium Kultur Jaringan Departemen Biologi FMIPA USU. Penyemprotan ini dilakukan disekitar rak botol kultur diruangan inkubasi, celah antarbaris rak dan area kerja dimana semua media dan peralatan disimpan terlebih dahulu. Waktu pemaparan dari fumigasi ini adalah 1-2 x 24 jam. Isolasi dilakukan kembali dengan menumbuhkannya di media PCA (Plate Count Agar)dengan prosedur buka tutup petri selama 30 menit di 5 titik yang ditentukan. Hasil isolasi diinkubasi selama 1 x 24 jam dan dihitung. Pengamatan mikroba ini dilakukan setiap hari setelah fumigasi untuk melihat sejauh apa efisiensi formalin 4% dalam mengurangi jumlah koloni mikroba dan dihitung jumlah koloni yang tumbuh setiap hari. Fumigasi dilakukan selama 6 minggu.

BAB 4

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Gambaran Umum Lokasi Pengambilan Sampel Mikroorganisme (Udara) di Laboratorium Kultur Jaringan Fakultas MIPA USU

Pengambilan sampel dilakukan pada 5 lokasi di Laboratorium Kultur Jaringan Departemen Biologi Fakultas MIPA USU, yaitu ada di dalam 2 ruangan (Lampiran 2 hlm. 45) yakni di ruangan Laboratorium Fisiologi Tumbuhan dengan lokasi pertama di area meja kerja dekat pintu masuk ruangan, dan di meja dekat area kamar mandi dengan jumlah pengunjung yang keluar masuk rata-rata 11-30 orang per hari. Sedangkan di Laboratorium Kultur Jaringan, lokasi ketiga di ruang preparasi (dekat rak alat gelas-gelas kaca), lokasi keempat di ruang tanam (Laminar Air Flow Cabinet dengan kondisi lampu UV dimatikan), dan lokasi kelima di ruang inkubasi (di meja keramik dekat rak inkubasi dengan kondisi AC dimatikan) dengan jumlah pengunjung yang keluar masuk rata-rata 5-10 orang per hari. Perawatan kebersihan ruangan juga dilakukan seperti menyapu ruangan sebanyak 2 kali pada saat pagi hari dan sore hari, penggunaan desinfektan pada saat mengepel lantai seminggu sekali, dan dilakukan fumigasi dengan formalin 4% seminggu sekali.

4.2. Karakteristik Bakteri yang diisolasi dari Udara Ruangandi Laboratorium Kultur Jaringan Departemen Biologi FMIPA USU

Isolasi bakteri dari udara ruangan di laboratorium Kultur Jaringan Departemen Biologi FMIPA USU didapatkan 11 koloni isolat bakteri yang berbeda yang diinkubasi di media NA. Karakterisasibakteri ini dilakukan dengan 2 cara yakni karakteristik morfologi bakteri (Tabel 1) dan uji biokimia sederhana (Tabel 2). Dari ke 11 koloni isolat bakteri terdiri dari 7 golongan bakteri Gram positif (Bacillus, Staphylococcus dan Streptococcus) dan 4 golongan bakteri Gram negatif (E. coli dan Pseudomonas) dengan bentuk dan penataan yang berbeda. Dari pengamatan karakteristik tersebut dirujuk di buku Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology Edisi Kesembilan(Holt et al., 1994).

Tabel 1. Karakteristik Morfologi Bakteri dari Udara Ruangan Laboratorium Kultur Jaringan Departemen Biologi FMIPA USU

Kode Isolat Titik Lokasi Morfologi koloni Pewarnaan Gram /

Penatan

Tepi Elevasi Warna

BU01 T1U1 Undulate Flat Putih susu + / Monobasil

BU02 T1U2 Entire Flat Kuning + / Monococcus

BU03 T2U1 Undulate Flat Putih susu + / Monococcus

BU04 T2U2 Entire Flat Kuning - / Monococcus

BU05 T3U1 Undulate Flat Putih susu + / Monococcus

BU06 T3U2 Entire Flat Kuning + / Streptococcus

BU07 T4U1 Entire Flat Kuning + / Monococcus

BU08 T4U2 Undulate Flat Putih susu - / Monococcus

BU09 T5U1 Entire Flat Kuning - / Streptococcus

BU10 T5U2 Undulate Flat Putih susu + / Monococcus

BU11 T5U2 Entire Flat Kuning + / Monococcus

Keterangan:

24

Tabel 2. Hasil Uji Biokimia Bakteri yang diisolasi dari udara di Ruangan Laboratorium Kultur Jaringan

Kode Isolat

Hidrolisa Pati

Hidrolisa Gelatin

Uji Sitrat

Uji Katalase

Uji Motilitas

Uji TSIA Pendugaan

Warna Keretakan media

Endapan hitam Slant Butt

BU01 + - - - Pedang Merah Kuning - - Bacillussp.

BU02 + - - - _{Pedang Merah Kuning} - + _{Staphylococcussp.}

BU03 + - - - Pedang Kuning Kuning - - Staphylococcussp.

BU04 - - - - Pedang Merah Kuning - + Escherichiasp.

BU05 + - - - _{Pedang Merah Kuning} - - _{Staphylococcussp.}

BU06 + - - + _{Pedang Merah Kuning} - - Streptococcussp.

BU07 + - - - Pedang Merah Kuning - + Staphylococcussp.

BU08 - - - - Pedang Merah Kuning - + Escherichiasp.

BU09 - - - + _Titik-

titik

Merah Merah - - _{Pseudomonassp.}

BU10 + - - - _{Pedang Merah Kuning} - - _{Staphylococcussp.}

BU11 + - - - _{Pedang Merah Kuning} - + _{Staphylococcussp.}

Keterangan:

Dari hasil identifikasi dengan karakterisasi (Tabel 1) dan uji biokimia sederhana (Tabel 2) dapat dilihat terdapat 11 isolat bakteri yang tumbuh setelah diisolasi dari 5 titik yang berbeda di Laboratorium Kultur Jaringan FMIPA USU Medan. Bakteri pengkontaminan ruangan termasuk dalam genus Bacillus, Staphylococcus, Streptococcus, Escherichiadan Pseudomonas.Genus

Staphylococcus paling dominan dijumpai sebanyak 6 isolat.Staphylococcus

merupakan flora normal pada kulit manusia.Staphylococcus memiliki ciri koloni

circulardan ada yang filamentous, tepi koloni entiredan undulate, elevasi koloni

flat dan berwarna kuning dan putih susu, bersifat Gram positif, berbentuk coccus

dengan penataan mono.Hasil uji biokimia sederhanamenunjukkan bahwa pada uji hidrolisa pati bersifat positif, uji hidrolisa gelatin bersifat negatif, uji sitrat bersifat negatif, uji katalase bersifat negatif, uji motilitas bersifat positif, uji TSIA tidak ada keretakan media, memiliki endapan hitam (Fe), dan perubahan warna dari

slant berwarna merah dan butt berwarna kuning yang artinya bakteri ini mampu memfermentasi satu gula (glukosa). Genus ini ditemukan pada kode isolat BU02, BU03, BU05, BU07, BU10 dan BU11.

Genus Bacillusmemiliki ciri tepi koloni undulate, elevasi koloni flat dan berwarna putih susu, bersifat Gram positif, berbentuk basil dengan penataan

mono. Hasil uji biokimia sederhanamenunjukkan bahwa pada ujihidrolisa pati bersifat positif, uji hidrolisa gelatin bersifat negatif, uji sitrat bersifat negatif, uji katalase bersifat positif, uji motilitas bersifat positif, uji TSIA tidak ada keretakan media, tidak memiliki endapan hitam (Fe), dan perubahan warna dari slant

berwarna merah dan butt berwarna kuning yang artinya bakteri ini mampu memfermentasi satu gula (glukosa). Genus ini ditemukan pada kode isolat BU01.

Genus Streptococcusmemiliki ciri-ciribentuk koloni circular, tepi koloni

entire, elevasi koloni flat dan berwarna kuning, bersifat Gram positif, berbentuk

coccus dengan penataan strepto. Hasil uji biokimia sederhana menunjukkan bahwa pada uji hidrolisa pati bersifat positif, uji hidrolisa gelatin bersifat negatif, uji sitrat bersifat negatif, uji katalase bersifat positif, uji motilitas bersifat positif, dan pada uji TSIA tidak ada keretakan media, tidak memiliki endapan hitam (Fe), dan perubahan warna dari slant berwarna merah dan butt berwarna kuning yang

26

artinya bakteri ini mampu memfermentasi satu gula (glukosa). Genus ini ditemukan pada kode isolat BU06.

Genus Escherichiamemiliki ciri-ciri bentuk koloni circular, tepi koloni

entire, elevasi koloni flat dan berwarna kuning, bersifat Gram negatif, berbentuk

coccus dengan penataan mono. Hasil uji biokimia sederhana menunjukkan bahwa pada uji hidrolisa pati bersifat negatif, uji hidrolisa gelatin bersifat negatif, uji sitrat bersifat negatif, uji katalase bersifat negatif, uji motilitas bersifat positif dan pada uji TSIA tidak ada keretakan media, memiliki endapan hitam (Fe), dan perubahan warna dari slant berwarna merah dan butt berwarna kuning yang artinya bakteri ini mampu memfermentasi satu gula (glukosa). Genus ini ditemukan pada kode isolat BU04 dan BU08.

Genus Pseudomonas memiliki ciri-ciribentuk koloni circular, tepi koloni

entire, elevasi koloni flat dan berwarna kuning, bersifat Gram negatif, berbentuk

coccus dengan penataan strepto. Hasil uji biokimia sederhana menunjukkan bahwa pada uji hidrolisa pati bersifat negatif, uji hidrolisa gelatin bersifat negatif, uji sitrat bersifat negatif, uji katalase bersifat negatif, uji motilitas bersifat positif dan pada ujia TSIA tidak ada keretakan media, tidak memiliki endapan hitam (Fe), dan perubahan warna dari slant berwarna merah dan butt berwarna merah yang artinya bakteri ini tidak mampu memfermentasi gula apapun. Genus ini ditemukan pada kode isolat BU09.

Leifert &Cassels(2001) melaporkan beberapa mikroorganisme pengkontaminasi udara pada suatu ruangan antara lainPseudomonasflourescens,

Erwiniasp., Agrobacterium spp., Bacillus spp. dan Staphylococcus spp..Bakteri patogen pada manusia seperti Eschericia coli dan Serratia marcescens juga mengkontaminasi udara ruangan yang disebarkan dari nafas, batuk dan bersin manusia.Tipe-tipe bakteri yang hidup di udara meliputi bakteri pembentuk spora maupun tidak pembentuk spora, basil Gram positif, coccus Gram positif dan basil Gram negatif.Sinta dkk. (2014) juga melaporkan bahwa hasil identifikasi kontaminan pada kultur yang diisolasi dari media NA terdapat 4 jenis bakteri yaitu Bacillus macerans, Bacillus megaterium, Bacillus sphaericus dan Bacillus firmus.

4.3. Karakteristik Bakteri yang diisolasi dari kontaminasi beberapa kultur di Laboratorium Kultur Jaringan Departemen Biologi FMIPA USU

Isolasi bakteri dari beberapa kultur yang terkontaminasi di Laboratorium Kultur Jaringan Departemen Biologi FMIPA USUdiperoleh 3 isolat. Beberapa kultur yang terkontaminasi seperti Ellais quinensis Jacq. danPhylanthus emblica

memiliki karakteristik morfologi (Tabel 3) dan uji biokimia sederhana (Tabel 4). Dari ketiga isolat bakteri pengkontaminasikultur merupakan bakteri Gram positif termasuk dalam genus Staphylococcus, Streptococcus dan Bacillus.

Tabel 3. Karakteristik Morfologi Isolat Bakteri yang berasal dari beberapa kultur yang terkontaminasi

Kode Isolat

Asal Eksplan Morfologi Koloni Sifat Gram /

penataan

Bentuk Tepi Elevasi Warna

BK01 Apical Bud

Ellais quinensis

jacq.

Filament Undulate Flat Cream + /

Monococcus

BK02 Biji Phyllanthus emblica L. (lendir kuning)

Irreguler Undulate Flat Kuning + / Monobasil

BK03 Biji Phyllanthus emblica L. (lendir putih)

Filament Undulate Flat Putih

susu

+ / Streptococcus

Tabel 4. Hasil Uji Biokimia Bakteri yang berasal dari beberapa kultur yang terkontaminasi Kode isolat Uji Biokimia P enduga an U ji p ati U ji s itr at H id ro lis a g ela tin M o tilita s K at al as e Uji TSIA Warna K er et ak an m ed ia E nda pa n h ita m

Slant Butt

BK01 - + - + + Merah Kuning + - Staphylococcus

BK02 - + - + + Merah Kuning + - Bacillus

BK03 + - - + + Kuning Kuning + - Streptococcus

Keterangan:

28

Dari Tabel 3 dan Tabel4 dapat dilihat bahwa ditemukan 3 genus bakteri (Bacillus, Staphylococcus dan Streptococcus) dari 2 kultur tanaman berbeda yakni apical budEllais quinensis Jacq. (BK01) dan eksplan biji dari Phyllanthus emblica

(BK02 dan BK03).Dari hasil penelitian menunjukkan bahwa genus bakteri yang diisolasi dari udara sama dengan yang diisolasi dari ruangan Laboratorium Kultur Jaringan Departemen Biologi FMIPA USU. Dapat diasumsikan bahwa kontaminasi berasal dari udara yang bersih. Hal ini perlu diperhatikan dengan kondisi ruangan agar lebih bersih, setiap pengunjung yang keluar masuk diharapkan menggunakan masker, jas laboratorium yang bersih setiap hari,membersihkan ruangan dengan menyapu, sterilisasi ruangan dengan alkohol 70% setiaphari dan fumigasi dengan formalin 4% per minggudi Laboratorium Kultur Jaringan Departemen Biologi FMIPA USU.

Putri (2009) melaporkan pada kultur ulin (Eusidoroxylon zwageri) dikontaminasi oleh bakteri Streptococcus lactis dan Enterobacter aerogenes.Kontaminasi ulin (Eusidoroxylon zwageri) in viro dapat terjadi walaupun sudah melalui sterilisasi permukaan eksplan karena beberapa bakteri dapat hidup di dalam jaringan tanaman dan spora bakteri hidup di permukaan eksplan setelah disterilisasi.Bakteri menghasilkan glycocalix lapisan kapsul atau lender yang menyelimuti sel sebagai pertahanan dari serangan senyawa antimikroba yang dipergunakan untuk sterilisasi permukaan eksplan.Pengujian sterilisasi permukaan glycocalixyang dilakukan oleh Putri (2009) dengan senyawa antimikroba fungisida, detergen, alcohol, HgCl2 dan Na2ClO3.Semakin lama

waktu pengujian sterilisasi ketebalan koloni semakin menurun.

Rohman (2011) melaporkan bahwa mikroorganisme yang paling banyak ditemukan di udara yaituBacillus dan Clostridium, Micrococcus, dan

Corynebacterium.Debu dalam udara juga bisa membawa agen penyakit dari seseorang yang sedang menderita penyakit menular seperti bakteri Tuberculosis sp., Streptococcus sp., Pneumococcus sp., dan Staphylococcus sp. Bakteri ini tersebar di udara melalui batuk, bersin, berbicara, dan tertawa. Diperkirakan bahwa jumlah bakteri dalam satu kali bersin berkisar antara 10.000 sampai 100.000.

4.4. Karakteristik Jamur yang diisolasi dari Udara di Laboratorium Kultur Jaringan Departemen Biolgi FMIPA USU

Isolasi jamur yang berasal dari udara ruangan di Laboratorium Kultur Jaringan Departemen Biologi FMIPA USU diperoleh 11 koloni jamur.Karakterisasi jamur dengan pengamatan makroskopis dan pewarnaaan LPCB (Tabel 5). Dari ke 11 koloni isolat jamur tersebut diperoleh Penicilliumsp. sebanyak 2 isolat, Fusarium

sp. sebanyak 3 isolat, Aspergillussp. sebanyak 1 isolat, Mucorsp. sebanyak 4 isolat, dan Neurosporasp. sebanyak 1 isolat.

Tabel 5. Hasil Karakteristik Isolat Jamur dari Udara di Laboratorium Kultur Jaringan Kode Isolat Gambaran Makroskopis Gambaran Mikroskopis (Perbesaran 1000x) Ciri-ciri P endug a a n JU01

Warna Koloni : hijau tua Warna Tepi : putih Warna Miselium : putih Bentuk Konidia : bulat Hifa : aseptum Tekstur : pasir

P en cilliu m sp .

JU02 Warna Koloni : Putih

Warna Tepi : Putih Warna Miselium : Putih Bentuk Konidia :Lunata Tekstur : kapas

F us ar ium sp . JU03

Warna Koloni : putih Warna Tepi : putih Warna Miselium : putih Bentuk Konidia : lunata Tekstur : kapas

F us ar ium sp .

30

JU04

Warna Koloni : hijau tua Warna Tepi : putih Warna Miselium : putih Bentuk Konidia : bulat Hifa : aseptum Tekstur : pasir _Penic

illiu

m

sp

.

JU05

Warna Koloni : putih Warna Tepi : putih Warna Miselium : putih Bentuk Konidia : lunata Tekstur : kapas

F us ar ium sp . JU06

Warna Koloni : hijau Warna Tepi : putih Warna Miselium : cokelat Bentuk Konidia : bulat Hifa : septum

Tekstur : beludru _Asp

erg il lu s sp . JU07

Warna Koloni : hijau Warna Tepi : putih Warna Miselium : cokelat Bentuk Konidia : Bulat Hifa : aseptum

Tekstur : beludru M

uc

or

sp

.

JU08

Warna Koloni : hijau Warna Tepi : putih Warna Miselium : cokelat Bentuk Konidia : bulat Tekstur : beludru

M

uc

or

sp

.

JU09 Warna Koloni : hitam

Warna Tepi : putih Warna Miselium : cokelat Bentuk Konidia : Bulat Hifa : aseptum tekstur : beludru _Muc

or

sp

JU10

Warna Koloni : cokelat Warna Tepi : putih Warna Miselium : cokelat Bentuk Konidia : Bulat Hifa : aseptum Tekstur : beludru M

uc

or

sp

.

JU11

Warna Koloni : oranye Warna Tepi : putih Warna Miselium : putih Bentuk Konidia : kotak Tekstur : kapas

Ne u ro sp o ra sp .

Dari hasil karakterisasi yang telah dilakukan (Tabel 5) genus Mucorsp.yang paling dominan ditemukan yakni sebanyak 4 koloni yang terdiri dari JU07, JU08, JU09 dan JU10 yang diisolasi dari T4 dan T5 (ruang inkubasi dengan kondisi AC dimatikan). Keempat koloni tersebut memiliki ciri koloni hijau dan hijau kehitaman.Genus Penicilliumsp.dengan kode JU01 dan JU04 sebanyak 2 koloni yang diisolasi pada titik lokasi T1 (dekat meja area Laboratorium Fisiologi Tumbuhan) dan lokasi T4 (di Laminar Air Flow Cabinet dengan kondisi lampu UV dimatikan) dengan ciri-ciri makroskopis koloni berwarna hijau dan hijau tua.Genus Fusarium sp.dengan kode JU02 pada titik T2 (dekat meja area kamar mandi LaboratoriumFisiologi Tumbuhan) dengan ciri makroskopis koloni berwarna putih, sedangkan JU03dan JU05, keduanya diisolasi pada titik T3 (di ruang tanam dekat rak penyimpanan alat gelas kaca) dengan ciri koloni berwarna putih.Genus Aspergillussp.ditemukan hanya sebanyak 1 koloni yakni pada JU06 yang diisolasi pada titik T4 (Laminar Air Flow Cabinet) dengan ciri koloni berwarna hifa cokelat.Genus Neurosporasp. hanya terdapat pada koloni JU11 yang diisolasi pada titik T5 (ruang inkubasi) dengan ciri koloni hifa orange.

32

Genus kelompok jamur yang ditemukan pada saat diisolasi di udara dan kontaminasi kultur hampir sama sehingga diasumsikan bahwa kontaminasi yang terjadi di Laboratorium Kultur Jaringan Departemen Biologi FMIPA USU berasal dari udara. Susilowati & Listyawati (2001) juga telah melakukan penelitian keanekaragaman mikroorganisme pengkontaminan diSub-lab Biologi, Laboratorium MIPA Pusat UNS. Kultur murni in vitro cendawan perusak kayu

Coriolus versicolor dan Schizophyllumcommune merupakan koleksi Laboratorium Jurusan Biologi FMIPA UNS yang disimpan diSub-lab Biologi, Laboratorium MIPA Pusat UNS. Semua kegiatan dilakukan dalam Laminar Air Flow Cabinet

yang telah disterilisasi denganpenyemprotan alkohol 70% dan penyinaran lampu UV selama 1-2 jam.Namun ternyata masih terjadi kontaminasi setelah masa inkubasi 3 hari.Mikroorganisme kontaminanberasal dari enam genus, yakni cendawan Mucor, Rhizopus, Aspergillus, Cladosporium,Dictyostelium dan golongan Saccharomyces.

Waluyo (2005) mengatakan bahwa golongan jamur dominan yang bisa didapati dalam suatu ruang adalah dari genus Trichosporon, Monieliella, Trichoderma dan Aspergillus, sedangkan golongan bakteri dominan adalah dari genus Pseudomonas dan Bacillus.Leifert & Cassels (2001) melaporkan bahwa

Fusarium merupakan jamur yang paling banyak mengkontaminasi udara. Candida albicans dan Trichophyton spp.yang berasal dari manusia juga bisa mengkontaminasi udara pada ruangan yang tumbuh pada media kultur.Rohman (2011) melaporkan kelompok mikroorganisme yang paling banyak ditemukan tidak diharapkan kehadirannya melalui udara, umumnya disebut kontaminan. Adapun kelompok jamur yang termasuk dalam jamur kontaminan antara lain adalah Aspergillus, Mucor, Rhizopus,Penicillium, dan Trichoderma. Mikroorganisme di udara yang paling banyak ditemukan yaitu spora jamur, terutama Alternaria, Penicillium,danAspergillus.Sinta dkk.(2014) melaporkan

Mucor yang mendominasi terjadi kontaminan udara adalah dari Mucor spp. dan

4.5. Karakteristik Jamur yang diisolasi dari Kontaminasi beberapa kultur di Laboratorium Kultur Jaringan Departemen Biologi FMIPA USU

Isolasi jamur yang berasal dari kontaminasi beberapa kulturdi Laboratorium Kultur Jaringan Departemen Biologi FMIPA USU diperoleh 5 isolat. Beberapa kontaminasi kultur berasal dari Ellais quinensisJacq.,Phylanthus emblica dan

Phyrus mallus. Kelima isolat jamur tersebut setelah dikarakterisasi dengan pengamatan makroskopis dan pewarnaan LPCB (Tabel 6) antara lain Fusariumsp. sebanyak 2 isolat, Penicilliumsp. sebanyak 1 isolat, Aspergillussp. sebanyak 1 isolat dan Mucor sp.sebanyak 1 isolat.

Tabel 6. Hasil Karakteristik Isolat Jamur dari Kultur yang terkontaminasi

Asal eksplan

Penampakan Makroskopis Penampakan Mikroskopis (perbesaran 1000 x)

Ciri-ciri P enduga an Daun Phyrus mallus

Warna Koloni : hijau tua Warna Tepi : putih Warna Miselium : putih Bentuk Konidia : bulat Tekstur : pasir

P en ic illiu m sp . Daun Phyrus mallus

Warna Koloni : putih Warna Tepi : putih Warna Miselium : putih Bentuk Konidia : lunata Tekstur : kapas

F us ar ium sp . Bunga Betina Ellais quinens is jacq.

Warna Koloni : cokelat Warna Tepi : putih Warna Miselium : cokelat Bentuk Konidia : Bulat Hifa : aseptum Tekstur : beludru Muc

or

sp

34

Apical Bud

Ellais quinens is jacq.

Warna Koloni : Putih Warna Tepi : Putih Warna Miselium : Putih Bentuk Konidia : Lunata Tekstur : kapas

F

us

ar

ium

sp

.

Biji

Phyllan thus emblica

L.

Warna Koloni :Hijau kecokelatan

Warna Tepi : Hijau Warna Miselium : Hijau Konidia : Bulat Tekstur : Beludru

A

sp

er

g

illu

s

sp

Dari Tabel 6 dapat dilihat bahwaFusariumsp. ditemukan paling banyak muncul sebagai kontaminan.Genus Fusariumsp.ditemukan pada kultur daun Phyrus mallus dengan koloni berwarna putih ketika ditumbuhkan di media PDA dan kultur apical budEllais quinensis jacq. dengankoloni berwarna putih. Genus

Penicilliumsp. ditemukan pada kultur daun Phyrus mallus yang berkoloni hijau ketika ditumbuhkan di media PDA. Genus Mucorsp. ditemukan pada kultur bunga betina Ellais quinensis jacq.sedangkan untuk genus Aspergillussp. ditemukan pada kultur biji Phyllanthus emblica dengan koloni berwarna hijau ketika ditumbuhkan dimedia PDA. Kultur ini kemudian dilakukan pengamatan makroskopis jamur dan mikroskopis dengan melakukan proses pewarnaan LPCB (Lactophenol Cotton Blue).

Menurut Winarti dkk. (2009) melaporkan dalam penelitiannya bahwa hasil identifikasi kapang, pada Phyrus mallus didapatkan kapang Penicillium sp.,

Aspergillus sp. dan Fusarium sp, sedangkan pada Apel Fuji ditemukan

Penicillium sp., dan Aspergillus sp.Hasil identifikasi jenis kapang yang terdapat dalam buah apel segar dari varietas berbeda terlihat bahwa dalam buah apel tersebut teridentikasi kapang-kapang penghasil patulin. Patulin merupakan racun metabolit yang diproduksi oleh beberapa spesies Penicillium, Aspergillus dan

Byssochlamys. Patulin dihasilkan oleh sekitar 60 spesies dari 30 genus jamur. Kapang penghasil patulin yang utama adalah Penicillium expansum. Infeksi P. expansum terutama disebabkan luka akibat serangga dan pengangkutan, yang menyebabkan masuknya kapang melalui sistem vaskuler dan lentisel.

Omamor et al., (2007) melaporkan bahwa beberapa jamur yang mengkontaminasi pada kultur Ellais guinensiss Jacq.yakni sebanyak 25 spesies jamur. Namun yang telah diidentifikasi hanya sebanyak 14 spesies yang berasal dari kultur Ellais guinensiss Jacq.yang diambil dari beberapa bagian (eksplan, kalus/embrio, dan plantlet). Beberapa spesies tersebut yakni Penicillium

sp.(40,8%), Curvularia sp. (14,5%), Cladosproium sp. (13,4%), Aspergillus sp. (10,1%), Acremonium sp.,Fusarium sp., Alternaria spp. (4,5%), Rhizopus (3,4%),

Trichoderma, Pestalotica dan Helminthosporium spp (1,1%). Paecilomyces,

Dreschlera dan Phytium spp. merupakan jamur dengan jumlah paling sedikit(0,6%).

36

4.6. Hasil Perhitungan Total Bakteri Setelah Perlakuan Fumigasi Menggunakan Formalin 4%

Metode yang digunakan adalah metode drop (presipitasi). Hasil yang diperoleh setelah dilakukan fumigasi di Laboratorium Kultur Jaringan FMIPA USU bahwa penggunaan formalin 4% dari ke semua titik lokasi yang telah dihitung sebelum dan sesudah fumigasi, pengaruh formalin 4% mampu menurunkan bakteri sebanyak 50% pada hari pertama. Pada hari selanjutnya efisiensi menurun dan jumlah bakteri mendekati jumlah bakteri sebelum difumigasi pada setiap akhir pengamatan (hari kelima setelah difumigasi). Hal ini bisa dilihat dari grafik rata-rata pertumbuhan mikroorganisme per minggu.Pada minggu ke 1 rata-rata-rata-rata jumlah bakteri dari lima titik pengambilan sampel sebelum fumigasi pertumbuhan mikroba sebanyak 64,8 cfu dan menurun menjadi 30,4 cfu. Selanjutnya beberapa hari kemudian menurun efisiensi fumigasi dan pada hari kelimasetelah fumigasi mendekati jumlah bakteri sebelum difumigasi sebanyak 59,4 cfu. Terjadinya peningkatan TPC bakteri dari hari ke hari setelah fumigasi menunjukkan bahwa fumigasi merupakan perlakuan yang sangat penting dilakukan di Laboratorium Kultur Jaringan untuk mencegah terjadinya kontaminasi kultur. Intensitas masuk keluarnya pengunjung dan mahasiswa yang ada di Laboratorium Kultur Jaringan dengan jumlah rata-rata 5-10 orang per hari yang memicu terbawanya mikroorganisme kedalam ruangan Laboratorium Kultur Jaringan yang seharusnya steril.Hal ini juga didukung dengan data faktor fisikdi Laboratorium Kultur Jaringan Departemen Biologi FMIPA USU (Lampiran 4 hlm. 47).

Barbosa et al., (2005) melaporkan pada metode drop yang dilakukan untuk perhitungan mikroba yang tumbuh setelah fumigasi di Laboratorium Mikrobiologi Universitas Sau Paulo Brazil adalah 20-100 cfu per drop. Sedangkan data pada batasan cemaran mikroba 15 koloni E. coli per drop.Formalin telah digunakan untuk pengujian terhadap proses dekontaminasi secara biologis. Formalin merupakan turunan dari senyawa formaldehid.Brasswell et al., (1970) mengatakan bahwa formalin merupakan cairan yang jika disemprotkan dapat menyebar di udaradan bersifat desinfektan. Konsentrasi formalin yang digunakan juga mempengaruhi efisiensi fumigasi yang dilakukan. Formalin yang digunakan sebagai bahan desinfektan di udara yakni dengan kisaran 4-5 %.

A B

C D

E F

Gambar 1. Grafik Rata-Rata Pertumbuhan Mikroba (Bakteri) Selama Fumigasi 0 10 20 30 40 50 60 70

1 2 3 4 5 6

R at a-rat a Ju m lah M ik ro b a ( cf u )

Hari ke- setelah fumigasi Rata-rata Pertumbuhan Mikroorganisme Minggu ke 1

0 10 20 30 40 50 60 70

1 2 3 4 5 6

R at a-rat a Ju m lah M ik ro b a ( cf u )

Hari ke- setelah fumigasi Rata-rata Pertumbuhan Mikroorganisme Minggu ke 2

0 10 20 30 40 50 60 70

1 2 3 4 5 6

R at a-rat a Ju m lah M ik ro b a ( cf u )

Hari ke- setelah fumigasi Rata-rata Pertumbuhan Mikroorganisme Minggu ke 3

0 10 20 30 40 50 60 70

1 2 3 4 5 6

R at a-rat a Ju m lah M ik ro b a ( cf u )

Hari ke- setelah fumigasi Rata-rata Pertumbuhan Mikroorganisme

Minggu ke 4

0 10 20 30 40 50 60 70

1 2 3 4 5 6

R at a-rat a Ju m lah M ik ro b a ( cf u )

Hari ke- setelah fumigasi Rata-rata Pertumbuhan Mikroorganisme Minggu ke 5

0 10 20 30 40 50 60 70

1 2 3 4 5 6

R at a-rat a Ju m lah M ik ro b a ( cf u )

Hari ke- setelah fumigasi Rata-rata Pertumbuhan Mikroorganisme

38

BAB 5

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1. Kesimpulan

Dari hasil penelitian yang dilakukan dapat disimpulkan bahwa:

a. Mikroorganismeyang ditemukan di Laboratorium Kultur Jaringan Departemen Biologi FMIPA USU Medan baik yang diisolasi dari ruangan dan kontaminasi kultur menunjukkan jenis bakteri dan jamur yang sama. Genus bakteri yang ditemukan adalahBacillussp., Streptococcussp., Pseudomonassp., Escherichiasp. dan yang mendominasi adalah

Staphylococcussp..Sedangkan golongan jamur adalahAspergillussp., Neurosporasp., Fusariumsp., Penicilliumsp. dan yang mendominasi adalah

Mucorsp..Sehingga dapat diasumsikan kontaminasi yang terjadi berasal dari udara yang tidak bersih.

b. Efisiensi fumigasi dengan menggunakan formalin 4% mampu menurunkan sebanyak 50% untuk bakteri pada hari pertama setelah fumigasi dan menurun efisiensinya mendekati jumlah bakteri sebelum difumigasi pada setiap akhir pengamatan (hari kelima setelah fumigasi).

5.2. Saran

a. Metode pengambilan sampel mikroorganisme udara perlu dilakukan pembandingan dengan menggunakan metode aktif yaitu menggunakan air sampler untuk mendapatkan perhitungan mikroorganisme aerosol yang lebih representatif.

b. Perlu dilakukan identifikasi bakteri dengan teknik molekuler untuk mengkonfirmasi metode uji fisiologi dan mengetahui spesies dari golongan bakteri dan jamur yang mengkontaminasi kultur di Laboratorium Kultur Jaringan FMIPA USU.

2.1.Mikroorganisme Udara (Bioaerosol)

Bioaerosol merupakan materi partikulat bakteri yang berasal dari hewan ataupun tanaman, baik yang bersifat patogenik maupun non patogenikyang tersuspensi di udara memiliki kisaran ukuran sebesar 0,5-30 µm. Komponen penyusun udara meliputi bakteri, air, polen, debu, senyawa organik maupun senyawa anorganik. Mikroorganisme yang paling banyak memenuhi komponen udara bebas adalah bakteri, jamur dan mikro alga, dalam bentuk vegetatif atau generatif, umumnya berbentuk spora. Udara bukan merupakan medium tempat bakteri tumbuh, tetapi merupakan pembawa bahan partikulat, debu, tetesan air yang semua dapat sebagai tempat tumbuh bakteri. Kandungan udara dalam ruangan akan berbeda dengan luar ruangan. Bakteri dalam ruangan dipengaruhi oleh laju ventilasi, padatnya orang, taraf kegiatan orang yang menempati ruangan tersebut. Flora bakteri yang terdapat di udara bersifat sementara dan beragam (Waluyo, 2005).

Bakteri dapat tersuspensikan sementara dalam bahan partikulat atau terbawa oleh partikel debu dan tetesan cairan baik yang berukuran besar ataupun kecil. Jumlah dan tipe bakteri yang mengkontaminsai udara ditentukan oleh sumber kontaminan, misalnya dari orang yang batuk atau bersin. Organisme yang terbawa oleh udara dapat terangkut sejauh beberapa meter atau beberapa kilometer, ada sebagian yang mati dalam hitungan detik sedangkan yang lain dapat bertahan hidup lama. Ketahanan hidup yang berbeda-beda dari suatu bakteri di udara ditentukan oleh keadaan lingkungan seperti keadaan atmosfer, kelembaban, cahaya, suhu, ukuran partikel pembawa mikroorganisme tersebut serta ciri-ciri mikroorganisme itu sendiri terutama ketahanan terhadap keadaan fisik di atmosfer. Beberapa metode penangkapan bakteri udara antara lain dengan cara sedimentasi dan alat penangkap udara (air sampler). Ada banyak faktor yang mempengaruhi biaoaerosol yang menentukan seberapa baik bagi kesehatan manusia. Faktor-faktor tersebut meliputi kehadiran dan efisiensi dari alat penyaring udara, desain dan operasi sistem sirkulasi udara, kesehatan dan

6

kehigenisan dari penghuni ruangan, komponen udara yang bersih sekitar bangunan, tipe pencahayaan, temperatur, dan kelembapan udara relatif (Pelczar, 1988).

Komponen-komponen penyusun bioaerosol diantaranya ialah jamur, virus dan bakteri. Udara tidak mempunyai flora alami, mikroorganisme tersebut hanya tinggal sementara mengapung di udara dan terbawa bersama dengan debu. Jumlah dan macam mikroorganisme dalam suatu volume udara bervariasi sesuai dengan lokasi, kondisi dan jumlah orang yang ada. Tipe-tipe bakteri yang hidup di udara meliputi bakteri pembentuk spora dan bukan pembentuk spora, basil Gram positif,

coccus Gram positif dan basil Gram negatif. Golongan jamur dominan yang bisa didapati dalam suatu ruang adalah dari genus Trichosporon, Monieliella, Trichoderma dan Aspergillus, sedangkan golongan bakteri dominan adalah dari genus Pseudomonas dan Bacillus (Waluyo, 2005).

2.1.1. Mikroorganisme pengkontaminasi kultur

Kontaminasi mikroba muncul pada saat proses inisiasi dan pemeliharaan kultur secara in vitro. Kontaminasi ini biasanya bersifat patogen. Pada umumnya, kontaminasi berasal dari jamur dan bakteri yang berasal dari permukaan eksplan itu sendiri. Kontaminasi dapat diidentifikasi dengan pengamatan dibawah mikroskop. Kontaminasi eksplan yang muncul tergantung pada spesies tanaman, usia tanaman, sumber eksplan dan kondisi cuaca. Oleh karena itu, waktu yang baik dan pencegahan seleksi harus dilakukan,karena untuk menghilangkan kontaminasi kultur secara in vitrosangat sulit (Mwirigi et al., 2010).

Pada penelitian kultur Lilium candidum L.juga rentan terkontaminasi jamur.Jamur pengkontaminasi tersebut diidentifikasi yakni menurut morfologi, dan karakteristik kultur selama proses pengkulturan. Beberapa spesies tersebut antara lain Fusarium, Pencillium, Alternaria, Rhizopus, Cylindrocarpon dan

Aspergillus. Metode yang dilakukan untuk menghilangkan jamur pengkontaminan dengan menggunakan senyawa kimia dan antibiotik seperti Benomyl, Nystatin, Streptomisin, dan Penisilin dengan kombinasi yang berbeda yang diaplikasikan selama 30 menit dan dikultur di media MS dengan supplement

kontaminasi jamur tersebut diamati dengan pengujian penuh. Pengujian yang paling efektif yang diserang oleh kontaminasi jamur tersebut dengan menggunakan Benomyl (100mg/dm3) + Nystatin (100mg/dm3) merupakan kombinasi pencegahan yang baik (Altan et. al., 2010).

Omamor et al., (2007) melaporkan bahwa kontaminasi jamur dapat mempengaruhi senyawa-senyawa yang dihasilkan oleh tanaman secara endogen dan kondisi udara di laboratorium. Beberapa jamur yang mengkontaminasi pada kulturEllais guinensiss Jacq.yakni sebanyak 25 spesies jamur. Namun yang telah diidentifikasi hanya sebanyak 14 genera yang berasal dari kultur Ellais guinensiss

Jacq.yang diambil dari beberapa bagian (eksplan, kalus/embrio, dan planlet). Beberapa genera tersebut yakni Penicillium sp.(40,8%), Curvularia sp. (14,5%),

Cladosproium sp. (13,4%), Aspergillus sp. (10,1%), Acremonium sp.,Fusarium

sp., Alternaria spp. (4,5%), Rhizopus (3,4%), Trichoderma,Pestalotica dan

Helminthosporium spp (1,1%). Sedangkan Paecilomyces, Dreschlera dan Phytium

spp. merupakan jamur dengan jumlah paling sedikit (0,6%).

Kontaminasi kultur Ipomea batatas L.disebabkan oleh mikroorganisme endogen. Mikroorganisme endogen kebanyakantermasuk ke dalam golongan bakteri dan jamur. Dari hasil pengamatan diperoleh bahwa ada 3 jenis bakteri dan 3 jenis jamur yang telah diisolasi dari kulturIpomea batatas L. yangterkontaminasi. Dari golongan bakteri terdapat 1 bakteri Gram positif yakni

Corynebacteriumberbentuk batang dan 2 bakteri Gram negatif yakni Klebsiella

sp. dan Pseudomonas sp. Ketiga jenis bakteri tersebut sensitif terhadapantibiotik Gentamisin, Tetrasiklin dan Ampisilin (Jena & Samal, 2011).Pada koleksi plasma nutfah Ipomea batatas L. jugaberesiko terkontaminasi bakteri endofit. Kontaminasi ini muncul karena sterilisasi yang tidak benar pada saat ingin menanam eksplan ke dalam media kultur. Kontaminasi bakteri endofittidak dapat dihilangkan dengan teknik sterilisasi pemukaan saja, tetapi denganmenggunakan antibiotik yang ditambahkan kedalam media (Mbah & Wakil, 2012).

8

Kontaminasi bakteri sulit dideteksi karena kebanyakan kontaminasi berasal dari jaringan eksplan itu sendiri dantidak memiliki simptom. Kontaminasi menyebabkan multiplikasitanamanlambat, perakaran yang tidak baik (akar membusuk), dandapat menyebabkan tanaman mati. Sumber kontaminasi pada kultur biasanya sulit ditentukan. Bakteri yang mengkontaminasi kultur tanaman berasal dari eksplan, lingkungan laboratorium, operator, dan teknik sterilisasi yang tidak efektif. Bakteri yang mampu berasosiasi dengan tanaman disebut bakteri endofit. Mikroorganisme endofit sulit untuk didesinfeksi dengan cepat karena proses penyebaran dan pertumbuhan mikroorganisme endofit seiring dengan pertumbuhan tanaman itu sendiri (Reed & Tanprasert, 1995).

Kontaminasi yang disebabkan oleh bakteri dapat menyebabkankondisi kultur berubah seperti berair dan berlendir. Pada penelitian kultur Pelargonium sp. terdapat bakteri pengkontaminasi seperti Paenibacillus glycamilyticus dan

Lactobacillus paracasei.Hasil identifikasi bakteri ini dengan menggunakan identifikasi bakteri 16S RNA dengan analisis sequencing. Kedua bakteri tersebut diketahui telah berasosiasi dengan tanaman,tetapikehadiran bakteri tersebut di dalam kulturPelargonium sp. tidak dibutuhkan.Kedua bakteri tersebut merupakan bakteri Gram positif. Paenibacillus glycanilyticus mampu mendegradasi heteropolisakarida yang dihasilkan oleh CyanobacteriumNostoc commune. SedangkanLactobacillus paracasei biasanya sebagai kontaminan pada kultur yang berasal dari spesies tanaman yang berbeda. Kultur dapat terkontaminasi pada setiap tahap selama proses pengkulturan. Bakteri yang sulit dikontrol adalah bakteri endogen yang tidak menimbulkan simptom yang dapat dilihat mata di dalam kultur jaringan yang terkontaminasi. Kultur terkontaminasi oleh bakteri karena kurang aseptis ketika melakukan pengkulturan. Selama proses mikropopagasi, kontaminasi bakteri dapat bertahan hidup karena tingginya konsentrasi garam dan sukrosa pada media kultur, pH dan temperatur yang optimal untuk pertumbuhan bakteri(Wojtania et al., 2005).

Kultur yang dikontaminasi oleh mikroorganisme khususnya bakteri telah menjadi masalah serius. Para ilmuwan juga berusaha untuk menghilangkan kontaminasi bakteri dengan berbagai pencegahan seperti manipulasi vigorous dan penggunaan antibiotik.Kolonisasi mikroba endofit pada tanaman berkembang di

stomata dan perakaran. Keduanya merupakan bakteri patogen dan saprofit yang diisolasi dari tanaman. Bakteri tersebut antara laingenera Xanthomonas, Corynebacterium, Erwinia, Bacillus, Pseudomonas, Micrococcus, Agrobacterium, Arthrobacter dan Enterobacter (Buckley et al., 1995).

Mbah & Wakil (2012) melaporkan pada penelitian kultur Ipomea batatas

L. juga mengalami kontaminasi. Genotip yang berbeda (TDr 95/19172 dan TDr 95/00929) dari D. rotundata yang dikontaminasi oleh Burkholderia sp.,

Luteibacter rhizovicinus dan Bacillus cereus yang diidentifikasi dengan CABI (Commonwealth Agriculture Bureax) yang digunakan pada penelitian ini. Bakteri

Burkholderia sp. merupakan bakteri Gram negatif yang bersifat motil, berbentuk batang, dan obligat aerob sama seperti Luteibacter rhizovicinus. Berbeda dengan

Bacillus cereus yang merupakan bakteri Gram positif, berspora, berbentuk batang dan bersifat aerob. Kandungan pada media antara lain MS (4,43 g/L), myo-inositol (100mg/L), L-cysteine (20mg/L), dan agar (7,5g/L).

2.2. Faktor yang mempengaruhi keberhasilan Kultur Jaringan 2.2.1. Eksplan

Kultur jaringan merupakan manipulasi pertumbuhan pada tumbuhan dalam kondisi yang terkontrol dengan baik dan auksin serta sitokinin berperan penting dalam manipulasi ini. Kebanyakan eksplan menghasilkan sejumlah auksin dan sitokinin secara endogenous. Dalam kultur jaringan, zat pengatur tumbuh secara

exogenous diberikan untuk memperoleh efek pertumbuhan. Auksin dan sitokinin atau keduanya ditambahkan di dalam kultur jaringan untuk memperoleh respon pertumbuhan (Subarnas, 2011).

Keberhasilan morfogenesis suatu budidaya jaringan salah satunya ditentukan oleh eksplan. Eksplan adalah bagian dari tanaman yang digunakan sebagai bahan untuk memulai proses pengkulturan. Untuk semua teknik kultur jaringan, semua bagian tanaman yang dapat diperoleh dan bebas terdeteksi mikroorganisme dapat dicoba menjadi eksplan, walaupun demikian tidak semua jaringan tanaman mudah untuk ditumbuhkan. Seleksi bahan eksplan yang cocok merupakan faktor yang penting yang dapat menentukan keberhasilan program kultur jaringan.Tiga aspek utama yang harus diperhatikan dalam seleksi bahan eksplan yaitu genotip, umur dan kondisi fisiologis (Zulkarnain, 2009).

10

Genotip suatu eksplan jika memungkinkan digunakan bahan tanaman induk yang memiliki kisaran genetik berbeda. Kondisi tumbuhan, eksplan yang sehat dan vigorous kemungkinan besar akan menghasilkan kultur yang baik dan berhasil. Ukuran tumbuhan, semakin kecil eksplan semakin kecil kemungkinan menularkan penyakit endogen dan menyebabkan variasi akibat adanya kimera. Sebaliknya eksplan yang lebih kecil lebih mudah rusak pada saat dilakukan sterilisasi dan lebih rentan terhadap kegagalan pada saat induksi kultur awal (Subarnas, 2011).

Eksplan yang dipilih akan disterilisasi permukaannya dengan berbagai bahan sterilisasi. Tipe dan konsentrasi sterilisasi serta waktu yang digunakan ditentukan berdasarkan pengalaman dan pengamatan. Bahan sterilisasi yang digunakan untuk sterilisasi permukaan misalnya sodium hipoklorit, hidrogen peroksida, bromin, dan perak nitrat. Pada sterilisasi permukaan dibasahi dengan larutan sterilisasi. Penggunaan alkohol 70% dan penambahan detergen dan tween 20 sebanyak 1-2 tetes bertujuan supaya tegangan permukaaan bahan desinfektan dapat menyentuh lekukan-lekukan kecil atau rongga kecil seperti celah diantara bulu-bulu halus yang ada di eksplan sehingga eksplan benar-benar steril. Hal ini dapat lebih mengefektifkan sterilisasi (Zulkarnain, 2009).

2.2.2. Media

Keberhasilan dalam penggunaan metode kultur jaringan sangat tergantung pada media yang digunakan. Unsur-unsur yang penting dalam media tersebut adalah garam-garam anorganik, vitamin, zat pengatur tumbuh, sumber energi dan karbon. Media yang digunakan untuk kultur jaringan sangat banyak jenisnya seperti yang telah dilaporkan. Masing-masing jenis media memiliki respons yang berbeda untuk jenis dan tipe kultur yang digunakan bahkan jenis eksplan yang berbeda pula. Media yang digunakan pada kultur jaringan hampir sama semua dilakukan pada media semi solid dengan menggunakan agar atau gel. Gel ini menjadi pendukung fisik untuk eksplan dan dapat meningkatkan aerasi pada media. Gel ini membuat pengamatan kontaminan atau perkembangan akar menjadi lebih mudah. Gel memiliki kondisi fisik dan kimia yang sedikit berbeda sehingga memerlukan sedikit modifikasi pada persiapan media (Subarnas, 2011).

Kebutuhan nutrisi untuk pertumbuhan kultur in vitro yang optimal bervariasi antarspesies ataupun antarvarietas. Bahkan, jaringan yang berasal dari bagian tanaman yang berbeda pun akan berbeda pula dengan kebutuhan nutrisinya. Medium dasar Murashige dan Skoog muncul pada tahun 1962 adalah media yang paling luas penggunaannya dibandingkan dengan media dasar lainnyaterutama pada mikropopagasi tanaman dikotil dengan hasil yang sangat memuaskan. Hal itu dikarenakan media MS memiliki kandungan garam-garam yang lebih tinggi daripada media lain. Disamping itu media ini juga memiliki kandungan nitrat tinggi. Keasaman media adalah salahsatu yang mempengaruhi keberhasilan suatu kultur jaringan tanaman. Pada umumnya keasaman medium berkisar antara 5,6-5,8. Medium yang terlalu asam (pH<4,5) atau terlalu keras (pH>7,0) dapat menghambat pertumbuhan dan perkembangan eksplan. Hal ini mungkin disebabkan oleh tidak tersedianya sejumlah unsur hara pada kisaran pH tertentu. Pada pH tinggi unsur-unsur seperti besi, seng, mangan, tembaga, dan boron mengalami presipitasi (pengendapan) sebagai hidroksida sehingga tidak tersedia bagi jaringan yang dikulturkan. Sedangkan pada pH rendah, unsur-unsur seperti kalsium, magnesium, belerang, fosfor dan molibdat menjadi tidak tersedia. Tanaman seperti Rhododendion tumbuh dengan baik pada pH 4,5. Medium dengan pH yang rendah seringkali digunakan dalam seleksi untuk mendapatkan tanaman yang mampu toleran terhadap keasaman tinggi (Zulkarnain, 2009).

2.2.3. Zat Pengatur Tumbuh

Hormon adalah bahan perangsang tumbuh yang disintesis pada jaringan tumbuhan. Hormon diperlukan dalam konsentrasi yang rendah untuk mempengaruhi pertumbuhan dan perkembangan tumbuhan. Banyak molekul sintesis zat alami yang telah dikenal memiliki aktivitas serupa perangsang tumbuh. Senyawa sintesis perangsang tumbuh yang secara alami ada, dikenal dengan sebutan zat pengatur tumbuh (Subarnas, 2011).

Fitohormon adalah senyawa yang dihasilkan oleh tanaman tingkat tinggi secara endogen. Senyawa tersebut berperan merangsang dan meningkatkan pertumbuhan serta perkembangan sel, jaringan dan organ tanaman menuju arah differensiasi tertentu. Senyawa-senyawa lain yang memiliki karakteristik sama

12

dengan hormon namun diinduksi secara eksogen dikenal sebagai zat pengatur tumbuh. Didalam teknik kultur jaringan kehadiran zat pengatur tumbuh sangat berpengaruh. Beliau juga mengatakan bahwa sangat sulit untuk menerapkan teknik kultur jaringan pada upaya perbanyakan tanaman tanpa melibatkan adanya zat pengatur tumbuh (Zulkarnain, 2009).

2.3. Desinfeksi

Desinfeksi merupakan suatu proses menghilangkan/membunuh bakteri, jamur dan mikroorganisme lainnya dengan meggunakan senyawa desinfektan, germisida ataupun bakterisida. Ada desinfektan yang membunuh mikroorganisme (bakteri) dengan tidak merusaknya sama sekali, sedangkan zat-zat kimia seperti basa dan asam organik itu menyebabkan hancurnya bakteri. Kemungkinan hancurnya bakteri tersebut disebabkan oleh proses hidrolisis (Dwidjeseputro,1978).

Pada dasarnya pengerjaan kultur jaringan dikerjakan di Laminar Air Flow Cabinet. Laminar Air Flow Cabinet biasanya disterilisasi permukaan dengan alkohol 70% (v/v). Meskipun alkohol bersifat asam (70% v/v, pH 2,0) mungkin lebih efektif sebagai desinfektan, tetapi jarang digunakan karena memiliki efek korosif pada permukaan logam. Semua alat direndam pada larutan 70-80% (v/v) etanol dan diinsenerasi di atas lampu spiritus sebelum digunakan. Agar aman, sebaiknya wadah yang digunakan yang mengandung alkohol untuk pemanasan diletakkan pada suatu wadah dengan dasar yang berat. Hal ini untuk mencegah jatuhnya alkohol akibat tersenggol secara tidak sengaja yang dapat menyebabkan kebakaran dalam LaminarAir Flow Cabinet. Sebagai aturan umum, buanglah alkohol yang tersisa pada beaker glass setelah melakukan pengkulturan (Subarnas, 2011).

2.3.1. Desinfeksi udara

Sumber utama kontaminan adalah spora jamur dan bakteri yang terdapat di udara. Dapat diasumsikan bahwa agen kontaminasi ada dimana-mana, misalnya pakaian, jaringan tumbuhan, peralatan, bagian luar wadah kultur, permukaan tempat kerja dan lainnya. Udara steril di dalam Laminar Air Flow Cabinet memungkinkan kita untuk dengan mudah membuka wadah kultur dan bekerja secara steril. Peralatan yang dapat disterilisasi dengan mencelupkan alkohol 70%-80% yang diikuti dengan pembakaran dengan menggunakan bunsen. Bleaching juga dapat digunakan sebagai alternatif untuk mensterilisasikan peralatan dengan alkohol dan larutan klorin encer (0,1-0,25 % klorin) dapat digunakan. Peralatan juga harus

stainless karena bahan lain akan berkarat dan cepat jika rendam dalam larutan

bleaching(Subarnas, 2011).

Desinfeksi dengan gas formaldehid menggunakan chamber steam, yang menyediakan pemanasan dan area vakum memakan waktu kurang dari 8 jam. Desinfeksi formaldehid dengan oksidasi alkohol, seperti desinfeksi pada kayuwalaupun dengan aplikasi sederhana, tidak dapat direkomendasikan untuk desinfeksi yang lebih baik.Pada pengerjaannya terutama dengan alasan formaldehid tidak memiliki standart dan berbahaya mudah terbakar dengan api,bahkan harganya jauh lebih mahal (Scholz & Bergmann, 1984).

Formaldehid telah digunakan untuk pengujian proses dekontaminasi secara biologis. Namun formaldehid bisa menyebabkan polimerisasi.Formalin merupakan larutan yang bisa tersebar di udara dan menyebabkan terjadinya polimerisasi. Karena tekanan uap yang rendah, formaldehid bercampur di udara mencegah proses kondensasi dan polimerisasi. Depolimerisasi formaldehid dengan menggunakan sumber listrik untuk menyatukan proses penyebaran formaldehid di udara. Teknik ini membutuhkan keahlian khusus proses fumigasi yang dilakukan. Konsentrasi formalin yang baik dan direkomendasikan sebagai desinfektan yakni berkisar 4% - 5% (Brasswell et al., 1970).

14

Efisiensi pembersihan dan desinfeksi rumah kaca sangat diperlukan untuk meminimalisirkan perpindahan mikroorganisme yang mengkontaminasi kultur.Penyemprotan dengan desinfektan merupakan tindakan operasional yang benar.Penggunaan gas formaldehid dengan metode formalin-pottasium

merupakan teknik laboratorium yang aman dan mudah untuk mencegah terjadinya keledakan gas.Metode ini menggunakan campuran kristalpottasium permanganat

dengan formalin. Reaksi dari kedua senyawa ini bersifat vigorous dan suhu akan menurun. Temperatur ini bisa mencapai 1000C walaupun pada prakteknya sering turun beberapa derajat.Air dan formalin menguap tergantung rasio campuran yang digunakan (Connoly & Fletcher, 1981).

2.3.2. Desinfeksi (Sterilisasi) pada bahan eksplan

Menurut Zulkarnain (2009) mengatakan bahwa beberapa sumber kontaminasi mikroorganisme pada sistem kultur jaringan dapat dikemukakan sebagai berikut: a. Medium sebagai akibat proses sterilisasi yang tidak sempurna

b. Lingkungan kerja dan pelaksanaan penanaman yang kurang hati-hati dan kurang teliti

c. Eksplan (secara internal yang terbawa oleh eksplan di dalam jaringan dan secara eksternal yakni kontaminan yang berada di permukaan eksplan akibat prosedur sterilisasi yang kurang sempurna)

d. Dari serangga atau hewan kecil lainnya yang berhasil masuk kedalam botol kultur setelah diletakkan di dalam ruang kultur ataupu ruang stok

Omamor et al. (2007) melaporkan bahwa pada penelitian kulturEllais quinensiss Jacq. yang terkontaminasi berasal dari eksplan daun, kalus/embrio, dan planlet. Media kultur jaringan yang digunakan adalah media MS. Media tersebut diautoklaf pada suhu 1210C selama 15 menit pada tekanan 2 atm. Eksplan tersebut disterilisasi permukaannya dengan sodium hipoklorit selama 3 menit. Kemudian eksplan secara aseptis ditransfer ke media kultur, dilabel dan diinkubasi pada suhu 240C selama 2-3 minggu. Botol kultur jaringan yang terkontaminasi dipisahkan dan dipindahkan dari Tisssue Culture Unit of Nigerian Institute Oil Palm Research (NIFOR) dan diautoklaf kembali.Kontaminan yang telah diisolasi dari

eksplan, kalus/embrio dan planlet ditumbuhkan di media padat PDA dengan 0,05gr chlorampenicol/L dengan diinkubasi pada suhu 200C selama 2-3 hari. Mikroorganisme yang telah diisolasi (jamur) yang terdapat pada media solid PDA dan 0,1% media cair PDA pada suhu 200C. Beberapa isolat jamur yang telah diidentifikasi dilaboratorium dikirim ke Universitas Surrey untuk identifikasi lebih lanjut.

Menurut Subarnas (2011) ada dua cara yang dapat dilakukan untuk mengatasi dan mengurangi kontaminasi kultur yang berasal dari bahan tanaman itu sendiri antara lain:

a. Metode Fisik

- Mendedahkan tumbuhan induk dengan kondisi kekeringan selama 3-4 minggu sebelum memulai kultur jaringan

- Pada saat mulai kultur, tumbuhan dicuci bersih dan bagian yang tidak digunakan untuk kultur segera dibuang

- Bahan tanaman dicuci di bawah air mengalir selama 20 menit, sampai beberapa jam tergantung sumber bahan tanaman

b. Metode Kimia

Metode ini dapat dilakukan dengan larutan Sodium Hipoklorit (NaOCl). Karena kemurniannya, Hipoklorit memiliki aktivitas yang kecil pada pH 8,0 dan akan lebih efektif jika pH menjadi sekitar 6,0 dengan penambahan HCl. Untuk meningkatkan kesuksesan menggunakan klorin dapat digabungkan untuk mendapatkan eksplan yang steril yaitu:

- ditambahkan detergen ke larutan klorin, misalnya beberapa tetes Tween 20 atau Triton X-100

- diberikan sedikit tekanan pada perlakuan klorin dengan desikator vakum yang disambungkan ke air pompa

- digoyang-goyangkan (agitasi) larutan klorin secara manual atau dengan menggunakan shaker selama periode disinfestasi

16

Dari semua sumber kontaminasi yang paling sulit diatasi adalah yang berasal dari eksplan. Oleh karena itu, dalam memilih suatu metode sterilisasi harus selektif, kita hanya mengeliminasi jamur dan bakteri yang tidak diinginkan yang berasal dari bahan eksplan. Bahan-bahan sterilisasi yang dapat digunakan untuk sterilisasi bahan tanaman sudah banyak tersedia, larutan hipoklorit (natrium ataupun kalsium) telah terbukti efektif pada kebanyakan bahan tanaman. Misalnya perlakuan Na-hipoklorit 0,3-0,6% selama 15-30 menit, terbukti efektif untuk sterilisasi sebagian besar bahan tanaman. Perlu diingat, bahan sterilisasi pun bersifat meracuni jaringan. Oleh karena itu, tingkat konsentrasi dan lamanya perlakuan harus benar-benar diperhatikan untuk mengurangi resiko kematian jaringan. Perendaman bahan tanaman dalam etanol 70% selama 30 detik sebelum disterilisasi atau penambahan beberapa tetes surfaktan sepertitriton-R, Tween 20, atau Tween 80 dapat meningkatkan efektivitas bahan sterilisasi tersebut. Setelah perlakuan sterilisasi, bahan tanaman harus dibilas dengan air steril, 3 atau 4 kali untuk menghilangkan sisa-sisa bahan sterilisasi (Zulkarnain, 2009).

2.3.3. Penggunaan Antibiotik

Menurut Waksman, antibiotik adalah zat yang dihasilkan oleh mikroorganisme dan zat-zat tersebut ada dalam jumlah sedikit memiliki daya penghambat kegiatan mikroorganisme lain. Antibiotik yang pertama dikenal ialah Penisilin, dihasilkan oleh jamur Penicillium. Penisilin ini ditemukan oleh Flemming pada tahun 1929. Namun baru sejak 1943 antibiotik ini sangat banyak digunakan sebagai pembunuh bakteri. Genus Streptomyces menghasilkan antibiotik Streptomisin, Aureomisin, Kloromisetin, Tetramisin, Eritromisin, Megnamisin yang masing-masing memiliki fungsi berlainan. Antibiotik yang tidak dihasilkan oleh jamur, melainkan berasal dari golongan bakteri seperti Tirotrisin dihasilkan oleh Bacillus brevious, basitrasin oleh Bacillus subtilis dan Polimiksin yang dihasilkan oleh Bacillus polymixa (Dwidjeseputro, 1978).

Larutan klorin dapat membunuh mikroorganisme secara eksternal, namun tidak dapat membunuh mikroorganisme secara internal (endogen) dalam jaringan tumbuhan. Beberapa laboratorium menggunakan antibiotik untuk membunuh kontaminan endogen. Meskipun antibiotik rutin digunakan dalam kultur jaringan hewan, tetapi penggunaan antibiotik pada kultur jaringan tumbuhan kurang berhasil. Tidak ada antibiotik yang efektif untuk membunuh semua mikroorganisme yang mengkontaminasi. Antibiotik dan produk turunannya dimetabolisme oleh jaringan tumbuhan (Subarnas, 2011).Sama halnya dengan penelitian yang menggunakan antibiotik untuk melihat efektivitas dalam test antibiotik yakni carbenicilin, cefotaxime, neomycin, dan streptomisin. Antibiotik ini ditambahkan ke media multiplikasi yang mengandung 0,5 mg/L m-topolin. Stok larutan antibiotik dibuat setiap hari, disterilisasi kemudian difilter (penyaringan) dan ditambahkan kedalam media setelah proses autoklaf selesai(Wojtania et al., 2005).

Menurut Subarnas (2011) mengatakan bahaya penggunaan antibiotik yang ditambahkan kedalam media kultur jaringan antara lain:

a.Tumbuhan yang dihasilkan mungkin masih memiliki kontaminasi endogen b. Dengan penggunaan antibiotik spesifik, dapat menghasilkan mutan tertentu

yang tidak dapat dikontrol dengan antibiotik spesifik ini

c. Kontaminasi bakteri yang dapat menjadi masalah akhir produksi mikro, contoh sulit menghasilkan akar pada tunasyang terkontaminasi

d. Masalah kamuflase kultur jaringan bisa menjadi masalah utama di kemudian hari pada kultur (misalnya layu bakteri/spot)

e. Kontaminan yang awalnya bersifat non-patogenik menjadi patogenik karena adanya proses mutasi tersebut.

BAB 1 PENDAHULUAN

1.1.Latar Belakang

Penelitianrentan terkontaminasidi Laboratorium Kultur Jaringan Departemen Biologi FMIPA USU.Kontaminasi merupakan masalah besar yang sering dihadapi oleh mahasiswa dan dosen yang sedang melakukan penelitian. Hal ini diduga karena udara yang kurang aseptis. Penelitian kultur banyak terkontaminasi dengan mikroorganisme sehingga kultur yangditanam tidak tumbuh dengan baik. Kontaminasi dapat dihilangkan dengan proses sterilisasi yang baik pada bahan eksplan dan kondisi ruangan. Sterilisasi ruangan adalah salah satu penentu keberhasilan penelitian kultur. Salah satunya dengan cara fumigasi. Fumigasi dapat dilakukan dengan menggunakan berbagai senyawa kimia fumigan dengan dosis dan paparan waktu yang berbeda. Fumigasi dengan menggunakan formalin 4% diharapkan bisa meminimalisir jumlah mikroorganisme pengkontaminasi kultur di Laboratorium Kultur Jaringan Departemen Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sumatera Utara Medan.

Mikroorganisme(jamurdan bakteri) dapat mengkontaminasi kultur di laboratorium.Desinfeksi merupakan salahsatu cara menghilangkan kontaminan seperti virus, jamur dan bakteri.Tingkat kontaminasi lebih dominan disebabkan oleh jamur (70%) dibandingkan oleh bakteri (30%). Hal ini disebabkan media yang digunakan untuk proses pertumbuhan kultur memiliki pH 5,6-5,8 yang sangat optimum terhadap pertumbuhan jamur. Leifert & Cassels (2001) melaporkan beberapa mikroorganisme pengkontaminasi tersebut antara laingolongan bakteri Gram negatif misalnya Pseudomonasflourescens,

Erwiniasp., dan Agrobacterium spp. dangolongan bakteri Gram positif yakni

Bacillus spp. dan Staphylococcus spp.yang berasal dari tangan pekerja dan sterilisasi media yang tidak baik. Kontaminasi mikroorganisme tidak hanya berasal dari eksplan itu sendiri seperti Fusariumtetapibisa berasal dari manusia baik yang bersifat patogen maupun nonpatogen seperti Candida albicans,

Trichophyton spp., Eschericia coli dan Serratia marcescens(Leifert & Cassels, 2001).

Chen & Yeh (2007) melaporkan penelitian kultur Aglaonema juga rentan terkontaminasi.Mikroorganisme yang mengkontaminasi kulturAglaonema seperti

Xanthomonas campestris, Fusarium solani dan Erwinia carotovora ditemukan pada jaringan vaskular dan tunas aksilar. Kontaminasi kulturAglaonema

merupakan contoh masalah serius bagi tanaman hias lain yang ingin dikulturkan. Cara yang digunakan untuk menghilangkan kontaminasi pada kultur Aglaonema

dengan menggunakan antibiotik Streptomisin. Msogoya et al., (2012) melaporkan bahwa pada penelitian kultur Musa sp. juga terkontaminasi. Bakteri pengkontaminasi tersebut antara lain Proteus spp., Klebsiella spp., dan

Staphylococcus spp. sedangkan jamur yang mengkontaminasi kultur Musa sp. antara lain Aspergillus spp., Fusarium spp., Penicillium spp., dan Candida spp.

Leggat & Waites (1988) melaporkan beberapa mikroorganisme pengkontaminasi udara yang telah diisolasi dan dikarakterisasi berasal dari beberapa tanaman selama proses mikropopagasi yakni sebanyak 31, antara lain dari golongan yeast, Corynebacterium spp., Pseudomonas spp., dan

Staphylococcus spp. Mikroorganisme ini mampu menggunakan sejumlah sumber karbon dan resisten terhadap antibiotik seperti rifampicin, chlorampenicol, dan

neomysin.

Fumigasi merupakan salah satu cara pencegahan untuk menghilangkan mikroorganisme pengkontaminan pada kultur dengan menggunakan berbagai fumigan. Fumigasi dilakukan dengan cara menyemprotkan fumigan ke udara untuk beberapa waktu sesuai paparan dari bahan fumigan dengan konsentrasi tertentu dalam ruangan tertutup. Fumigasi dengan penyemprotan formalin menggunakan proses penguapan diudara dari larutan formalin.Secara ekonomis, formalin merupakan fumigan yang murah, mudah didapat dan mudah digunakan untuk fumigasi walaupun bersifat toksik. Fumigasi tidak hanya dilakukan dengan cairan formalin yang disemprotkan di dalam botol sprayer (skala kecil) tetapi bisa menggunakan tablet formalin dan dengan menggunakan alat penyemprotan pembasmi hama disemprotkan diluar gedung yang akan difumigasi (Dreyfus, 1983).

3

Kultur jaringan adalah suatu teknik untuk mengisolasi sel, protoplasma, jaringan dan organ kemudian menumbuhkan bagian tersebut pada media buatan yang mengandung kaya nutrisi dan zat pengatur tumbuh pada kondisi yang aseptis sehingga bagian-bagian tersebut dapat memperbanyak diri dan beregenerasi menjadi sel ataupun tumbuhan sempurna kembali. Proses sterilisasi eksplan merupakan kegiatan yang penting dalam kultur jaringan. Sterilisasi tidak hanya dilakukan pada bahan eksplan tetapi juga terhadap bahan dan peralatan, serta ruangan yang digunakan. Sterilisasi bertujuan untuk mengeliminasi mikroorganisme (bakteri dan jamur) yang mungkin terbawa pada saat pengambilan eksplan, yang dapat menimbulkan kontaminasi sehingga menghambat pertumbuhan eksplan.Banyak bahan desinfektan yang dapat digunakan untuk sterilisasi media dalam kultur jaringan yakni HgCl2, klor dan

formalin (Subarnas, 2011).

Dreyfus (1983) mengatakan bahwa fumigasi yang menggunakan formalin berdasarkan prinsip vaporisasi (penguapan) gas dari larutan cairan menggunakan panas eksternal.Larutan formalindimasukkan ke dalam sprayer atau alat penyemprot lain yang berukuran lebih besar disemprotkan ke udara dan dibiarkan beberapa hari sesuai waktu lama paparan bahan fumigan tersebut di dalam ruangan laboratorium secara tertutup. Keuntungan fumigasi formalin yakni mudah dioperasikan dan dikontrol penggunaannya.Munro et al., (1999) mengatakan bahwa proses dekontaminasi dengan sterilisasi panasjuga bisa dilakukan. Sterilisasi ruangan bisa dengan fumigasi dan menggunakan penyinaran dengan sinar UV seperti yang terdapat pada Laminar Air Flow Cabinet yang digunakan pada saat penanaman eksplan.Sterilisasi bahan dengan menggunakan autoklaf.Hoffmann & Spiner (1970) mengatakan bahwa efisiensi fumigasi tergantung data faktor fisik yang ada di laboratorium tersebut seperti kelembapan udara dan temperatur udara (Lampiran 4 hlm. 47).Formalin pada kelembapan relatif (RH) tinggi dapat mensterilisasi permukaan ruangan tetapi sulit mensterilisasi permukaan yang ditutupi dengan benda lain.

1.2. Permasalahan

Adanya kontaminasi yang terjadi pada penelitian kultur jaringan merupakan masalah yang cukup serius bagi mahasiswa maupun dosen yang melakukan penelitian. Hal ini disebabkan kondisi Laboratorium Kultur Jaringan yang kurang steril, pengerjaan selama penanaman bibit planlet tanaman ataupun kontaminasi yang berasal dari isolat tanaman yang digunakan.Oleh karena itu perlu dilakukan kajian sejauh mana keanekaragaman bakteri dan jamur pengkontaminasi yang ada di Laboratorium Kultur Jaringan serta sejauh mana efisiensi fumigasi dalam menekan jumlah bakteri dan jamur pengkontaminasi beberapa kultur jaringan di Laboratorium Kultur Jaringan Departemen Biologi FMIPA USU.

1.3.Tujuan

Tujuan dari penelitian ini antara lain:

a. Untuk mendapatkan keanekaragaman bakteri dan jamur pengkontaminasi kultur jaringan di Laboratorium Kultur Jaringan

b. Untuk mengetahui efisiensi fumigasi formalin 4%dalam mengurangi populasi bakteri dan jamur pengkontaminasi kultur jaringan di Laboratorium Kultur Jaringan

1.4. Hipotesis

a. Tingkat kontaminasi bakteri dan jamur di Laboratorium Kultur Jaringan tergolong tinggi dan beranekaragam

b. Fumigasi memiliki efisiensi tinggi dalam mengurangi populasi jamur dan bakteri pengkontaminasi plantlet tanaman di Laboratorium Kultur Jaringan

1.5. Manfaat

Manfaat dari penelitian ini ialah memberikan informasi mengenai keanekaragaman spesies bakteri dan jamur yang sering mengkontaminasi kultur tanaman dan sejauh mana pengaruh efisiensi dari fumigasi yang dilakukan untuk mengurangi jumlah mikroba pengkontaminasi di Laboratorium Kultur Jaringan Departemen Biologi FMIPA USU.

ISOLATION AND CHARACTERIZATION OF BACTERIA AND FUNGI WHICH CONTAMINATED PLANT TISSUE CULTURES AND THE TISSUE

CULTURE LABORATORY DEPARTMENT BIOLOGY FMIPA USU

ABSTRACT

A study on the diversity of bacteria and fungi which contaminated plant tissue cultures and the Plant Tisssue Culture Laboratory Department Biology FMIPA USU and the efficiency of fumigation used formalin 4% for 6 weeks to reduce the contaminants have been done. The results showed that the genus of bacteria and fungal contaminants which isolated from the air was as same as isolated from the plant tissue cultures contaminated.The bacterial contaminants were Bacillussp., Staphylococcussp., Escherichiasp., Streptococcussp. and Pseudomonassp.. The fungal contaminants were Aspergillussp., Fusariumsp., Mucorsp., Neurosporasp. and Penicilliumsp.. The fumigation in the room with spraying used formalin 4% could reduce 50% bacteria on the first day after fumigation and nearly 100% as same as the population bacteria before fumigation at the end of observation (the 5th day after fumigation). The results showed that fumigation should be done regularly in the Tissue Culture Laboratory Department Biology FMIPA US to prevent the contamination in the culture.

Keywords : Diversity of bacteria and fungi contaminants, tissue culture, efficiency of fumigation, formalin 4%

vi DAFTAR ISI

Halaman

Persetujuan i

Pernyataan ii

Penghargaan iii

Abstrak iv

Abstract v

Daftar Isi vi

Daftar Tabel viii

Daftar Gambar ix

Daftar Lampiran x

BAB 1. Pendahuluan

1.1. Latar Belakang 1

1.2. Perumusan Masalah 4 1.3. Tujuan Penelitian 4

1.4. Hipotesis 4

1.5. Manfaat Penelitian 4 BAB 2. Tinjauan Pustaka

2.1. Mikroorganisme Udara 5 2.1.1. Mikroorganisme Pengkontaminan Kultur 6 2.2. Faktor yang mempengaruhi Kultur Jaringan 9

2.2.1. Eksplan 9

2.2.2. Media 10

2.2.3. Zat Pengatur Tumbuh 11

2.3. Desinfeksi 12

2.3.1. Desinfeksi Udara 13 2.3.2. Desinfeksi (Sterilisasi) Bahan Eksplan 14 2.3.3. Penggunaan Antibiotik 16 BAB 3. Metode Penelitian

3.1. Waktu dan Tempat 18

3.2. Prosedur Penelitian 18 3.2.1. Isolasi Bakteri dan Jamur PengkontaminanUdara 18 3.2.2. Isolasi Bakteri dan Jamur PengkontaminanKultur 18 3.2.3. Karakterisasi Bakteri dengan Pewarnaan Gram 19 3.2.4. Karakterisasi Bakteri dengan Uji Biokimia Sederhana 19 3.2.5. Karakterisasi Jamur secara mikroskopis (Block Square) 20 3.2.6. Karakterisasi Jamur dengan Pewarnaan LPCB 21 3.2.7. Perhitungan mikroba dengan TPC setelah fumigasi 21

BAB 4. Hasil dan Pembahasan

4.1. Gambaran Umum Lokasi Pengampilan Sampel 22

4.2. Karakteristik Bakteri Hasil Isolasi Udara 22 4.3. Karakteristik BakteriHasil Isolasi Kontaminasi Kultur 27

4.4. Karakterisasi Jamur Hasil Isolasi Udara 29 4.5. KarakterisasiJamur Hasil Isolasi Kontaminasi Kultur 33 4.6. Hasil Perhitungan TPC Bakteri setelah fumigasi 36 BAB 5. Kesimpulan dan Saran

5.1. Kesimpulan 38

5.2. Saran 38

viii

DAFTAR TABEL

No. Tabel Judul Halaman

1. Karakteristik Morfologi Bakteri yang diisolasi dari udara di Laboratorium Kultur Jaringan FMIPA USU

23 2. Hasil Uji Biokimia Bakteri yang diisolasi dari udara

di Laboratorium Kultur Jaringan FMIPA USU

24 3. Karakteristik Morfologi Bakteri yang diisolasi dari

kultur di Laboratorium Kultur Jaringan FMIPA USU

27 4. Hasil Uji Biokimia Bakteri yang diisolasi dari kultur

di Laboratorium Kultur Jaringan FMIPA USU

27 5. Karakteristik Morfologi Jamur yang diisolasi dari

udara di Laboratorium Kultur Jaringan FMIPA USU

29 6. Karakteristik Morfologi Jamur yang diisolasi dari

kultur di Laboratorium Kultur Jaringan FMIPA USU

33

DAFTAR GAMBAR

No. Gambar Judul Halaman

x

DAFTAR LAMPIRAN

No. Lampiran Judul Halaman

1. Bagan Alir Penelitian 42 2. Denah Lokasi Pengambilan Sampel 45 3. Tabel Pertumbuhan Bakteri selama Fumigasi 46 4. Data Faktor Fisik Laboratorium Kultur Jaringan

FMIPA USU

47 5. Dokumentasi Penelitian 48 6. Flowchart Bergeys Manual 52